以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒.pdf

本发明涉及生物领域一种基因重组技术，旨在提供一种成本低，技术简单，操作周期短的定向基因重组试剂盒。试剂盒由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定用引物构成中一种或者若干种构成。在传统的非定向基因重组技术基础上，定向重组载体和错误连接的目的基因之间形成的筛选用酶切位点。利用限制性核酸内切酶对错误连接形成的筛选用酶切位点进行处理，使反向连接的目的基因难以进入细胞克隆扩增。之后利用鉴定引物和原扩增引物的组合对重组产物进行PCR鉴定确认目的基因连入载体并连接正确。本发明适用于常规基因表达尤其是大规模的基因表达操作。

1、  本发明涉及生物技术领域中一种以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒，由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定引物中一种或者若干种构成；其特征在于，目的基因经过定向扩增以后和定向重组载体非定向连接，由限制性内切酶对错误连接产物在连接点处形成的酶切位点进行切割，使其难以进入宿主细胞或者进入细胞后难以复制，而正确连接的产物则不受其影响；最后通过鉴定引物和原扩增用引物联合对目的基因连接的状态进行鉴定。

2、  根据权利要求1所述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向重组载体末端含有两个可以与目的基因连接的连接点A和B，连接点A和连接点B的碱基序列不同，优选但不限于单碱基G和单碱基C的组合，既连接点A的5’末端为G，连接点B的5’末端为C；或者连接点A的5’末端为C，连接点B的5’末端为G。

3、  根据权力要求1所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向扩增体系由扩增体系、定向引物和模板构成；扩增体系是产物为平滑末端的耐热DNA聚合酶，dNTP，反应缓冲液混合组成的即用型混合物，用时加入定向引物和模板；定向引物由上游引物和下游引物构成，试剂盒提供合成方案；利用定向引物扩增完成后，目的基因两端为与相应载体连接所用的连接点a和b其中连接点a和连接点b中有一个或者两个全部含有不完整的限制性内切酶酶切位点。

4、  根据权力要求1所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是：权力要求2或权力要求3中所描述的定向目的基因和定向重组载体，其正确连接方式为载体连接点A和目的基因连接点a连接，载体连接点B和目的基因连接点b连接；错误连接方式为A和b连接，B和a连接；其中错误连接方式中形成的两个连接位点中一个或者两个全部形成完整的筛选用限制性内切酶酶切位点，优选但不限于一个筛选用酶切位点正确连接方式中连接点不形成限制性内切酶酶切位点，或者形成与错误连接时形成的筛选用酶切位点不同的限制性内切酶酶切位点。

5、  根据权利要求1所述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向连接复合物由DNA连接酶和限制性核酸内切酶联合构成，其中连接酶或者限制性内切酶或者两者全部可以由用户自备定向连接复合物可以是上述两类工具酶的混合物，也可以是两类工具酶先后单独作用最后形成功能上的组合；其中限制性内切酶能够特异性识别权利要求(4)中所述的错误连接时形成的完整的筛选用限制性内切酶酶切位点，并对其进行切割，但对目的基因本身以及正向连接产物中形成的连接点和连接点附近的序列不能识别或者不能切割。

6、  根据权力要求1所描述的基因重组试剂盒，其特征是：鉴定引物中上游引物和下游引物分别是目的基因和互补链5’一侧载体的同源序列；对重组产物进行PCR鉴定时，选用鉴定用上游引物和目的基因扩增用下游引物组合对重组产物进行扩增，或者选用鉴定用下游引物和目的基因扩增用上游引物组合对重组产物进行扩增；上述鉴定方法可用于确定载体中是否含有目的基因，以及目的基因的连接方式是否正确。

