细胞扩增方法和藉此产生的细胞和条件培养基用于治疗的用途.pdf

本发明提供细胞扩增方法。所述方法包括在支持细胞扩增的三维培养条件下培养来自胎盘和脂肪组织的粘附细胞。

1.  细胞扩增方法，所述方法包括在支持细胞扩增的三维培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。

2.  产生条件培养基的方法，所述方法包括
(a)在允许细胞扩增的三维培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞；和
(b)收集所述扩增的粘附细胞的条件培养基，藉此产生条件培养基。

3.  权利要求1的方法产生的细胞群。

4.  分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞分泌比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞分泌的更高水平的选自SCF、IL-6和Flt-3的至少一种因子。

5.  分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达的更高水平的选自H2A组蛋白家族(H2AF)、醛脱氢酶X(ALDH X)、真核细胞翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙结合蛋白3、EF-手形钙结合结构域(RCN2)和钙调理蛋白1碱性平滑肌(CNN1)的至少一种蛋白质。

6.  分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达的更低表达水平的选自核内不均一核糖核蛋白H1(Hnrph1)、CD44抗原同种型2前体、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同种型a(Papss2)和核糖体蛋白L7a(rpL7a)的至少一种蛋白质。

7.  分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞特征为比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞更高的免疫抑制活性。

8.  权利要求7的分离的细胞群，其中所述免疫抑制活性包含降低T细胞增殖。

9.  药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1产生的细胞群。

10.  药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求2产生的条件培养基。

11.  药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求4、5、6或7的分离的细胞群。

12.  治疗需要治疗的对象中可受益于基质细胞移植的病症的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的选自胎盘和脂肪组织的组织的粘附细胞，藉此治疗所述对象的所述可受益于干细胞移植的病症。

13.  治疗需要治疗的对象中可受益于基质细胞移植的病症的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的源自选自胎盘和脂肪组织的组织的粘附细胞的条件培养基，藉此治疗所述对象的所述可受益于干细胞移植的病症。

14.  降低有此需要的对象中免疫应答的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的权利要求3、4、5、6或7的分离的细胞群，以便降低所述对象的免疫应答。

15.  权利要求14的方法，其中用细胞疗法治疗所述对象。

16.  权利要求12或13的方法，其进一步包括给予干细胞。

17.  权利要求16的方法，其中所述干细胞包含造血干细胞。

18.  权利要求16的方法，其中所述干细胞与所述条件培养基或粘附细胞同时给予。

19.  权利要求16的方法，其中所述干细胞在给予所述条件培养基或粘附细胞之后给予。

20.  权利要求12或13的方法，其中所述粘附细胞得自三维培养。

21.  权利要求12或13的方法，其中所述粘附细胞得自二维培养。

22.  权利要求12或13的方法，其中所述病症选自干细胞缺乏症、心脏病、帕金森氏病、癌症、阿尔茨海默氏病、中风、烧伤、组织损伤、失血、贫血症、自身免疫病、糖尿病、关节炎、多发性硬化症、移植物抗宿主病(GvHD)、神经退行性疾病、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎、系统性硬化症、Sjorgen综合征、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、格-巴综合征(GBS)、桥本甲状腺炎(HT)、格雷夫斯病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和炎症性肠病。

23.  权利要求1、2、3或20的方法或细胞群，其中所述三维培养包含3D生物反应器。

24.  权利要求23的方法，其中所述生物反应器选自推流式生物反应器、连续搅拌槽生物反应器和固定床生物反应器。

25.  权利要求1、2、3或20的方法或细胞群，其中所述细胞的所述培养在连续流动培养基下实现。

26.  权利要求1、2、3或20的方法或细胞群，其中所述三维培养包含选自聚酯、聚链烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、matrigel、细胞外基质组分、胶原、聚L乳酸和惰性金属纤维的粘附材料。

27.  权利要求1、2、3或20的方法或细胞群，其中所述培养至少进行3天。

28.  权利要求21的方法或细胞群，其中所述培养至少进行3天。

29.  权利要求1、2、3或20的方法或细胞群，其中进行所述培养直到所述粘附细胞达到至少60％汇合。

30.  权利要求12或13的方法，其中所述病症可受益于对造血干细胞移入的促进。

31.  权利要求1、2、3、4、5、6、7或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞包含选自CD73、CD90、CD29和CD105的阳性标记表达系列。

32.  权利要求1、2、3、4、5、6、7或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞包含选自CD45、CD80、HLA-DR、Cd11b、CD14、CD19、CD34和CD79的阴性标记表达系列。

33.  权利要求1、2、3或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞分泌比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更高水平的选自SCF、Flt-3和IL-6的至少一种因子。

34.  权利要求1、2、3或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更高水平的选自H2A组蛋白家族(H2AF)、醛脱氢酶X(ALDH X)、真核细胞翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙结合蛋白3、EF-手形钙结合结构域(RCN2)和钙调理蛋白1碱性平滑肌(CNN1)的至少一种蛋白质。

35.  权利要求1、2、3或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更低表达水平的选自核内不均一核糖核蛋白H1(Hnrph1)、CD44抗原同种型2前体、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同种型a(Papss2)和核糖体蛋白L7a(rpL7a)的至少一种蛋白质。

36.  权利要求1、2、3或20的方法、细胞群或培养基，其中所述粘附细胞或培养基特征为比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞更高的免疫抑制活性。

