技术领域
本发明涉及多糖食品分离提纯技术领域，具体涉及一种用于产业化生产β-葡聚糖的纯化方法以及β-葡聚糖。
背景技术
β-葡聚糖是一种可溶性食物纤维，β-1.3，β-1.4糖昔键连接起来的粘性多聚葡聚糖，是一种非淀粉多糖，按其溶解性分可为水溶性和水不溶性两类。在粮食中，β-葡聚糖是种子构成胚乳细胞壁的主要成分，而且几乎在整个种子中分布。
β-葡聚糖具有调节血糖、降低胆固醇、提高免疫力、抗肿瘤等作用。不同的生物材料由于其结构成分的差异，导致提取的质量和效率不同。
目前，从粮食中提取β-葡聚糖的报道较少，一般多为从谷物中提取β-葡聚糖，提取方法多为利用水、酸化水或碱溶液作为溶剂将全部碾碎的谷物制成浆液，再通过过滤、离心和乙醇沉淀的技术来处理这些浆液以分离各种组分。以上方法存在的技术问题主要有：(1)水不溶性β-葡聚糖的严重流失；(2)提纯β-葡聚糖的得率较低；(3)提取物中混杂的较多淀粉和蛋白质，造成β-葡聚糖的纯度大大下降；(4)工艺路线复杂，难以工业化应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的一个目的是提供一种用于产业化生产β-葡聚糖的纯化方法，以解决现有β-葡聚糖得率低、纯度低、提纯工艺复杂的问题。本发明的另一个目的是提供一种β-葡聚糖，其纯度高，制备 工艺简单。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于产业化生产β-葡聚糖的纯化方法，包括：
(1)将粉碎后的粮食作物用无水乙醇进行加热回流提取处理，将提取液过滤后得到第一滤液和第一滤渣，将第一滤渣进行脱溶处理；
(2)将经脱溶处理后的第一滤渣加水混合，并进行离心分离，得到第二滤液；
(3)将所述第一滤液和所述第二滤液合并后浓缩至原体积的1/5～1/10；然后向浓缩液中加入2U/g～8U/g的淀粉酶，反应体系持续升温至65～75℃，调节溶液pH至3～5，离心分离，收集滤液，重复此过程1-3次；再次调节滤液的pH至8～10，加入2U/g～6U/g的蛋白酶，在36～37.5℃条件下恒温水浴2～3h；在温度为90～100℃的条件下进行灭酶，冷却至室温后离心分离，得到第三滤液；以及
(4)将第三滤液进行除杂处理，得到β-葡聚糖。
本发明用无水乙醇对粉碎后的粮食作物进行加热回流提取的目的在于，提取出水不溶性β-葡聚糖，避免了因直接用水提取而导致水不溶性β-葡聚糖不溶于水而造成水不不溶性β-葡聚糖流失，从而提高β-葡聚糖的得率。
得到的第一滤液即为水不溶性β-葡聚糖，并且将第一滤渣经过脱溶处理后进一步提纯β-葡聚糖，后续提纯主要针对水溶性β-葡聚糖进行的。在步骤(2)中涉及的脱溶处理工艺，其目的在于除去步骤(1)中使用的无水乙醇，避免杂质的引入，从而保证最终产品纯度。
本发明将经过两次提取后的第一滤液和第二滤液合并，并用淀粉酶和蛋白酶进行酶解，去除合并滤液中的淀粉和蛋白质，此方式与现有提取工艺相 比，方法简单、易于控制，并且提纯效果好。
本发明在步骤(3)中第一次调节溶液pH的目的在于，使浓缩后的滤液在酸性环境下沉淀析出混合有淀粉和蛋白质的β-葡聚糖。同时，在淀粉酶的作用下，混合在滤液中的淀粉被酶解，使得淀粉与β-葡聚糖分离，对β-葡聚糖进行分离提纯。本发明的淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶和异淀粉酶中的一种或多种。优选地，本发明的淀粉酶为α-淀粉酶。
本发明在步骤(3)中第二次调节pH的目的在于，为蛋白酶提供碱性的反应环境，从而酶解掉混合在滤液中的蛋白质，进一步提纯分离β-葡聚糖。本发明的蛋白酶可以是胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶中的一种或多种。优选地，本发明的蛋白酶为胰蛋白酶。
本发明在酶解反应后灭酶，以去除滤液中的淀粉酶和蛋白酶，避免引入新的杂质，从而保证最终产品的纯度。
与现有提取工艺相比，本发明首先利用醇溶的方式，回收粮食作物中的水不溶性β-葡聚糖，避免了粮食作物中水不溶性β-葡聚糖的流失，然后通过酶解去除作物中的淀粉和蛋白质，能耗低、分离效果好。本发明工艺简单、易于操作控制、成本低、有利于工业化生产。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述步骤(1)包括以下具体步骤：
(11)将粉碎后的粮食作物过100～500μm筛；
(12)取步骤(11)中的筛下物，在4～10倍体积量的无水乙醇中、在60℃～80℃下回流提取2～4h，冷却至室温后过滤，得到第一滤液和第一滤渣；以及
(13)将第一滤渣于30℃～60℃下减压脱溶15～30h。
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述步骤(2)包括以下具体步骤：