以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒
技术领域
本发明是生物技术领域的一种新型定向基因重组试剂盒。目的基因首先以非定向方式与相应重组载体连接，之后对错误连接形成的特定选择位点进行连接后处理，使错误连接的目的基因难以进入宿主细胞或者进入宿主细胞后难以复制，重组产物可通过PCR对产物是否连入载体，连接方向是否正确进行鉴定。本方法可用于实验室小规模的普通科学研究，更适合于批量蛋白质的生产或筛选，尤其在生物信息学研究中具有很高的应用价值。
背景技术
自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术已经形成了一套完善的体系，其中主要包括目的基因的分离，目的基因和重组载体的限制性切割，目的基因与重组载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定向连接是传统重组技术的核心。
目的基因和载体的切割和连接是基因重组过程中操作最为繁琐，工作周期最长，并且失败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等，但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。
目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的：
1、模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统，F.A.斯图尔特等的专利技术——应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(专利申请号00812739.5)等。自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。但是，自然重组技术需要载体末端和目的基因末端之间存在20～40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，极大的提高了基因重组的操作成本。而且同源重组是一个动态的双向过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在国内普通实验室常规使用。
2、以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上建立的的USER Friendly系统等，以及马立新等申请的尚未明确连接方式的两项专利技术——一种零背景高通量定向表达克隆的方法(专利申请号01133158.1)和一种高通量直接定向克隆构建重组腺病毒的方法(专利申请号200410060972.6)等。体内连接一般需要目的基因和载体之间具有4～12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，工作成本较高；后者利用了一种常规的工具酶，对引物序列的要求相对较低，不过该发明专利尚未声明采用体内连接技术。上述体内重组技术要求载体必须具备一段游离单链序列，在反复冻溶过程中冻溶过程中这些游离序列很容易出现碱基脱落，影响连接效率，不适合长期应用，难以工业化生产。
上述技术分别从不同的角度发展了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过高或者连接效率过低等因素的影响，并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。
以往在目的基因的克隆扩增阶段，对目的基因进入载体的方向没有特定的要求，可以通过非定向重组的方式连入载体。比如以Taq酶为基础的扩增产物可以直接连接进入TA克隆载体，目前很对生物公司也推出了相关的重组试剂盒。另外用其他耐热DNA聚合酶扩增得到的平滑末端扩增产物，同样可以直接连接到平末端载体中，不需要互补序列。随着连接技术的进步，TA克隆和平末端连接克服了连接困难的问题，NEB和Takara等生物公司推出的连接试剂盒在5～10分钟即可完成操作，目前上述技术已经在大部分实验室应用。
本发明在传统非定向重组的基础上引入连接后筛选过程，通过限制性内切酶对反向连接产物形成的特异性选择位点进行加工，使反向连接的重组产物丧失进入宿主细胞或者进入细胞后难以克隆扩增的能力，从而达到定向连接的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的定向基因重组技术，使人们在不改变既往工作习惯的基础上，能够给通过简单的方式完成基因重组操作，并降低工作成本，缩短工作周期，提高基因重组的工作效率。
本发明的实现过程如下：主要是构建一个定向克隆载体和定向目的基因。其中定向重组克隆载体经过处理后形成可供PCR产物连接所用的平滑末端载体。定向目的基因扩增完成后形成两个含有不同基因序列的连接点，目的基因和重组载体连接后，在反向连接的连接点处形成筛选用限制性内切酶酶切位点，而正向连接的产物不能形成相同的的酶切位点。连接完成后，利用相应的限制性内切酶进行切割，错误连接的载体难以进入细胞或者进入细胞后难以进行克隆扩增；而正确连接的载体不会被切割从而进行正常克隆扩增。之后产物可通过与载体同源的鉴定引物和原目的基因同源的扩增引物组合，对重组产物进行PCR鉴定，从而得到正确的定向克隆。
具体实施方式
1、定向重组载体
定向重组载体可以但不限于来自质粒、粘粒、噬菌体或者病毒载体。载体处理完成后形成的两个连接点末端存在一个或者多个碱基序列不同，首选5’末端一个但不限于一个碱基序列不同。制备方式如下：