37.  权利要求36的分离的细胞群，其中所述免疫抑制活性包含降低T细胞增殖。

38.  权利要求1、2、3、4、5、6、7、12或13的方法或细胞群，其中所述细胞包含具基质干细胞表型的细胞。

39.  权利要求38的方法，其中所述基质干细胞表型包含T细胞抑制活性。

40.  权利要求38的方法，其中所述基质干细胞表型包含造血干细胞支持活性。

41.  权利要求3、4、5、6或7中的细胞群在制备用于鉴定移植的药物中的用途。

细胞扩增方法和藉此产生的细胞和条件培养基用于治疗的用途
发明领域和发明背景
本发明涉及细胞扩增方法、藉此产生的细胞群及其用途。具体地本发明涉及扩增来自胎盘或脂肪组织(贯穿于整个PCT中)的粘附细胞(adherent cell)的方法及其例如用于造血干细胞移植的治疗用途。
在日益发展的医学界，为了细胞移入和组织工程目的越来越需要大量成人干细胞。另外，成人干细胞疗法正持续不断地开发用于治疗和治愈各种病症，例如造血功能障碍、心脏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、烧伤、肌肉萎缩症、自身免疫病、糖尿病和关节炎。
造血干细胞(HSC)是祖细胞，其产生髓系和淋巴系的所有血细胞类型。移植的HSC的移入和启动造血作用取决于HSC在受者骨髓中的归巢和增生的能力。
普遍公认干细胞在体内与骨髓中离散的龛(niche)有密切的联系，所述龛提供了经由细胞间接触或短距离作用共同介导干细胞分化和自我更新的分子信号。这些龛是“造血诱导性微环境”(HIM)的部分，由骨髓细胞即巨噬细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞组成。骨髓细胞通过提供促进细胞间接触的细胞外基质(ECM)蛋白和基底膜组分来保持HIM功能完整性。它们还提供用于控制造血细胞分化和增殖所需的各种可溶性或常驻性细胞因子。
需要HSC和基质之间的相互作用以保护HSC生存力并防止其分化。在HSC移植后，移植的HSC在其增殖和分化之前必须归巢到骨髓(BM)微环境并驻留在合适龛中。在归巢过程中，移植的HSC离开血流，并通过随趋化因子梯度穿过BM内皮细胞屏障到达专用龛来转移。然后供者HSC必须归巢到造血龛，在那里它们遇到对其分裂更有利的微环境，在那里HSC与间充质细胞、ECM和分泌的生长因子之间可建立连续统一的物理和化学接触。所有这些过程涉及一系列复杂的分子，例如细胞因子、趋化因子、激素、类固醇、细胞外基质蛋白、生长因子、细胞间相互作用蛋白、黏附蛋白和基质蛋白。
移入到BM专用龛的细胞总数构成HSC移植成功的基础。为了完成移入，移植到血液循环的供者HSC应该归巢到其产生功能性血细胞生成集落(hematopoiesis foci)的受者骨髓中。这些灶的数目可从输注的HSC总数乘以其移入效率的积来推算。
HSC移植涉及的主要问题之一是这些细胞在接受者系统中存活率低。充分证明的是，静脉内移植的HSC被从循环中清除并在其灌输后数分钟内在BM中显现。HSC移植后3-5小时，在受者的外周血中检测不到供者细胞[Askenasy等2002，移植的造血细胞在体内丛生于受者骨髓中(Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipientbone marrow in vivo).Stem Cells.20：301-10]。灌输后不久大量的移植细胞被破坏。因此，受者骨髓建群有效性低，移植后2-3天在受者BM中检测到的所输注细胞仅为1-5％[Kerre等2001，CD34+38+和CD34+38-两种细胞特异性归巢到NOD/LtSZ scid/scid小鼠骨髓但显示不同的扩增动力学(Both CD34+38+and CD34+38- cells homespecifically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but showdifferent kinetics in expansion).J Immunol.167：3692-8；Jetmore等2002，移植到条件化NOD/SCID受者中的静止和循环的人CD34(+)细胞的归巢效率、细胞周期动力学和存活率(Homing efficiency，cell cyclekinetics，and survival of quiescent and cycling human CD34(+) cellstransplanted into conditioned NOD/SCID recipients).Blood.99：1585-93]。
间充质基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell)(MSC)为异质细胞群，能够分化为不同类型的成熟间充质细胞。这些细胞受到各种生物活性因子影响而分化为网状内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和骨祖细胞(osteogenic precursor cell)。
MSC支持HSC移入的用途已为本领域所知。若干出版物已经证明当与间充质干细胞共同移植时，HSC的移入效率更高[Gurevitch等1999，在供体基质微环境中同种异体或异种骨髓移植(Transplantationof allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor stromalmicroenvironment).Transplantation.68：1362-8；Fan等2001，通过经门静脉注射骨髓细胞成功实施同种异体骨髓移植(BMT)：基质细胞作为促进BMT的细胞(Successful allogeneic bone marrow transplantation(BMT)by injection of bone marrow cells via portal vein：stromal cellsasBMT-facilitating cells).Stem Cells.19：144-50]。还证明了在人羊移入模型中共同移植人间充质干细胞导致促进人HSC嵌合BM在动物中的长期移入[Almeida-Porada等2000，将人基质细胞祖先共同移植到免疫前的胎羊中导致在循环中早期出现人供者细胞并在移植后的稍后时间点提高骨髓中的细胞水平(Co-transplantation of human stromal cellprogenitors into preimmune fetal sheep results in early appearance ofhuman donor cells in the circulation and boosts cell levels in bone marrowat later time points after transplantation).Blood.95：3620-7]。发现同时注射HSC和间充质干细胞加速血细胞生成[Zhang等2004，Stem Cells.22：1256-62]。最近，这些发现扩展到更近缘的动物模型-猕猴。当共同移植单倍体同一性(haploidentical)的HSC和间充质干细胞时，证明是促进了HSC移入[Liu等2005，Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.26：385-8]。最近还报道了使用间充质干细胞来促进HSC移入人类对象[KocON，J Clin Oncol.2000；18：307-316：Lazarus HM，Biol Blood MarrowTransplant.2005 May；11(5)：389-98]。
显然，MSC对造血移入的贡献在于：产生帮助介导并平衡所移植HSC的归巢、自我更新和定向潜能的HSC支持性细胞因子；复原受损的HSC归巢和增殖所需造血微环境；以及抑制源自供者的T细胞(可引起移植物抗宿主病(GvHD))，[Charbord P.和Moore，K.，Ann.N.Y.Acad.Sci.1044：159-167(2005)；美国专利第6,010,696号；第6555374号]。例如，在Maitra的研究中[Maitra B等，Bone Marrow Transplant.33(6)：597-604.(2004)]发现在NOD-SCID小鼠模型中，人间充质干细胞支持非亲缘供者造血干细胞和受抑制的T细胞激活，表明非亲缘源自人骨髓的MSC可改进同种异体移植结果。
使用MSC的一个主要障碍是难以分离大量的这些正常存在的细胞群，其从技术上来说是困难的且耗费大，部分是由于细胞数量有限。MSC最明显的来源是骨髓，但涉及获得骨髓吸出物和活检风险的显著不便之处成为这些方法的缺点。人胚胎和胎儿形成独立生命这一普遍持有观点使得人胚胎作为干细胞来源有了疑问，在已经存在的逻辑困难之上又增加了宗教和伦理方面的问题。
近来已在尝试从备选来源中发现可收获的干细胞。这样的备选来源有例如：脂肪组织、毛囊、睾丸、人嗅粘膜、胚胎卵黄囊、胎盘、青少年皮肤和血液(例如脐带血甚至月经血)。然而，从备选来源收获足够量的干细胞用于治疗和研究目的仍受限制且通常是费事的，其涉及例如从供者对象或患者收获细胞或组织、体外培养和/或繁殖细胞、解剖(dissection)等等。
胎盘被认为是干细胞最有可能的来源之一，不涉及任何不便之处或伦理约束。发现源自胎盘的MSC具有与源自BM的MSC相似的特性。它们能粘附塑料，表达CD105、CD73和CD90膜标记，且缺乏CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR表面分子的表达。然而，不象源自BM的MSC，经干扰素-γ处理的源自胎盘的MSC(placentaderived-MSC，PD-MSC)极低限度地上调HLA-DR。此外，PD-MSC细胞在干扰素-γ存在下显示出提高的免疫抑制特性。(Chang CJ，Yen ML，Chen YC，Chien CC，Huang HI，Bai CH，Yen BL.在干扰素-γ存在下源自胎盘多潜能细胞显示出提高的免疫抑制特性(Placenta-derivedMultipotent Cells exhibit immunosuppressive properties that are enhancedin the presence of interferon- gamma).Stem Cells.2006 Nov；24(11)：2466-77.)。
除MSC标记之外，PD-MSC还显示出独特的ESC表面标记SSEA-4、TRA-1-61和TRA-1-80，提示这些可能是极为原始的细胞。(Yen BL，Huang HI，Chien CC，Jui HY，Ko BS，Yao M，Shun CT，YenML，Lee MC，Chen YC.从人足月胎盘分离多潜能细胞(Isolation ofmultipotent cells from human term placenta).Stem Cells.2005；23(1)：3-9)。此外，PD-MSC(胎儿来源)而非源自BM的MSC对于细胞内人白细胞抗原-G(HLA)为阳性(Chang CJ，Yen ML，Chen YC，Chien CC，Huang HI，Bai CH，Yen BL，在干扰素-γ存在下源自胎盘多潜能细胞显示出提高的免疫抑制特性(Placenta-derived Multipotent Cells exhibitimmunosuppressive properties that are enhanced in the presence ofinterferon-gamma).Stem Cells.2006 Nov；24(11)：2466-77.)。
研究表明PD-MSC的扩增潜能显著高于源自成人BM的MSC(Yen BL，Huang HI，Chien CC，Jui HY，Ko BS，Yao M，Shun CT，YenML，Lee MC，Chen YC，从人足月胎盘分离多潜能细胞(Isolation ofMultipotent cells from Human Term Placenta).Stem Cells.2005；23(1)：3-9；M.J.S.de Groot-Swings，Frans H.J.Claas，Willem E.Fibbe和Humphrey H.H.Pieternella S.in‘t Anker，Sicco A.Scherjon，Carin Kleijburg-van der Keur，Godelieve.从人中胎盘分离胎儿或母体来源的间充质干细胞(Placenta Isolation of Mesenchymal Stem Cells ofFetal or Maternal Origin from Human).Stem cells，2004；22；1338-1345)。另外，源自胎盘的粘附细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。发现源自胎盘的MSC如源自BM的MSC一样阻抑脐带血(UCB)淋巴细胞增殖，这表明联合移植HSC和源自胎盘(PD)-MSC可降低受者潜在的移植物抗宿主病(GvHD)[Li CD等，Cell Res.Jul；15(7)：539-47(2005)]，并且可增强造血支持[Zhang Yi等，Chinese Medical Journal117(6)：882-887(2004)]。胎盘作为羊膜上皮细胞来源的应用教导于例如WO 00/73421中，但得到这些细胞仍很麻烦，并且MSC产率极低。
解决MSC量有限问题的另一方法是用不同的培养条件离体扩增这些细胞[例如美国专利第6,326,198号；第6030836号；第6555374号；第6,335,195号；第6,338,942号]。然而，这样的方法的缺点仍在于耗时、需要特定选择和分离程序，使得这些方法花费大、难实施。
在若干研究中发现三维(3D)细胞培养在产量上更为有效[Ma T等，生物工程进展(Biotechnology Progress).Biotechnol Prog15：715-24(1999)；Yubing Xie，Tissue Engineering 7(5)：585-598(2001)]。模拟MSC天然环境的3D培养方法的应用基于将这些细胞接种到以下生物反应器中：含有Polyactive泡沫的灌注式生物反应器[Wendt，D.等，Biotechnol Bioeng 84：205-214，(2003)]、管状聚L乳酸(PLLA)多孔支架的径向流灌注式生物反应器[Kitagawa等，Biotechnology andBioengineering 93(5)：947-954(2006)]、和用于培养和扩增造血干细胞的推流式生物反应器(美国专利第6,911,201号)。
在美国专利第6,022,743号中提出粘附基质细胞的三维框架，在Hosseinkhani，H等，[Tissue Engineering 11(9-10)：1476-1488(2005)]中提出海绵胶原作为3D基质。然而，这些研究中无一曾提及在这些条件下生长的MSC用于在HSC移植后支持体内移入HSC的用途。还需要耗时来为特定细胞类型优化各种条件(例如灌注条件)或各种分离技术。
在美国专利第7045148号和美国专利申请第20020123141号、第20030032179号和第2005011871号中提出灌注的产后胎盘作为3D反应器用于培养MSC的用途。然而，该方法受限于要待到胎盘分离后24小时并涉及灌注，因此，细胞的群集生长(mass growth)且其在延长的时间周期内维持是不可能的。
因此，普遍公认需要且将极为有利的是具备：不存在上述限制的新颖的细胞扩增方法和藉此产生的细胞及条件培养基用于治疗的用途。
发明简述
本发明一方面提供细胞扩增方法，所述方法包括在支持细胞扩增的三维培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。
本发明另一方面提供产生条件培养基的方法，所述方法包括：在允许细胞扩增的三维培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞；和收集扩增的粘附细胞的条件培养基，藉此产生条件培养基。
本发明又一方面提供根据上述方法产生的细胞群。
本发明再一方面提供分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞分泌比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞分泌的更高水平的选自SCF、IL-6和Flt-3的至少一种因子。
本发明另外方面提供分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达的更高水平的选自H2A组蛋白家族(H2AF)、醛脱氢酶X(ALDH X)、真核细胞翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙结合蛋白3、EF-手形钙结合结构域(RCN2)和钙调理蛋白1碱性平滑肌(CNN1)的至少一种蛋白质。
本发明又一方面提供分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达的更低表达水平的选自核内不均一核糖核蛋白H1(Hnrph1)、CD44抗原同种型2前体、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同种型a(Papss2)和核糖体蛋白L7a(rpL7a)的至少一种蛋白质。
本发明再一方面提供分离的细胞群，其包含胎盘或脂肪组织粘附细胞，其中所述粘附细胞特征为比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞的免疫抑制活性更高。
根据下述本发明优选实施方案的另外特征，免疫抑制活性包含降低T细胞增殖。
本发明另一方面提供药物组合物，其包含作为活性成分的按照上述方法产生的细胞群。
本发明另一方面提供药物组合物，其包含作为活性成分的按照上述方法产生的条件培养基。
本发明又一方面提供药物组合物，其包含作为活性成分的上述分离的细胞群。
本发明再一方面提供治疗有其需要的对象中可受益于基质细胞移植的病症的方法，所述方法包括：给予该对象治疗有效量的选自胎盘和脂肪组织的组织的粘附细胞，藉此治疗该对象中可受益于干细胞移植的病症。
本发明再一方面提供治疗有其需要的对象中可受益于基质细胞移植的病症的方法，所述方法包括：给予该对象治疗有效量的源自选自胎盘和脂肪组织的组织的粘附细胞的条件培养基，藉此治疗对象中可受益于干细胞移植的病症。
本发明再一方面提供降低有其需要的对象中的免疫应答的方法，所述方法包括给予该对象治疗有效量的权利要求3、4、5、6或7的分离的细胞群，以此降低该对象的免疫应答。
根据所述优选实施方案的再一特征，用细胞疗法治疗该对象。
根据所述优选实施方案的再一特征，该方法进一步包括给予干细胞。
根据所述优选实施方案的再一特征，该干细胞包含造血干细胞。
根据所述优选实施方案的再一特征，将所述细胞与条件培养基或粘附细胞同时给予。
根据所述优选实施方案的再一特征，在给予条件培养基或粘附细胞后给予所述细胞。
根据所述优选实施方案的再一特征，该粘附细胞从三维培养获得。
根据所述优选实施方案的再一特征，该粘附细胞从二维培养获得。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述病症选自：干细胞缺乏症、心脏病、帕金森氏病、癌症、阿尔茨海默氏病、中风、烧伤、组织缺损(loss of tissue)、失血、贫血症、自身免疫病、糖尿病、关节炎、多发性硬化症、移植物抗宿主病(GvHD)、神经退行性疾病、自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、系统性硬化症、Sjorgen综合征、多发性硬化症(MS)、重症肌无力(MG)、格-巴综合征(GBS)、桥本甲状腺炎(HT)、格雷夫斯病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和炎症性肠病。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述三维培养包含3D生物反应器。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述生物反应器选自推流式生物反应器、连续搅拌罐生物反应器和固定床生物反应器。
根据所述优选实施方案的再一特征，细胞培养在连续流动培养基中进行。
根据所述优选实施方案的再一特征，三维培养包含粘附材料选自：聚酯、聚链烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、matrigel(基质胶)、细胞外基质组分、胶原、聚L乳酸和惰性金属纤维。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述培养至少进行3天。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述培养至少进行3天。
根据所述优选实施方案的再一特征，直到粘附细胞达到至少60％汇合(confluence)才完成所述培养。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述病症可受益于对造血干细胞移入的促进。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞包含选自CD73、CD90、CD29和CD105的阳性标记表达系列(marker expressionarray)。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞包含选自CD45、CD80、HLA-DR、CD11b、CD14、CD19、CD34和CD79的阴性标记表达系列。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞分泌比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更高水平的选自SCF、Flt-3和IL-6的至少一种因子。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更高水平的选自H2A组蛋白家族(H2AF)、醛脱氢酶X(ALDH X)、真核细胞翻译延伸因子2(EEEF2)、网钙结合蛋白3、EF-手形钙结合结构域(RCN2)和钙调理蛋白1碱性平滑肌(CNN1)的至少一种蛋白质。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞表达比在2D培养中生长的来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞分泌的更低表达水平的选自核内不均一核糖核蛋白H1(Hnrph1)、CD44抗原同种型2前体、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同种型a(Papss2)和核糖体蛋白L7a(rpL7a)的至少一种蛋白质。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述粘附细胞或培养基特征为比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞免疫抑制活性更高。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述免疫抑制活性包含降低T细胞增殖。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述细胞包含具有基质干细胞表型的细胞
根据所述优选实施方案的再一特征，所述基质干细胞表型包含T细胞抑制活性。
根据所述优选实施方案的再一特征，所述基质干细胞表型包含造血干细胞支持活性。
根据所述优选实施方案的再一特征，上述细胞群的用途为制备用于鉴定移植的药物。
本发明通过提供新颖的细胞扩增方法和藉此产生的细胞和条件培养基用于治疗的用途，成功解决目前已知结构(configuration)中的缺点。
除非另外定义，否则本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解相同的含义。在本发明实践或试验中，尽管可使用与本文所述相似或相当的方法和材料，但适宜的方法和材料如下文所述。在有冲突的情况下，包括定义在内的本专利说明书将起主导作用。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，并非意欲限制。