将经脱溶处理后的第一滤渣加入至6～10倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并调至pH至9～11，然后将溶液在30℃～60℃下搅拌20～40分钟，冷却至室温后离心分离，得到第二滤液。
优选地，在步骤(2)用0.5～3mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液的pH至9～11。本发明通过调节溶液pH至9～11，使得水溶性β-葡聚糖完全溶解出来。
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述步骤(4)包括以下具体步骤：
(41)将第三滤液中加入活性炭并在温度为20～60℃的条件下脱色处理20～40min，将收集的洗淋液在3～5℃下静置，得到粗提液；
(42)将粗提液加入到3～5倍体积的去离子水中，加热至30℃～50℃，搅拌溶解，然后加入沉淀剂溶液在30℃～50℃搅拌10～30min，离心分离；以及
(43)将步骤(42)中离心分离得到的沉淀在10℃～60℃下减压脱溶10～35h，得到β-葡聚糖。
在去除淀粉以及蛋白质等主要杂质后，本发明通过活性炭、沉淀剂溶液继续分离提纯，进一步提高β-葡聚糖的纯度，提高最终产品品质。
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述步骤(42)中的沉淀剂溶液为乙醇、异丙醇和硫酸铵中的一种或几种。
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述步骤(43)中，将沉淀减压脱溶处理后的物料过500～800μm筛。
进一步地，在本法明较佳的实施例中，上述离心分离的转速为1000～4000转/min。
一种β-葡聚糖，是将粮食作物根据上述的纯化方法提取而成。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用醇溶的方式，回收水不溶性β-葡聚糖，以提高得率；
2、本发明采用酶法脱淀粉和蛋白的方式，具有能耗低，单级分离效率高，分离过程简单，不污染环境等优点；
3、选用溶剂沉淀法进一步提纯β-葡聚糖，能够明显提高β-葡聚糖的纯度；
4、本发明的工艺简单，操作易于控制，成本低，易于工业化。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，本发明实施例所指的“减压脱溶”是指在低于常压下进行脱溶处理，具体压力大小不做限制。
实施例1：
本实施例的纯化方法包括以下步骤：
①将粮食籽粒净选，淘洗，去除杂质，进行干燥，并控制水分在<8％；
②将粮食经磨粉机粉碎后，过100μm筛；
③将步骤②中的碎粉用4倍体积的50％(体积百分比，下同)无水乙醇，在60℃下回流提取4个小时，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同时在90℃下灭 活各种酶；冷却至室温后，过滤，收集滤液；过滤后得到的滤渣用2倍体积量的无水乙醇继续提取15分钟，过滤，收集滤液并将两次提取的滤液合并，得到第一滤液；将两次提取后得到的第一滤渣于30℃下减压脱溶30小时，使粮食碎粉中的乙醇完全挥发而达到脱溶目的。
④将步骤③中脱溶的第一滤渣加入到6倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH 9，于30℃下搅拌40分钟，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷却至室温后，离心分离，收集的滤液；将离心分离所得沉淀继续加入到2倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH 9，于30℃下搅拌40分钟，冷却、离心分离，并将两次合并，得到第二滤液。
⑤合并第一滤液和第二滤液，将滤液浓缩至原体积的1/5，加入4U/g的α-淀粉酶，反应体系持续升温至70℃，再用3mol/L盐酸溶液调节滤液pH至4.5，离心分离，收集滤液。
⑥用2mol/L氢氧化钠溶液调节步骤⑤中的滤液至pH 9，加入2U/g的胰蛋白酶，37℃条件下，恒温水浴2h，酶解后90°加热灭酶，冷却至室温后离心分离，收集滤液为第三滤液。
⑦将0.5％的活性炭加入至第三滤液中，调节温度在20℃，脱色40min，收集淋洗液，4℃下静置过夜，得粗提液。
⑧将步骤⑦的粗提液加入到3倍体积的去离子水中，加热至30℃，搅拌溶解，然后加入同体积的无水乙醇，于45℃搅拌20分钟，离心分离；沉淀于60℃下减压脱溶10小时，过800μm筛，得精制β-葡聚糖。
经“β-葡聚糖含量测定方法”分析，测定该精制β-葡聚糖的纯度为72％，得率为9.9％。
实施例2：
本实施例的纯化方法包括以下步骤：
①将粮食籽粒净选，淘洗，去除杂质，进行干燥，并控制水分在<8％；
②将粮食经磨粉机粉碎后，过100μm筛；
