以细胞内连接为基础的定向基因重组技术.pdf

本发明涉及生物技术领域一种新的基因重组技术。在目的基因两侧分别引入2～12个碱基的序列特征不同的配对序列，配对序列和载体两个连接点末端的配对序列分别同源。利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失时产生的选择性核酸外切酶活性消化目的基因和载体，产生互补序列并互补配对。配对产物直接转入宿主细胞，通过宿主细胞内部的相关酶系进行连接。该技术具有周期短，费用低，操作简单，成功率高，对目的基因内部特征无要求等优点，适合实验室常规基因表达研究和大规模的基因表达操作。

权利要求书

以细胞内连接为基础的定向基因重组技术
技术领域
本发明是生物技术领域的一种定向基因重组技术。
背景技术
自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术已经建立了一套完善的体系，其中主要主要包括目的基因的分离，目的基因和表达载体的切割，目的基因与表达载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定向连接是传统重组技术的核心。
目的基因和载体的切割和连接是其中操作作为最为繁琐，工作周期最长，并且失败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等，但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。
目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的：
1、模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统等，FA斯图尔特等申请的专利技术——应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(中国专利申请号00812739.5)等。自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。自然重组技术需要载体末端和目的基因末端之间存在20～40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，从而使基因重组的操作成本提高了50～100倍。而且同源重组是一个动态的过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在普通实验室推广使用。
2、以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上建立的的USER Friendly系统等。常规的体内连接方式一般需要目的基因和载体之间具有9～12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，成本是传统技术的10～20倍；常规体内连接技术中互补配对载体必须具备一段很长的游离单链序列，在反复冻溶过程中很容易出现碱基脱落，影响连接效率，不适合长期储备或者工业化生产。
上述技术分别从不同的角度改良了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过高或者连接效率过低等因素的影响，上述技术并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。本发明对体内连接技术进行了改进，但是在特定载体构建过程中载体为原始载体或者平滑末端载体，重组载体容易保存，可经受反复冻溶，全过程在一个工作日内即可完成。
发明内容
本发明涉及生物技术领域一种新的定向基因重组操作技术，由重组载体，目的基因、定向配对复合物和宿主细胞构成；重组载体和目的基因两端含有2～12bp的同源序列，利用T4DNA聚合酶在特定底物缺失时产生的选择性核酸外切酶活性消化目的基因和载体，产生互补序列并互补配对。配对产物直接转入宿主细胞，通过宿主细胞内部的相关酶系进行连接。该技术对基因内部序列没有要求。
实施方式
1、制备定向重组载体
1)重组载体可以选用但不限于质粒、噬菌体或者病毒载体
2)在重组载体重组载体中引入两个定向同源序列；定向同源序列由任意两种或者三种碱基构成的碱基序列构成，优选但不限于由G、C或者G、C加上另外一种碱基构成定向同源序列，长度2到12bp，优选4到8bp；两个定向同源序列之间含有限制性内切酶酶切位；酶切位点两侧序列不同而且不能互补，定向同源序列总长度可选择但不限于2～12bp。
3)对载体中引入的酶切位点进行酶切处理
4)对载体进行或者不脱末端修饰处理，修饰方式优选但不限于末端脱磷酸化修饰。
2、制备目的基因
1)合成分别具有载体上下游定向同源序列同源部分的上下游扩增引物。
2)目的基因的扩增，按照常规方法扩增目的基因，优选但不限于Pfu DNA聚合酶。
3)目的基因鉴定，通过常规琼脂糖电泳鉴定。
4)目的基因提纯，去除PCR体系中残余的dNTP和引物。
3、定向匹配
定向匹配体系由T4DNA聚合酶，dNTP，和反应缓冲液组成的定向匹配复合物。
方案一
1)将由重组载体和目的基因按照数量比为6∶1～1∶6的比例混合，推荐但不限于按照1∶3的的比例混合。
2)加入适当的T4DNA聚合酶，同源序列中不含有相关碱基的一种或者两种dNTP，以及反应缓冲液，按照工具盒操作说明进行处理。
3)目的基因和重组载体高温变性一段时间，推荐但不限于按照T4DNA聚合酶灭活的方式变性处理。
4)目的基因和重组载体低温复性一段时间，复性温度10到40摄氏度，推荐但不限于室温，复兴时间10分钟到1小时，优选但不限于优选20到30分钟。
方案二
1)将重组载体和目的基因分别加入适当的T4DNA聚合酶，并分别加入同源序列中不含有相关碱基的一种dNTP，在适当的条件下反应一段时间。
2)经过上述步骤处理后的目的基因和重组载体按照数量比为6∶1～1∶6，推荐按照3∶1的的比例混合。
3)变性和复性方式同方案一
4、转化宿主细胞。
细胞转化方式可以采用但不限于电转化或者化学转化方式。
电转化方式如下：前期常规电击操作，电击完成后迅速加入复苏培养基，10～37摄氏度复苏10～12分钟感受态细胞，优选室温复苏45分钟，常规方式筛选。
化学转化方式：重组载体与感受态细胞混合，冰浴5～60分钟，优选30分钟，迅速加入复苏培养基10～37摄氏度复苏10～12分钟感受态细胞，优选室温复苏45分钟，常规方式克隆化筛选。
本发明是在原有重组技术基础上进行的操作方法改进，使用者一般无须改变原有的操作习惯，容易适应。操作步骤简单，线性片段和定向重组酶系可商品化生产，用户通过基因扩增后一般可直接进行定向连接，无须其他操作。操作周期短，包含PCR过程在内，一般在一个工作日内可完成全部操作。
实施实例
下面我们将以几丁质酶基因作为目的基因，定向克隆进入pUC18载体为例对技术进行具体说明，实例内容并不构成对本发明要求权利的限制。实验过程中选用的工具酶和试剂盒具体操作步骤参见个公司相关说明。
已知一种几丁质酶的基因序列为：ATGCGCAAATTTAATAAA......AGCGCCGGCGTTCAATAA1线性载体的制备
首先在pUC18质粒DNA的用BamH I和Hind III酶切位点之间引入下列序列：
引入序列：TGCGCGGG，下划线部分为限制性内切酶HaeIII的酶切位点
引入后状态：GGATCC-TGCGCGGG-AAGCTT
其中字体加粗部分为限制性内切酶酶切位点。
质粒克隆扩增后回收，利用HaeIII酶切线性化处理
处理后状态5’-GGATCC-T-AAGCTT-3’
下划线部分为同源酶切位点
1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收线性载体片段
CIAP磷酸酶37摄氏度10分钟去磷酸化处理
2目的基因克隆
引物设计上游5’-A T G C G C A A A T T T A A T A-3’
        下游5’-T T A T T G A A C G C C G G-3’
*下划线部分为同源选择位点
基因扩增选用Takara PyroBest DNA聚合酶按照试剂盒推荐方式扩增.
琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收目的基因
3定向匹配
取3微升线性载体片段(0.1微克/微升)，加入3微升PCR产物(0.3微克/微升)混合均匀，加入由适量T4 DNA聚合酶、dTTP和反应缓冲液构成的处理体系，无菌去离子水补足到20微升，37摄氏度保温30分钟.
4转化宿主细胞
匹配产物与适量感受态细胞混合，冰浴30分钟，加入LB培养基，室温复苏45分钟，涂布筛选平板进行克隆化筛选。