附图简述
本发明于此仅通过与附图有关的实例来阐述。强调的是，于此与具体附图有关的详细内容通过实施例出示且仅旨在阐述性地讨论本发明的优选实施方案，并且是为了提供什么被认为是本发明原理和构思方面的最有用和最易理解的说明而提出。在这一点上，不试图比基本理解本发明所需的更详细地显示本发明结构性细节，对附图所作的说明使得本领域技术人员明白本发明的几种形式在实践中是怎样具体化的。
在附图中：
图1a-g描述在含有3-D载体的生物反应器系统中创造的类骨微环境。图1a-b是描述天然骨(图1a)与在接种粘附基质细胞(3D-ASC)后7天PluriX^TM 3D载体结构的仿造骨微环境(图1b)的比较电子显微图。图1c-f是描述用从骨髓产生的3D-ASC接种的PluriX^TM3D基质在接种后20天(图1c-d，分别放大X 150和250)和40天(图1e-f，分别放大X 350和500)的电子显微图。图1g是具有由编号定义的单独部件的Plurix 3D推流式生物反应器：培养基库(1)、混合气体供给(2)、过滤器(3)、注射点(4)、在其中放置3D载体的柱(5)、流量监控器(6)、流量阀(6a)、分离容器(7)、细胞生长分析仪(8)、蠕动泵(9)、取样点(10)、溶O₂测量电极(11)、pH测量电极(12)、控制系统(13)、新鲜生长培养基(14)、用过的生长培养基(15)。
图2是描述在生物反应器系统内3D生长条件下生长的来源于胎盘的粘附基质细胞不同生产批次(lot)图(3D-ASC；批次5-8)。将ASC(2X 10⁶)以10000-15000个细胞/载体的密度接种到生物反应器。培养12天后，3D-ASC的密度达到150,000-250,000个细胞/载体或含有150个载体的生物反应器中22.5-37.5×10⁶个。。
图3a-b是描述比较在源自胎盘的3D-ASC中表达的膜标记(暗紫色)与在常规2D培养条件下培养的胎盘细胞中的膜标记(淡紫色)的表达水平差异的条形图。粘附细胞在培养瓶(2D)中生长4-6周，或在生物反应器系统中于聚苯乙烯载体(3D)上生长2-3周。使细胞从培养瓶或载体经收获后，孵育并与识别MSC(图3a)或造血细胞(图3b)膜标记特征的一组单克隆抗体(MAb)结合。注意到在2D培养细胞中的MSC膜标记表达(如对于CD90、CD 105、CD73和CD29膜标记所示)比在3D培养的粘附细胞中表达的MSC膜标记明显更高，尤其是CD105，在3D培养细胞中显示56％表达，相比较在2D培养细胞中为87％(图3a)。2D和3D二者培养物中的ASC都不表达任何造血膜标记(图3b)。
图4a-d是描述比较在2D和3D条件或在2D和3D条件培养基下培养的从胎盘产生的ASC的蛋白质水平的条形图。图4a-c描述由ELISA分析以pg/ml(标准化为1×10⁶个细胞/ml)2D和3D条件培养基中培养的ASC的Flt-3配体(图4a)、IL-6(图4b)和SCF(图4c)的水平。结果代表三个独立实验之一。图4d显示不同细胞蛋白的表达水平，根据用iTRAQ试剂标记之间比较的蛋白质样品的质谱法分析。蛋白样品采自在2D(白条)和3D(灰条)条件下生长的ASC。该图代表两个重复实验中的一个。注意到2D和3D培养条件的条件培养基及细胞中某些蛋白的表达水平的差异。
图5a-d是描述源自胎盘的3D-ASC在体外分化为成骨细胞的能力的显微照片。源自人胎盘的ASC在导成骨分化的培养基(含有10％FCS、100nM地塞米松、0.05mM抗坏血酸2-磷酸盐、10mM B-甘油磷酸盐的DMEM)中培养3周时间。图5a-b显示表达钙化基质的细胞，根据由AlizzarinRed S染色所示。图5c-d显示不用导成骨分化的培养基处理的对照细胞，其保持成纤维细胞样表型并证明没有矿化。
图6是描述在移植后用化学疗法(连续2周腹膜内注射25mg/kg白消安(busulfan))治疗3.5周的NOD-SCID小鼠骨髓(BM)中检测的人CD45+细胞百分比的图表。将从源自脐带血的单核细胞纯化的CD34+细胞(100,000)单独移植(5只小鼠，a)，或与在2D条件下培养的0.5×10⁶个源自胎盘的粘附细胞共同移植(2D-ASC；2只小鼠，b)，或与在pluriX^TM生物反应器中3D条件下培养的源自胎盘的粘附细胞(3D-ASC)共同移植(5只小鼠，c)。然后从小鼠大腿骨和胫骨收集BM。通过流式细胞术检测BM中的人细胞。通过让细胞与抗人CD45-FITC孵育来测定表达CD45的人细胞的百分比。注意到与单用HSC处理小鼠中的人类细胞的百分比(a)相比，与2D-ASC(b)以及与3D-ASC(c)共同移植的小鼠骨髓中的人细胞(hCD45+)的百分比更高。在经3D-ASC培养细胞处理的小鼠中观察到比经2D-ASC培养细胞处理的小鼠更高的移入，表明了经3D培养的ASC所特有的更高治疗优势。
图7a-b是仅用CD34+细胞移植的小鼠中的人移植CD45+细胞(图7a)与CD34+细胞加源自脂肪组织的ASC(图7b)比较的FACS分析。注意到与单用人CD34+处理的小鼠中的(7b-12％)相比，用源自脂肪组织的ASC共同移植的小鼠中的人造血群体(hCD45+)百分比(7a-29％)明显更高。
图8是描述在人脐带血单核细胞(CB)与等辐射量(3000 Rad)脐带血细胞(iCB)、源自人外周血单核细胞(PBMC)、2D培养的(2D)或3D培养的(3D)胎盘ASC、或PBMC和2D及3D培养的胎盘ASC的联合(PBMC+2D和PBMC+3D)之间进行混合淋巴细胞反应的条形图。CB细胞群大小由³H-胸苷吸收(以CPM测量)来表示，在培养的最后18小时内测量。受刺激的CB细胞增殖升高说明较高的免疫应答水平。注意到与粘附细胞孵育的细胞显示出较低的免疫应答水平，特别是在与粘附细胞共同孵育时，对PBMC的CB免疫应答减少。每一反应作三个重复。
优选实施方案说明
本发明为新颖的细胞扩增方法和藉此产生的细胞和条件培养基用于干细胞相关治疗、干细胞移入和HSC支持的用途。
参考附图和随附说明可更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释至少一种本发明实施方案之前，应该理解本发明申请不限于在以下说明所阐述的或实施例例证中的细节。本发明能够有其它实施方案或以各种方式实践或实施。还应该理解，本文所用措辞和术语是为了说明目的，不应该认作限制。
在日益发展的医学界，为了临床和研究目的越来越需要干细胞，更具体地是基质干细胞(也称为“间充质干细胞”)。MSC用于支持HSC移植和移入，也用于治疗越来越多种病症，例如心脏病、BM缺乏症、神经元相关疾病和需要器官或组织移植的病症。
使用干细胞的障碍在于分离大量正常存在的干细胞或祖细胞群技术上困难，原因为：这些细胞在大部分组织中数量有限，在得到干细胞的方法中涉及不便之处和风险，并且用目前的收获方法伴随记忆B细胞和造血干细胞损失。从人胚胎获得细胞在已经存在的技术困难之上又增加了宗教和伦理方面的问题。
源自骨髓的干细胞的备选来源包括脂肪组织和胎盘。然而，目前尚无有效扩增来自这些组织的干细胞的方法。
在将本发明付诸于实践时，本发明人发现来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞可在3D培养条件下有效繁殖。本发明人出乎意料之外地发现这样的细胞包含与MSC相似的功能特性，因此，这些细胞和由此产生的条件培养基可用作治疗目的，例如移植、组织再生和体内HSC支持。
如下文和以下实施例部分所述，本发明人能够在3D环境中扩增包含基质干细胞特性的源自脂肪组织和胎盘的粘附细胞。发现据此扩增的细胞在低温贮藏后有活力，这由粘附和重形成群体测定(repopulation assay)证明(参见实施例1)。源自胎盘的粘附细胞的流式细胞术分析发现不同的标记表达型式(参见图3a-b)。最重要的是，在2D或3D环境中繁殖的源自脂肪组织和胎盘的粘附细胞能够支持HSC移入(参见实施例2)，其证实了本发明细胞作为基质干细胞在临床上的用途。
因此，本发明一方面提供细胞扩增的方法。
所述方法包括在支持细胞扩增的三维(3D)培养条件下培养来自胎盘或脂肪组织的粘附细胞。
本文所用术语“扩增的”和“扩增”指基本上不分化地维持细胞及最终细胞生长，即使细胞群增加(例如至少到2倍)而不存在伴随所述增加的分化。
本文所用术语“维持的”和“维持”指基本上不分化的细胞更新，即基本上稳定细胞群而不存在伴随所述稳定的分化。
本文所用短语“粘附细胞”指具有贴壁依赖性的同质或异质细胞群，即细胞为了在体外生长需要粘附表面。
本文所用短语“脂肪组织”指包含脂肪细胞(adipocyte)的结缔组织。
本文所用术语“胎盘组织”指沿着子宫壁并在怀孕期间包裹胎儿的哺乳动物雌性器官的任何部分，胎盘和胎儿通过脐带连接。出生后胎盘剥离(称为产后胎盘)。
本文所用短语“三维培养条件”指将细胞置于与细胞生长相容同时使得细胞可以在多于一层上生长的条件。完全可将细胞在活生物体(或组织)中的原位环境理解为三维构造。细胞被其它细胞围绕。它们被固定在使得可建立各种局部微环境的纳米级细胞外基质纤维的复合网络中。它们的胞外配体不仅介导对基底膜的附着，而且还通向多种血管和淋巴管。氧、激素和营养素被运送到细胞而废物则被运出。本发明三维培养条件设计为模拟例如以下进一步作为例证的环境。
因此，本发明这方面的粘附细胞从脂肪组织或胎盘组织提取。
可从足月或早产胎盘得到胎盘细胞。优选一旦外出血就收集胎盘。优选在足以除去残留细胞的时间内灌注胎盘。本文所用术语“灌注(perfuse或perfusion)”指将液体倾注或使液体通过器官或组织的行为。胎盘组织可来自任何哺乳动物；最优选的胎盘组织是人的胎盘组织。胎盘组织方便的来源是产后胎盘(例如1-6小时)，然而，胎盘组织或细胞的来源或分离胎盘组织的方法对于本发明而言并不重要。
源自胎盘的粘附细胞可来自胎盘的胎儿(即羊膜或胎盘内部部分，参见实施例1)和母体(即基蜕膜和壁蜕膜)部分。在生理盐水缓冲液[例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hank缓冲液)中洗涤组织样品。通过用消化酶处理组织(参见下面)或/和切碎(mince)并用洗涤培养基经过尼龙滤器冲洗组织部分或通过轻轻吹打(Falcon，Becton，Dickinson，San Jose，CA)，制备单细胞悬浮液。
源自脂肪组织的粘附细胞可通过本领域技术人员已知的多种方法来分离。例如，这样的方法阐述于美国专利第6,153,432号。脂肪组织可源自网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织部位。优选脂肪组织来源为网膜脂肪组织。在人类中，脂肪组织通常通过吸脂来分离。
从脂肪组织分离粘附细胞可通过在如下条件处理组织得到：用消化酶(例如胶原酶、胰蛋白酶和/或分散酶；和/或有效浓度的透明质酸酶或DNA酶)；和乙二胺四乙酸(EDTA)；在25-50℃的温度作用10分钟-3小时。然后可以让细胞通过20微米-800微米的尼龙或粗棉布网滤器。然后让细胞直接在培养基中或经过Ficoll或Percoll或其它颗粒梯度进行差速离心。细胞在4-50℃温度以100-3000xg速度离心1分钟-1小时(参见美国专利第7,078,230号)。