③将步骤②中的碎粉用4倍体积的65％无水乙醇，在70℃下回流提取3个小时，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同时在90℃下灭活各种酶；冷却至室温后，过滤，收集滤液；过滤后得到的滤渣用5倍体积量的无水乙醇继续提取15分钟，过滤，收集滤液并将两次提取的滤液合并，得到第一滤液；将两次提取后得到的第一滤渣于40℃下减压脱溶25小时，使粮食碎粉中的乙醇完全挥发而达到脱溶目的。
④将步骤③中脱溶的第一滤渣加入到8倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并用3mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于40℃下搅拌30分钟，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷却至室温后，离心分离，收集的滤液；将离心分离所得沉淀继续加入到8倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，用3mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于40℃下搅拌30分钟，冷却、离心分离，并将两次合并，得到第二滤液。
⑤合并第一滤液和第二滤液，将滤液浓缩至原体积的1/8，加入4U/g的α-淀粉酶，反应体系持续升温至70℃，再用0.5mol/L盐酸溶液调节滤液pH至4.5，离心分离，收集滤液。
⑥用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节步骤⑤中的滤液至pH 10，加入2U/g的胰蛋白酶，37℃条件下，恒温水浴2.5h，酶解后100°加热灭酶，冷却至室温后离心分离，收集滤液为第三滤液。
⑦将2％的活性炭加入至第三滤液中，调节温度在40℃，脱色20min，收集淋洗液，3℃下静置过夜，得粗提液。
⑧将步骤⑦的粗提液加入到4倍体积的去离子水中，加热至40℃，搅拌溶解，然后加入同体积的无水乙醇，于40℃搅拌20分钟，离心分离；沉淀于10℃下减压脱溶35小时，过500μm筛，得精制β-葡聚糖。
经“β-葡聚糖含量测定方法”分析，测定该精制β-葡聚糖的纯度为81％，得率为10.7％。
实施例3：
本实施例的纯化方法包括以下步骤：
①将粮食籽粒净选，淘洗，去除杂质，进行干燥，并控制水分在<8％；
②将粮食经磨粉机粉碎后，过400μm筛；
③将步骤②中的碎粉用10倍体积的80％无水乙醇，在80℃下回流提取2个小时，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同时在90℃下灭活各种酶；冷却至室温后，过滤，收集滤液；过滤后得到的滤渣用4倍体积量的无水乙醇继续提取20分钟，过滤，收集滤液并将两次提取的滤液合并，得到第一滤液；将两次提取后得到的第一滤渣于50℃下减压脱溶25小时，使粮食碎粉中的乙醇完全挥发而达到脱溶目的。
④将步骤③中脱溶的第一滤渣加入到8倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并用0.5mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于50℃下搅拌25分钟，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷却至室温后，离心分离，收集的滤液；将离心分离所得沉淀继续加入到2倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于50℃下搅拌25分钟，冷却、离心分离，并将两次合并，得到第二滤液。
⑤合并第一滤液和第二滤液，将滤液浓缩至原体积的1/10，加入4U/g的α-淀粉酶，反应体系持续升温至75℃，再用3mol/L盐酸溶液调节滤液pH至5，离心分离，收集滤液。加入α-淀粉酶进行酶解反应的过程进行两次。
⑥用2mol/L氢氧化钠溶液调节步骤⑤中的滤液至pH 8～10，加入2U/g的胰蛋白酶，36℃条件下，恒温水浴3h，酶解后90°加热灭酶，冷却至室温后离心分离，收集滤液为第三滤液。
⑦将2.5％的活性炭加入至第三滤液中，调节温度在60℃，脱色40min，收集淋洗液，5℃下静置过夜，得粗提液。
⑧将步骤⑦的粗提液加入到3倍体积的去离子水中，加热至30℃，搅拌溶解，然后加入同体积的无水乙醇，于45℃搅拌20分钟，离心分离；沉淀于40℃下减压脱溶20小时，过800μm筛，得精制β-葡聚糖。
经“β-葡聚糖含量测定方法”分析，测定该精制β-葡聚糖的纯度为61％，得率为7.8％。
实施例4：
本实施例的纯化方法包括以下步骤：
①将粮食籽粒净选，淘洗，去除杂质，进行干燥，并控制水分在<8％；
②将粮食经磨粉机粉碎后，过500μm筛；