1、以两种但不限于两种限制性内切酶对载体进行切割制作连接位点，限制性内切酶可以选用平滑末端限制性内切酶或者黏性末端限制性内切酶，优选选但不限于平滑末端限制性内切酶，优选但不限于处理后连接点5’末端分别为G和C的限制性内切酶。载体酶切产生的上下游两个末端分别标记为连接点A和连接点B。
2)对黏性末端载体进行处理，去除或者补平连接位点末端的单链结构，首选但不限于去除的处理方式。
3)对载体进行或者不进行末端修饰，首选但不限于脱磷酸化处理
2、定向扩增体系的构建
定向扩增体系由耐热DNA聚合酶，dNTP，反应缓冲液和无菌去离子水混合构成即用型扩增体系，冷冻保存，保存时首选但不限于采用速冻的方式；用时加入浓度为50到100倍终浓度的模板和定向扩增引物进行PCR扩增构成定向扩增体系。耐热DNA聚合酶选择扩增产物为平滑末端的耐热DNA聚合酶，首选但不限于pfuDNA聚合酶。定向扩增引物中一个或者两个全部含有不完整的酶切位点所对应的序列；利用该引物获得的目的基因，上下游两个末端分别标记为连接点a和连接点b。目的基因和相应载体连接时，A和a连接，B和b连接为正确连接；A和b连接，B和a连接为错误连接。连接点a和连接点b中有一个或者两个全部含有不完整的酶切位点，与上述定向重组载体错误连接时，A-b连接点或者B-a连接点中有一个或者两个全部形成完整的筛选用酶切位点，能够被相应限制性内切酶所切割；正确连接时A-a连接点和B-b连接点两个都不形成相应的筛选用酶切位点；目的基因本身也不含有相应的酶切位点。
3、定向连接复合物的构建
定向连接复合物由DNA连接酶和限制性内切酶构成，DNA连接酶首选但不限于T4DNA连接酶，限制性内切酶首选但不限于酶切产物为平滑末端的限制性内切酶。
第一种方式
连接反应和切割反应依次独立进行。定向连接复合物由DNA连接酶，限制性内切酶独立组合构成，二者可分别按照工具酶说明书最适反应缓冲液，也可以按照工具酶说明书采用共用反应缓冲液，首选但不限于分别使用最适反应缓冲液。限制性内切酶可以是一种也可以是多种，首选但不限于采用一种限制性内切酶。
第二种方式
连接反应和切割反应同时进行，定向连接复合物由DNA连接酶，限制性内切酶以及工具酶说明书推荐的共用反应缓冲液混合构成。限制性内切酶可以是一种也可以是多种，首选但不限于两种限制性内切酶。反应可以首先以连接最适温度完成连接反应，然后在酶切最适温度完成切割筛选；也可以在同一温度下进行，优选但不限于在变温方式下进行。
4、转化和鉴定
上述连接产物常规方法转入宿主细胞进行筛选。
鉴定方法可选用对菌落、菌液或者质粒进行PCR鉴定，或者利用目的基因中原有或者在引物中引入的限制性酶切位点以及载体原有的酶切位点进行常规酶切鉴定。PCR鉴定用引物选择试剂盒中提供的鉴定用上游引物和目的基因下游引物组合进行扩增；或者选用鉴定用下游引物和目的基因下游引物组合进行扩增。
本发明是在原有重组技术基础上进行的操作方法改进，使用者无须改变原有的操作习惯，容易适应。操作步骤简单，试剂可商品化生产，用户通过基因扩增后一般可直接进行定向连接。操作周期短，包含基因扩增和转化筛选过程在内，一般在一个工作日内可完成全部操作。该技术所使用的工具酶为常用工具酶，市场售价较低，而且体系所需要的引物要比常规引物短1/4到1/3，实验综合成本可降低50％～60％。
应用实例
下面以一种目的基因，定向克隆进入pUC18载体为例对技术进行具体说明.实验过程中选用的工具酶和核酸提取试剂盒试剂盒分别为大连宝生物公司产品，具体操作步骤参见相关公司的产品说明.用户也可以选择其他公司产品代替.
pUC18的多克隆位点如下：5’-GGATCC TCTAGA……GCAGGCATGC AAGCTT-3’
一种目的基因序列为：ATGCGCAAATTTAATAAA......AGCGCCGGCGTTCAATAA
＊目的基因中不含有EcoRV酶切位点。
应用实例1
1定向重组载体的制备
反应体系中加入1微克pUC18质粒DNA，用BamH I(识别序列为GGATCC，切割后5’端参与4个游离碱基)和Hind III(识别序列为AAGCTT，酶切后5’端残留4个碱基)按照工具酶操作说明进行双酶切
1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收线性载体片段
利用Klenow酶按照工具酶操作说明补平单链片段
利用CIAP磷酸酶按照操作说明对载体进行去磷酸化处理
处理后，载体上游5’末端为T，下游5’末端为G。
2定向目的基因的克隆
引物设计上游ATGCGCAAATTTAATA
下游ATATC-TTTATTGAACGCCGG
＊下游引物中加粗字体部分为EcoR V(识别序列为GATATC)的不完整酶切位点，和载体上游连接点连接后形成形成完整的EcoR V酶切位点。
基因扩增选用Takara pyrobest DNA聚合酶按照试剂盒推荐方式扩增.
琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收目的基因
3定向连接
取3微升线性载体片段，加入3微升PCR产物混合均匀，前者和后者的数量比约为1∶3。加入由T4DNA连接酶，按照试剂盒操作说明进行连接。连接完成后反应产物加入EcoR V组成的酶切体系，按照试剂盒操作说明进行限制性切割。处理完毕低温保存备用。
4转化
常规方法制备大肠杆菌Top10感受态细胞，常规方法转化后移入筛选平板进行筛选，对菌落或者质粒，利用PCR进行基因鉴定。鉴定时上游引物选用pUC测序用正向测序引物，下游引物选用目的基因扩增所采用的下游引物。
应用实例2
载体，目的基因的制备和其他操作方式同具体实施方式1，步骤3的操作方式如下：
取3微升线性载体片段，加入3微升PCR产物混合均匀，前者和后者的数量比约为1∶3。加入由T4DNA连接酶，EcoR V限制性内切酶混合，首先在连接最适温度下进行连接反应，然后在酶切最适温度下进行酶切反应。处理完毕低温保存备用。