除源自胎盘或脂肪组织的粘附细胞外，本发明还展望特征为基质干细胞表型(其将在下文进一步阐述)的来自其它细胞来源的粘附细胞的用途。可从其中提取粘附细胞的组织来源包括但不限于：脐带血、毛囊[例如美国专利申请第20060172304号所述]、睾丸[例如Guan K.等，Nature.2006 Apr 27；440(7088)：1199-203所述]、人嗅粘膜[例如Marshall，CT.等，Histol Histopathol.2006 Jun：21(6)：633-43所述]、胚胎卵黄囊[例如Geijsen N，Nature.2004 Jan 8；427(6970)：148-54所述]和羊膜水[Pieternella等(2004)Stem Cells.22：1338-1345]，已知它们所有的都包括间充质干细胞。来自这些组织来源的粘附细胞可以通过使这些细胞在粘附表面上培养分离，由此从其它细胞原始群中分离出粘附细胞。
不管是什么来源(例如胎盘或脂肪组织)，优选在无菌条件下提取细胞。一旦得到分离的细胞，就使其粘附到粘附材料(例如构成表面)上，藉此分离粘附细胞。这可在于3D培养条件中培养之前(参见实施例1)或同时进行。
本文所用“粘附材料”指具有可让细胞保持在其表面的化学结构(例如荷有表面暴露基团)的人工合成、天然存在或其组合的无毒(即生物相容)材料。
可用于本发明这方面的粘附材料实例包括但不限于：聚酯、聚链烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、matrigel、细胞外基质组分(例如纤维粘连蛋白、软骨粘连蛋白、层粘连蛋白)、胶原、聚L乳酸和惰性金属纤维。
用本领域熟知方法可实现进一步纯化或富集基质干细胞的步骤(例如通过用基质干细胞标记表达的FACS，其在下文进一步阐述)。
用于本发明培养的基本培养基的非限制性实例包括极限必须培养基Eagle、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(进行和不进行Fitton-Jackson改良)、基本培养基Eagle(BME-加入Earle碱盐)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy 5A培养基、培养基M199(M199E-含Earle碱盐)、培养基M199(M 199H-含Hank碱盐)、极限必须培养基Eagle(MEM-E-含Earle碱盐)、极限必须培养基Eagle(MEM-H-含Hank碱盐)和极限必须培养基Eagle(MEM-NAA，含非必须氨基酸)，在数目众多的其他培养基中包括：培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams’G、Neuman & Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC 153。用于本发明的优选培养基为DMEM。这些和其它有用的培养基购自GIBCO，Grand Island，N.Y.，USA和Biological Industries，Bet HaEmek，Israel等等。大量这些培养基概述于酶学方法(Methods inEnzymology)第LVIII册，“细胞培养(Cell Culture)”，第6272页，WilliamB.Jakoby和Ira H.Pastan编辑，Academic出版公司出版。
培养基可补充例如血清(例如牛或其它物种的胎血清或)和任选或备选以皮克/ml-毫克/ml水平浓度的生长因子、细胞因子和激素(例如生长激素、促红细胞生成素、促血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板源生长因子和骨形成蛋白)。
应进一步认识到可将另外组分加入培养基中。这样的组分可为抗生素、抗真菌素、白蛋白、氨基酸和本领域已知用于细胞培养的其它组分。此外，需要时可加入组分以提高分化过程(参见以下进一步阐述)。
一旦取得粘附细胞就可将其转移到三维环境(参见以下实施例部分的实施例1)。但是应该了解，可在分离后立即将所述细胞转移到3D构造基质中(如上文所述)。
因此，使本发明这方面的粘附材料成形用于3D培养，藉此提供基本上增加对基质细胞粘附有用附着表面的生长基质，以便模拟组织(例如胎盘)的基础结构。
例如，对于0.5mm高的生长基质而言，增加到至少5-30倍，其通过投影到生长基质基部来计算。所述增加到约5-30倍是对于每一单层而言，若使用许多所述层(无论是堆叠的还是由间隔物隔开或诸如此类)，则5-30倍都适用于每一层如此结构。当基质以片(sheet)形式使用时，优选非编织纤维片或开孔发泡聚合物片，优选片厚度为约50-1000μm或更厚，其提供供细胞进入、营养素进入和从片除掉废物用的足够的多孔性。根据优选实施方案，所述孔具有10μm-100μm的有效直径。这样的片可从各种厚度的纤维制备，优选纤维厚度或纤维直径范围为约0.5μm-20μm，更优选纤维直径范围为10μm-15μm。
本发明结构可由提供空间稳定性和物理强度的多孔支撑片或筛网支撑，或甚至更好与其结合。
还可切割、冲孔或切碎这样的基质片，以提供投影面积约0.2mm-约10mm且大约同样厚度(约50-1000μm)的颗粒。
更多与用于使本发明付诸于实践的生长基质的制作、用途和/或优点阐述于美国专利第5,168,085号和特别是第5,266,476号中，它们都在此引作参考。
粘附表面可具有选自正方形、环形、圆形和十字形的形状。
对于大规模生产而言，优选在3D生物反应器中实现培养。
这样的物反应器实例包括但不限于推流式生物反应器、连续搅拌槽罐生物反应器和固定床生物反应器。
如实施例部分的实施例1所示，三维(3D)推流式生物反应器(如美国专利第6911201号所述)能够支持基质细胞的生长和长期维持。在该生物反应器中，基质细胞被接种到装于玻璃柱中由非编织纤维聚酯基质构成的porrosive载体上，藉此使大量细胞在相对小的体积内繁殖。
在推流式生物反应器中所用的基质可为片形式，为非编织纤维片或开孔发泡聚合物片，优选片厚度为约50-1000μm或更厚，其提供供细胞进入、营养素进入和从片除掉废物用的足够的多孔性。
可与本发明使用的其它3D生物反应器包括但不限于连续搅拌罐生物反应器(其中使培养基连续进料到生物反应器中，将产物连续抽出，以维持反应器内的恒时稳态。带有纤维床篮的搅拌罐生物反应器可购自例如New Brunswick Scientific公司Edison，NJ)、固定床生物反应器、气升式生物反应器(其中空气通常通入中央导管的底部，向上流动同时形成气泡，在柱顶分离废气)、带有Polyactive泡沫塑料的细胞接种灌注式生物反应器(如Wendt，D.等，Biotechnol Bioeng 84：205-214，(2003)所述)、管状聚L乳酸(PLLA)多孔支架径向流灌注式生物反应器[如Kitagawa等，Biotechnology and Bioengineering 93(5)：947-954(2006)所述]。符合本发明的其它生物反应器阐述于美国专利第6,277,151号、第197,575号、第139,578号、第132,463号、第902,741号和第5,629,186号。
接种时优选细胞接种达到100,000-1,500,000个细胞/mm。
优选一旦达到至少约40％汇合、60％汇合或80％汇合就收获细胞，同时优选避免不受控制的分化和老化。
培养进行至少约2天、3天、5天、10天、20天、1个月或甚至更长。应该了解，在生物反应器中的培养可能延长这一时间。可能实现传代以增加细胞数目。
优选本发明粘附细胞包含至少一种“基质干细胞表型”。
本文所用“基质干细胞表型”指源自骨髓基质(即间充质)干细胞的典型结构或功能表型。
本文所用短语“干细胞”指没有终末分化的细胞。
因此，例如，细胞可能具有纺锤形。作为备选或另外，细胞可表达基质干细胞象征的一种或一群(例如表面标记)标记。基质干细胞表面标记(阳性和阴性)实例包括但不限于CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11B-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其它基质干细胞标记包括但不限于酪氨酸羟化酶、巢蛋白和H-NF。
基质干细胞代表性功能表型实例包括但不限于T细胞抑制活性(不刺激T细胞而相反地对其抑制)、造血干细胞支持活性以及脂肪细胞、肝细胞、成骨细胞和神经细胞定向分化。
这些结构或功能特征中的任一项都可用于评定本发明细胞(参见以下实施例部分的实施例1-2)。
根据本发明教导产生的细胞群特征为独特的蛋白质表达谱，其如实施例部分的实施例1所示。因此，例如，根据本发明教导产生的胎盘或脂肪组织粘附细胞能够表达和/或分泌高水平的所选择的因子。例如，这样的细胞表达或分泌SCF、Flt-3、H2AF或ALDH X比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达或分泌的高达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或优选12倍。另外或作为备选，本发明细胞群分泌或表达IL-6、EEEF2、RCN2或CNN1比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达或分泌的高达至少2、3或5倍水平。另外或作为备选，本发明细胞群特征为与2D培养的细胞比较各种其它蛋白表达水平较低。因此，例如，分泌或表达比在2D培养中生长的胎盘或脂肪组织粘附细胞表达或分泌的Hnrph1、CD44抗原同种型2前体、Papss2或rpL7a的表达水平低至0.6、0.5、0.25或0.125。
当进一步将本发明具体化到实践中时，本发明人认识到粘附基质细胞尤其是3D-ASC显示免疫抑制活性。如以下实施例部分的实施例3所示，在MLR测定中发现粘附基质细胞尤其是3D-ASC抑制人类脐带血单核细胞的免疫反应。因此，本发明细胞可包含可优先用于临床的生物活性(例如T细胞抑制活性、造血干细胞支持活性)。
当进一步将本发明具体化到实践中时，本发明人认识到本发明细胞的条件培养基可包含可优先用于临床的生物活性(例如T细胞抑制活性、造血干细胞支持活性)。
因此，本发明进一步展望条件培养基的收集和其照原样的或在用本领域熟知方法浓缩、富集或分馏的另外步骤后的应用。优选本发明条件培养基来自高生存力的细胞培养对数中期。
如上所述，本发明细胞和条件培养基特征为基质干细胞表型，因此可用于任何研究和可能受益于使用这样的细胞的任何临床应用中。
移植的HSC移入并启动血细胞生成依赖于复杂的过程，包括随趋化因子梯度穿过内皮细胞屏障归巢到骨髓并驻留在合适龛，同时在龛中的移植细胞、ECM和间充质细胞之间建立物理接触。所有这些过程涉及一群复杂的分子，例如细胞因子、激素、类固醇、细胞外基质蛋白、生长因子、细胞间作用和黏附蛋白和基质蛋白。