③将步骤②中的碎粉用9倍体积的50％无水乙醇，在60℃下回流提取4个小时，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同时在90℃下灭活各种酶；冷却至室温后，过滤，收集滤液；过滤后得到的滤渣用5倍体积量的无水乙醇继续提取20分钟，过滤，收集滤液并将两次提取的滤液合并，得到第一滤液；将 两次提取后得到的第一滤渣于45℃下减压脱溶18小时，使粮食碎粉中的乙醇完全挥发而达到脱溶目的。
④将步骤③中脱溶的第一滤渣加入到8倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并用2.5mol/L氢氧化钠溶液调至pH 11，于30℃下搅拌40分钟，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷却至室温后，离心分离，收集的滤液；将离心分离所得沉淀继续加入到4倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，用2.5mol/L氢氧化钠溶液调至pH 11，于50℃下搅拌25分钟，冷却、离心分离，并将两次合并，得到第二滤液。
⑤合并第一滤液和第二滤液，将滤液浓缩至原体积的1/10，加入4U/g的α-淀粉酶，反应体系持续升温至75℃，再用2.5mol/L盐酸溶液调节滤液pH至5，离心分离，收集滤液。
⑥用2mol/L氢氧化钠溶液调节步骤⑤中的滤液至pH 9，加入2U/g的胰蛋白酶，37.5℃条件下，恒温水浴2.5h，酶解后90°加热灭酶，冷却至室温后离心分离，收集滤液为第三滤液。
⑦将2％的活性炭加入至第三滤液中，调节温度在60℃，脱色20min，收集淋洗液，4℃下静置过夜，得粗提液。
⑧将步骤⑦的粗提液加入到4倍体积的去离子水中，加热至50℃，搅拌溶解，然后加入同体积的硫酸胺溶液，于45℃搅拌15分钟，离心分离；沉淀于50℃下减压脱溶20小时，过700μm筛，得精制β-葡聚糖。
经“β-葡聚糖含量测定方法”分析，测定该精制β-葡聚糖的纯度为89％，得率为11.2％。
实施例5：
本实施例的纯化方法包括以下步骤：
①将粮食籽粒净选，淘洗，去除杂质，进行干燥，并控制水分在<8％；
②将粮食经磨粉机粉碎后，过400μm筛；
③将步骤②中的碎粉用5倍体积的80％无水乙醇，在75℃下回流提取3个小时，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同时在90℃下灭活各种酶；冷却至室温后，过滤，收集滤液；过滤后得到的滤渣用6倍体积量的无水乙醇继续提取20分钟，过滤，收集滤液并将两次提取的滤液合并，得到第一滤液；将两次提取后得到的第一滤渣于50℃下减压脱溶25小时，使粮食碎粉中的乙醇完全挥发而达到脱溶目的。
④将步骤③中脱溶的第一滤渣加入到6倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，并用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于50℃下搅拌25分钟，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷却至室温后，离心分离，收集的滤液；将离心分离所得沉淀继续加入到6倍体积量的水中搅拌混匀形成溶液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH 10，于45℃下搅拌35分钟，冷却、离心分离，并将两次合并，得到第二滤液。
⑤合并第一滤液和第二滤液，将滤液浓缩至原体积的1/8，加入4U/g的α-淀粉酶，反应体系持续升温至70℃，再用4mol/L盐酸溶液调节滤液pH至3，离心分离，收集滤液。此过程进行3次。
⑥用2mol/L氢氧化钠溶液调节步骤⑤中的滤液至pH 8，加入2U/g的胰蛋白酶，37℃条件下，恒温水浴2h，酶解后90°加热灭酶，冷却至室温后离心分离，收集滤液为第三滤液。
⑦将0.5％的活性炭加入至第三滤液中，调节温度在40℃，脱色25min，收集淋洗液，4℃下静置过夜，得粗提液。
⑧将步骤⑦的粗提液加入到4倍体积的去离子水中，加热至40℃，搅拌溶解，然后加入同体积的无水乙醇和异丙醇的混合溶液，于30℃搅拌30分钟，离心分离；沉淀于30℃下减压脱溶25小时，过600μm筛，得精制β-葡聚糖。
经“β-葡聚糖含量测定方法”分析，测定该精制β-葡聚糖的纯度为78％，得率为12.7％。
需要说明的是，本发明实施例中的粮食可以是稻谷、小麦、玉米、西红柿或青稞。优选地，本发明实施例采用的粮食籽粒为使用申请号为201610347813.7的植物增效剂种植出的稻谷，其富含丰富的β-葡聚糖，在提取过程中，能够获得相较于普通作物更多的β-葡聚糖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。