已知移植后2-3天于受者BM中仅检测到1-5％灌输的HSC[Kerre等，J Immunol.167：3692-8.(2001)；Jetmore等，Blood.99：1585-93(2002)]。
MSC对造血移入的贡献部分在于抑制引起移植物抗宿主病的源自供者的T细胞产生[(GvHD，Charbord P.，和Moore，K.，Ann.N.Y.Acad.ScI 1044：159-167(2005)；Maitra B等，Bone Marrow Transplant.33(6)：597-604.(2004)；美国专利第6,010,696号；第6555374号]，部分在于提供造血干细胞(HSC)支持(即维持并帮助造血干细胞增殖、成熟和/或归巢)。
如以下实施例部分的实施例2所述，意想不到地发现源自胎盘和脂肪组织的粘附细胞即使在化疗后也支持HSC移入。
考虑到这些结果，可想象到本发明细胞或培养基可用于使用基质干细胞移植的任何临床应用中。
因此，本发明另一方面提供在需要治疗的对象中治疗可受益于基质干细胞移植的医学病症(例如病理、疾病、综合征)的方法。
本文所用术语“治疗”指抑制或阻滞病理进展和/或引起病理的减轻、消除或消退。本领域技术人员应该理解，可使用各种方法和测定来评估病理进展，同样地，可使用各种方法和测定来评估病理的减轻、消除或消退。术语“治疗”优选指减缓或缩小与癌病有关的症状。优选治疗治愈例如基本上消除与医学病症有关的症状。
本文所用“可受益于基质干细胞移植的医学病症”指可通过给予本发明细胞/培养基减缓的任何医学病症。
术语或短语“移植”、“细胞置换”或“移入”在本文中可交替使用，指将本发明细胞引入到靶组织中。
本文所用术语“对象”指任何对象(例如哺乳动物)，优选人类对象。
本发明这方面的方法包括给予所述对象治疗有效量的本发明细胞或培养基(上述)，藉此治疗对象的可受益于基质干细胞移植的医学病症。
根据本发明这方面可给予的细胞包括上述可在二维或三维环境中培养的粘附细胞及其间充质和非间充质的部分或终末分化衍生物。
衍生来自本发明基质干细胞的特定谱系细胞的方法为本领域熟知。参见例如美国专利第5,486,359号、第5,942,225号、第5,736,396号、第5,908,784号和第5,902,741号。
细胞可为天然的，或遗传改良例如以便衍生的目的谱系(参见美国专利申请第20030219423号)。
细胞和培养基可为新鲜或冷冻(例如冷冻保存)制备的自体或非自体来源(即同种异体或异种)。
根据医学病症可给予所述对象另外的化学药物(例如免疫调节剂、化疗等)或细胞。
因此，为了改进干细胞移入(例如增加受者BM中的有存活力的HSC数目和最优化改进正常白血细胞计数)，例如可将本发明细胞/培养基在HSC移植之前、同时或之后给予。
优选HSC和基质细胞享有共同的HLA抗原。优选HSC和基质细胞来自单一个体。或者，HSC和基质细胞来自不同个体。
术语或短语“移植”、“细胞置换”或“移入”在本文中可交替使用，指将本发明细胞引入到靶组织中。所述细胞可源自受者或源自同种异体或异种供者。
因为当将非自体细胞给予身体时可能诱导免疫反应，所以已开发了几种方法来降低排斥非自体细胞的可能性。这些方法包括在移植前抑制受者免疫系统或将非自体细胞包被在免疫隔离(immunoisolating)半渗透膜中。
胶囊化(encapsulation)技术通常分为涉及小的球状载体的微胶囊和涉及较大的平板中空纤维膜的大胶囊(macroencapsulation)(Uludag，H.等，哺乳动物细胞胶囊化技术(Technology of mammalian cellencapsulation).Adv Drug Deliv Rev.2000；42：29-64)。
制备微胶囊的方法为本领域所述，包括例如如下公开的方法：LuMZ等，用藻酸盐和α-苯氧基亚肉桂基乙酰化聚(丙烯胺)的细胞胶囊化(Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine)).Biotechnol Bioeng.2000，70：479-83；Chang TM和Prakash S，酶、细胞和遗传工程微生物的微胶囊封装方法(Procedures for microencapsulation of enzymes，cells and genetically engineered microorganisms).Mol Biotechnol.2001，17：249-60；和Lu MZ等，用光敏聚(丙烯胺α-氰基亚肉桂基乙酸酯)胶囊封装细胞的新颖的方法(A novel cell encapsulation method usingphotosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate))。JMicroencapsul.2000，17：245-51。
例如，通过将改良的胶原与甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)三元聚合物壳混合来制备微胶囊，导致胶囊厚2-5μm。这样的微胶囊可进一步用另外的2-5μm三元聚合物壳包被，以提供负电荷的光滑表面并使血浆蛋白吸收最小化(Chia，S.M.等，用作细胞胶囊化生物材料的多层微胶囊(Multi-layered microcapsules for cell encapsulation Biomaterials).200223：849-56)。
其它微胶囊基于藻酸盐、海洋多糖(Sambanis，A，糖尿病治疗中的胶囊化胰岛(Encapsulated islets in diabetes treatment).Technol.Ther.2003，5：665-8)或其衍生物。例如，可通过在氯化钙存在下聚阴离子藻酸钠和纤维素硫酸钠与聚阳离子亚甲基-胍共聚物盐酸盐之间的聚合电解质络合作用来制备微胶囊。
应该了解，当使用较小的胶囊时改进了细胞胶囊化。因此，当胶囊大小从1mm减小到400μm时，胶囊化细胞的质量控制、机械稳定性、分散特性和体外活性都得到改进(Canaple L.等，通过大小控制改进细胞胶囊化(Improving cell encapsulation through size control).JBiomater SciPolym编辑，2002；13：783-96)。此外，发现孔径很好地控制在小至7nm的、经处理(tailored)表面化学和精确微构造的纳米孔生物胶囊成功地为细胞免疫隔离出微环境(Williams D.小即是美：医疗装置中的微粒和纳米粒技术(Small is beautiful：microparticle andnanoparticle technology in medical devices).Med Device Technol.1999，10：6-9；Desai，T.A.胰腺细胞胶囊化的微构造技术(Microfabricationtechnology for pancreatic cell encapsulation).Expert Opin Biol Ther.2002，2：633-46)。
免疫抑制剂实例包括但不限于：氨甲蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢霉素(cyclosporine)、环孢霉素A(cyclosporin A)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺(D-penicillamine)、来氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、阿那白滞素(anakinra)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)、依那西普(etanercept)、TNFα阻断剂、靶向炎性细胞因子的生物药物、和非固醇类抗炎药物(NSAID)。NSAID实例包括但不限于：乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸镁、双水杨酸酯、水杨酸钠、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、萘普生(naproxen)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸、托美丁(tolmetin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、Cox-2抑制剂和曲马多(tramadol)。
在本文所述任一方法中，可以给予细胞或培养基本身，或优选作为进一步包含药学上可接受载体的药物组合物部分来给予。
本文所用“药物组合物”指含其它化学组分(例如药学上合适的载体和赋形剂)的本文所述一种或多种化学缀合物的制剂。药物组合物目的是方便将化合物给予对象。
下文所用术语“药学上可接受的载体”指载体或稀释剂，其对对象不引起明显刺激，不消除所给予化合物的生物学活性和特性。载体的非限制性实例为丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物。
本文所用术语“赋形剂”指加到药物组合物中以进一步方便施用化合物的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
根据本发明优选实施方案，药学载体为水性盐溶液。
制备和给予药物的技术可在“雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)”，Mack出版公司，Easton，PA，最新版本中找到，其在此引作参考。
可以全身方式给予药物组合物(如上文所述)。或者，可局部给予药物组合物，例如直接将药物组合物注射到患者的组织区。
可通过本领域熟知的方法来制备本发明药物组合物，例如借助于常规混合、溶解、成粒、制成糖锭剂、研粉、乳化、胶囊化、包埋或冻干的方法。
因此，可用一种或多种包含赋形剂和辅助剂的生理学上可接受的载体以常规方式来调配用于本发明的药物组合物，所述载体方便将活性成分加工成可在药学上使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的给药途径。
对于注射而言，可以以水溶液来调配药物组合物的活性成分，优选以生理上可容的缓冲液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于透过粘膜给药而言，制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常为本领域所知。
对于用于本发明方法中的任何制剂而言，可从体外和细胞培养测定中初始估计治疗有效量或剂量。优选在动物模型中调配剂量以达到所需的浓度或滴度。这样的资料可用于更准确地确定人类使用的剂量。
可通过体外标准药学方法在细胞培养或实验动物中测定本文所述活性成分的毒性和疗效。
从这些体外和细胞培养测定和动物研究中得到的数据可用于调配供人类使用的一系列剂量。剂量可视所用剂型和所用给药途径而变化。可通过个别医生考虑患者病症选择确切的制剂、给药途径和剂量(参见例如Fingl等，1975，载于“治疗学的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)”，第1章第1页)。例如，可对帕金森患者的显示对治疗积极反应的运动功能进行症状监控。
对于注射而言，可以以水溶液调配药物组合物的活性成分，优选以生理上可容的缓冲液例如Hank溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。
可个别调整剂量和给药间隔，以使活性成分水平足以通过移植的细胞来有效调节神经递质合成。达到理想效果所需的剂量将视个体特征和给药途径而定。检测试验可用于测定血浆浓度。
根据待治疗病症的严重程度和反应，可单次或多次给药，且疗程持续若干天到若干周，或达到减轻疾病状态。
当然，待给予的组合物的量将视正接受治疗的个体、病痛的严重程度、给药方式、主治医生的判断等等而定。给药剂量和时间应该对仔细连续监测的个体病情变化做出反应。例如，基于监测的指示，将给予被治疗的帕金森患者足以减轻疾病症状的细胞量。
本发明细胞经移植后优选在患病区域存活一段时间(例如至少6个月)，以便观察到治疗效果。
包括调配在药物可容载体中的本发明制剂在内的组合物可以经制备；置于合适容器中；并标上用于指定病症的治疗。
若有需要，本发明组合物可以存于包或分配装置(dipenser device)例如FDA核准的试剂盒中，其可含有含活性成分的一个或多个单位剂型。所述包可例如包含金属或塑料片，例如起泡包(blister pack)。所述包或分配装置可附有给药说明。包或分配装置还可提供与由管理药物生产、使用或销售的政府机构规定的形式的容器有关的公告，所述公告反映该机构批准的组合物形式或人类给药或兽用给药形式。这样的公告例如可以是由美国食品和药品管理局批准的处方药物标签或批准的产品插入物。
实施例
现在以下实施例和以非限制方式阐明本发明的上述说明一起构成参考。
本文所用术语和本发明所用实验方法通常包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见例如：“分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A laboratory Manual)”Sambrook等，(1989)；“分子生物学通用方案(Current Protocols inMolecular Biology)”第I-III卷，Ausubel，R.M.编辑(1994)；Ausubel等，“分子生物学通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，John Wiley & Sons，NewYork(1988)；Watson等，“重组DNA(Recombinant DNA)”，ScientificAmerican Books，New York；Birren等(编辑)“基因组分子：实验手册丛书(Genome Analysis：A Laboratory Manual Series)”，第1-4卷，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号和第5,272,057号提出的方法；“细胞生物学：实验手册(Cell Biology：ALaboratory Handbook)”，第I-III卷Cellis，J.E.编辑(1994)；“免疫学通用方案(Current Protocols in Immunology)”第I-III卷Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等(编辑)，“基础和临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology)”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“细胞免疫学选择方法(Selected Methods in CellularImmunology)”，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；广泛阐述于专利和科学文献中的有用的免疫测定，参见例如美国专利第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号和第5,281,521号；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”Gait，M.J.编辑(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”Hames，B.D.，和Higgins S.J.编辑(1985)；“转录和翻译(Transcription and Translation)”Hames，B.D.，和Higgins S.J.编辑(1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”Freshney，R.L编辑(1986)；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”IRLPress，(1986)；“分子克隆实行指南(A Practical Guide to MolecularCloning)”Perbal，B.，(1984)和“酶学方法(Methods in Enzymology)”第1-317卷，Academic Press；“PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols：A Guide To Methods and Applications)”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“蛋白质纯化和鉴定策略-实验课手册(Strategiesfor Protein Purification and Characterization - A Laboratory CourseManual)”CSHL Press(1996)；以上所有如同本文完全提出一样在此引作参考。贯穿本文献提供了其它一般的参考资料。认为其中的方法为本领域熟知，提供它们是为了方便读者。其中所包含的所有资料在此引作参考。
实施例1
从骨髓、胎盘和脂肪组织生产和培养粘附基质细胞(ASC)
在含有3D载体的生物反应器系统中培养粘附细胞，以生产特征为特定细胞标记表达谱的3D-ASC细胞。通过细胞计数测定生长效率。通过在分化培养基中培养来测定这些细胞的分化能力。
材料和试验方法
骨髓基质细胞- 经过心脏直视手术或BM活检从血液学健康的供者吸出胸骨骨髓得到骨髓(BM)基质细胞。用Hank平衡盐溶液(HBSS；GIBCO BRL/Invitrogen，Gaithersburg MD)将骨髓吸出物稀释3倍，进行Ficoll-Hypaque(Robbins Scientific公司，Sunnyvale，CA)密度梯度离心。此后收集骨髓单核细胞(＜1.077gm/cm3)，用HBSS洗涤3次，重新悬浮于生长培养基[补充10％ FCS(GIBCO BRL)、10^-4M巯基乙醇(Merck，White House Station，NJ)、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml；Beit Ha’Emek)、2mM L-谷氨酰胺(Beit Ha’Emek)的DMEM(Biological Industries，Beit Ha’emek，Israel)]。在组织培养培养瓶(Corning，Acton，MA)中于37℃(5％ CO₂)分开孵育来自各个供者的细胞且每周更换培养基。每3-4天用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Beit Ha’Emek)分裂(split)细胞。传2-40代后，当达到60-80％汇合时，收集细胞用于分析或用于在生物反应器中培养。
源自胎盘的基质细胞-在无菌条件下切下足月分娩胎盘的里面部分(Bnei Zion医学中心，Haifa，Israel)，用Hank缓冲液洗涤3次，于37℃与0.1％胶原酶(1mg/ml组织；Sigma- Aldrich，St.Lewis，MO)孵育3小时。用吸管轻轻吹打，然后用补充10％ FCS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤悬浮的细胞，接种到75cm²培养瓶中并于37℃在5％CO₂增湿条件下于组织培养培养箱中孵育。此后使细胞在塑料表面贴壁72小时，然后每3-4天换一次培养基。当达到60-80％汇合(通常10-12天)时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA从生长培养瓶分离细胞，并接种到新培养瓶中。此后收集培养的细胞用于分析或用于在生物反应器中培养。
源自脂肪组织的基质细胞-从吸脂方法的人脂肪组织获得基质细胞(Rambam Haifa，Israel)。用等体积的PBS彻底洗涤脂肪组织，用胶原酶(20mg/ml)于37℃消化30分钟。然后用含有10％ FCS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和L-谷氨酰胺的DMEM洗涤细胞，以1200rpm在室温离心10分钟，用裂解液重新悬浮(1∶10；Biological Industries，Beit Ha′emek，Israel，以弃掉血细胞)，离心，用含有10％ FCS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和L-谷氨酰胺的DMEM重新悬浮。然后以3-10×10⁷个细胞/培养瓶将洗涤过的细胞接种到无菌组织培养基培养瓶。第二天用PBS洗涤细胞以除掉残留的RBC和死细胞。于37℃在5％ CO₂增湿条件下于组织培养培养箱中保持细胞。每3-4天更换培养基。在60-80％汇合时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA从生长培养瓶分离细胞，并接种到新培养瓶中。传2-40代后，当达到60-80％汇合时，收集细胞用于分析或用于在生物反应器中培养。
PluriX^TM推流式生物反应器-用由非编织纤维聚酯基质构成的1-100ml包好的3D porrosive载体(直径4mm)装载PluriX^TM推流式生物反应器(Pluristem，Haifa，Israel；如图1g所述，也参见美国专利第6,911,201号)。这些载体使得可在相对小的体积内繁殖大量细胞数。由Pluristem设计并制造玻璃器皿。生物反应器在37℃培养箱中保持，且流速由阀门(图1g中的6a)和蠕动泵(图1g中的9)调节并监控。生物反应器含有取样和注射点(图1g中的4)，使得可连续接种细胞。从库(图1g中的1)中供给pH 6.7-7.4的培养基。该库由含有不同比例的空气/CO₂/O₂(由生物反应器中的细胞密度而定)的已过滤气体混合物(图1g中的2、3)供给。O₂的比例适合生物反应器出口的溶O₂水平，其由监控器(图1g中的6)测定。经由硅胶管或扩散器(Degania Bet，EmekHayarden，Israel)将气体混合物提供给所述库。培养基流经能够收集循环中的非粘附细胞的分离容器(图1g中的7)。通过蠕动泵(图1g中的9)使得培养基循环。生物反应器进一步配备有附加的取样点(图1g中的10)和用于连续交换培养基的容器。
生产3D-粘附基质细胞(3D-ASC)-用胰蛋白酶处理按上所述培养的非汇合原代人粘附2D细胞培养物，用补充10％ FBS、青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤并重新悬浮，经由注射点接种(10³-10⁵个细胞/ml)到无菌推流式生物反应器(参见图1g)的3D载体。接种前将PBS-Ca-Mg(Biological Industries，Beit Ha’emek，Israel)填入生物反应器，高压灭菌(120℃，30分钟)，用含有10％热灭活的胎牛血清和青霉素-链霉素-制霉菌素混合物(100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml)的Dulbecco生长培养基洗涤。流速保持在0.1-5ml/分钟。接种过程涉及停止循环2-48小时，藉此使得细胞沉积在载体上。生物反应器保持在控制温度(37℃)和pH条件(pH＝6.7-7.4)下；根据需要使用供给无菌空气和CO₂的培养箱。每周置换2-3次生长培养基。用新鲜的DMEM培养基每4小时-7天替换循环培养基。在密度为1×10⁶-1×10⁷个细胞/ml(生长后12-40天)时，从生物反应器除掉总培养基体积，用PBS将生物反应器和载体洗涤3-5次。然后用胰蛋白酶-EDTA从载体分离3D-ASC细胞；(Biological Industries，Beit Ha’emek，Israel；轻轻搅动3-15分钟，1-5次)，此后重新悬浮于DMEM并冷冻保存。
3D-ASC质量生物学测定-解冻并计数冻存的3D-ASC细胞。为评估细胞生存力，将2×10⁵个细胞接种到150cm²组织培养培养瓶中，在接种后7天内评估其粘附能力和重形成群体(repopulation)。此后用荧光单克隆抗体流式细胞仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)分析3D-ASC膜标记表型。
用流式细胞术测定比较3D和2D培养的粘附细胞的细胞膜标记谱-将来自2D培养物和3D流动系统培养物中的100,000-200,000个粘附细胞悬浮在5ml管中的0.1ml培养基中，与饱和浓度的下述各种单克隆抗体(MAb)孵育(4℃，30分钟，暗环境)：FITC-缀合的抗人CD90(Chemicon International公司，Temecula，CA)、PE缀合的抗人CD73(Bactlab Diagnostic，Ceasarea，Israel)、PE缀合的抗人CD105(eBioscience，San Diego，CA)、FITC缀合的抗人CD29(eBioscience，SanDiego，CA)、Cy7-PE缀合的抗人CD45(eBiosience)、PE缀合的抗人CD19(IQProducts，Groningen，The Netherlands)、PE缀合的抗人CD14Mab(IQProducts)、FITC缀合的抗人CD11b(IQProducts)和PE缀合的抗人CD34(IQProducts)或FITC缀合的抗人HLA-DR Mab(IQProducts)。孵育后在含有1％热灭活的FCS的冰冷PBS中洗涤细胞两次，重新悬浮于500μl 0.5％甲醛中，用FC-500流式细胞仪(BeckmanCoulter，Fullerton，CA)分析。
用质谱分析比较3D和2D培养的粘附细胞的蛋白谱-如上所述生产来自胎盘的源自2D和3D培养程序的ASC。简言之，通过在增湿5％ CO₂环境(atmosphere)下于37℃在175cm²培养瓶中培养0.3-0.75×10⁶个细胞4天直至达到60-80％汇合来生产2D培养物。通过在含有2000个载体的生物反应器中接种2-10×10⁶个细胞/克并培养18天来生产3D培养物。收获后洗涤细胞(x3)以除去所有血清，沉淀并冷冻。根据厂商的方案，从沉淀物分离蛋白质[使用Tri试剂盒(Sigma，SaintLouis，USA)，用胰蛋白酶消化并用iTRAQ试剂标记(AppliedBiosciences，Foster City，CA)]。简言之，iTRAQ试剂为非聚合物的同量异位标记试剂。用四种同量异位的同位素编码标记中的一种经由其N末端和/或赖氨酸侧链标记每一样品中的肽。混合四个经标记的样品，用质谱法分析肽。在肽片段上的每种标记释放独特的质量报告离子，因此，四种报告离子的比值给出样品中特定肽的相对丰度(资料见：http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf)。
在Smoler蛋白质组中心(department of Biology，Technion，Haifa，Israel)用LC-MS/MS在QTOF-Premier(Waters，San Francisco，CA)上实施源自胎盘的ASC的2D培养物对3D培养物的蛋白质组分析，且通过Pep-Miner软件[Beer，I.等，Proteomics，4，950-60(2004)]针对nr数据库的人类部分进行鉴别和分析。被分析的蛋白质有：核内不均一核糖核蛋白H1(Hnrph1，GeneBank登录号NP_005511)、H2A组蛋白家族(H2AF，GeneBank登录号NP_034566.1)、真核细胞翻译延伸因子2(EEEF2，GeneBank登录号NP_031933.1)、网钙结合蛋白3、EF-手形钙结合结构域(RCN2，GeneBank登录号NP 065701)、CD44抗原同种型2前体(GeneBank登录号NP_001001389、钙调理蛋白蛋白1碱性平滑肌(CNN1，GeneBank登录号NP_001290)、3磷酸腺苷5磷酰硫酸合成酶2同种型a(Papss2，GeneBank登录号NP_004661)、核糖体蛋白L7a(rpL7a，GeneBank登录号NP_000963)和醛脱氢酶X(ALDH X，GeneBank登录号P47738)。每一实验进行2次。因为分析的特性，每一蛋白质按照出现在样品中的肽数目来分析(在每一次分析中蛋白质出现2-20次)。
用ELISA比较3D和2D培养的粘附细胞分泌的蛋白质-如上所述生产来自胎盘的源自2D和3D培养方法的ASC，且3D培养持续24天。此后收集条件培养基，在三个独立实验中，用ELISA(R&D系统，Minneapolis，MN)对Flt-3配体、IL-6、促血小板生成素(TPO)和干细胞因子(SCF)进行分析。结果标准化为1×10⁶个细胞/ml。
成骨细胞分化培养基-通过在由补充10％ FCS、100nM地塞米松、0.05mM抗坏血酸2-磷酸盐、10mM B-甘油磷酸盐的DMEM组成的成骨细胞分化培养基中培养细胞3周来评估成骨细胞分化。由Alizzarin Red S染色显示钙化基质，由碱性磷酸酶测定试剂盒(所有试剂来自Sigma-Aldrich，St.Lewis，MO)检测碱性磷酸酶。
结果
PluriX^TM生物反应器系统创造了生理样微环境
为了给粘附细胞提供有效的培养条件，用PluriX生物反应器(Pluristem，Haifa，Israel；载体在图1g中阐明，在接种前显示于图1b中)人工创造生理样环境(图1a中所述)。如图1c-f所示，骨髓产生的3D-ASC细胞在3D基质上成功培养并在接种后扩增20天(图1b-c，分别放大x150和250)和40天(图1c-d，分别放大x350和500)。
生长在PluriX生物反应器系统中的细胞显著扩增-不同生产批次的源自胎盘的3D-ASC细胞在PluriX生物反应器系统中生长。接种密度为13,300个细胞/载体(至总量为2×10⁶个细胞)。接种14天后，细胞密度增加到15倍，达到大约200,000个细胞/载体(图2)，或者说在150载体的生物反应器中30×10⁶。在不同的实验中，将细胞以1.5×10⁴细胞/ml密度接种到生物反应器，接种30天后，载体含有超过50倍的更大的细胞数量，即大约0.5×10⁶个细胞/载体或0.5×10⁷个细胞/ml。在各种水平生长柱的载体上的细胞密度一致，说明氧和营养素均一传递到细胞。由此证明3D培养系统为高密度间充质细胞培养物的生长和长期维持提供支持条件，所述细胞培养物可以有效生长到足以用于支持移入和成功移植目的的量。
3D-ASC显示独特的膜标记特征 - 为了确定可溶性分子分泌谱及蛋白质产生(通过模拟骨环境的3D培养方法来实施)的差异，进行了FAC分析。如图3a所示，细胞标记的FACS分析描述的是，3D-ASC表现出与在2D条件中生长的粘附细胞不同的标记表达型式。与3D培养的细胞相比，2D培养的细胞表达明显更高水平的阳性膜标记CD90、CD105、CD73和CD29膜标记。例如，3D培养的细胞显示56％的CD105表达，对比2D培养的细胞为87％。2D和3D二者胎盘培养物的ASC都不表达任何造血膜标记(图3b)。
3D-ASC显示独特的可溶性因子谱-造血龛包括产生丰富细胞因子、趋化因子和生长因子的支持细胞。为了进一步确定2D和3D培养的ASC之间的差别，通过ELISA得到2D和3D ASC培养物条件培养基中四种主要的造血分泌蛋白谱。图4a-c显示生长在3D条件的细胞产生含更高水平的Flt-3配体(图4a)、IL-60(图4b)和SCF(图4c)的条件培养基，而在2D培养物的条件培养基中检测到较低水平的IL-6和接近零水平的Flt-3配体和SCF。在两种培养物中促血小板生成素(TPO)产量都很低并不相上下。
3D-ASC在质谱分析中显示独特的蛋白谱-为了进一步确定2D和3D培养的ASC之间的差异，用质谱分析这些细胞的蛋白谱。图4d表示2D和3D培养的ASC展现出明显不同的蛋白质表达谱。如下表1所示，3D培养的细胞表现出更高的H2AF和ALDH X表达水平(分别高出超过9和12倍)和更高的EEEF2、RCN2和CNN1蛋白水平(分别为大约3、2.5和2倍)。另外，3D培养的细胞展现大约一半的蛋白Hnrph1和CD44抗原同种型2前体表达水平和大约三分之一的Papss2和rpL7a表达水平。
表1

3D-ASC具有分化为成骨细胞的能力 - 为了进一步表示3D-ASC的特征，在成骨细胞分化培养基中将细胞培养3周。此后实施钙沉淀。分化的细胞显示产生了钙(图5a-b中的红色所描述)，反之对照细胞维持成纤维细胞样表型并表明没有矿化(图5c-d)。这些结果表明源自胎盘的3D-ASC具有体外分化为成骨细胞的能力。
实施例2
源自胎盘的3D-ASC改进HSC移入的能力评估
通过在亚致死辐射或化疗预处理的免疫缺陷NOD-SCID小鼠中检测人造血细胞(hCD45+)水平，来评估3D-ASC支持HSC移入。
材料和实验方法
分离CD34+细胞-在分娩期间于无菌条件下取脐带血样品(BneiZion Medical Center，Haifa，Israel)，用Lymphoprep(Axis-Shield PoC As，Oslo，Norway)密度梯度离心分层单核细胞并冷冻保存。洗涤解冻的单核细胞并用抗CD34抗体孵育，用midi MACS(Miltenyl Biotech，Bergish Gladbach，Germany)分离。将来自一个以上样品的细胞合并达到所需的量(50,000-100,000个细胞)。
在经辐射小鼠中检测移植的细胞-在无菌开放系统笼中供养7周龄雄性和雌性NOD-SCID小鼠(NOD-CB 17-Prkdcscid/J；Harlan/Weizmann Inst.，Rehovot Israel)，给予无菌饮食和高压灭菌的酸性水。亚致死(350 cGy)辐射小鼠，此后(辐射后48小时)通过静脉注射至尾静脉，移植50,000-100,000个hCD34⁺细胞，加上或不加另外的源自胎盘或脂肪组织的ASC(0.5×10⁶-1×10⁶)(每组3-7只小鼠)。移植4-6周后，脱臼处死小鼠，用FACS缓冲液(50ml PBS，5ml FBS，0.5ml叠氮钠5％)从大腿骨和胫骨两处冲洗收集BM。通过流式细胞术检测小鼠BM中的人细胞，通过使细胞与抗人CD45-FITC(IQ Products，Groningen，The Netherlands)孵育，产生在处理的NOD-SCID小鼠中表达人和鼠CD45造血细胞标记的细胞百分比。明确的人移入最低阀限指定为0.5％。
化疗处理的小鼠中移植细胞的检测-如上述用于辐射小鼠的一样供养的6.5周龄雄性NOD-SCID小鼠(NOD.CB17/JhkiHsd-scid；Harlan，Rehovot Israel)接受白消安(25mg/kg-连续2天)腹膜内注射。第二次注射白消安2天后，单用CD34+细胞或与从胎盘产生的0.5×10⁶个ASC一起注射小鼠。移植后3.5周，处死小鼠，如上文对辐射小鼠所述测定人造血细胞的存在情况。
结果
3D-ASC改进辐射小鼠的HSC移入-在经辐射NOD-SCID小鼠中共同移植人CD34+造血细胞和源自胎盘或脂肪组织的3D-ASC。在共同移植之后4周评估移入效率，并与单用HSC移植的小鼠比较。如表2和图6所示，与单用UCB CD34+细胞处理的小鼠比较，3D-ASC和UCB CD34+细胞共同移植导致移入率高相当多及受者小鼠BM中人细胞的水平高相当多。
表2