一种 β- 内酰胺酶的检测方法及检测试纸 【技术领域】
本发明涉及一种检测方法， 具体涉及一种 β- 内酰胺酶的检测方法及检测试纸。背景技术 ：
日益严重的细菌耐药性已成为一个全球共同面临的问题。 细菌耐药的机制有很多 方面， β- 内酰胺酶是革兰阴性杆菌耐 β- 内酰胺类抗生素的最普遍机制。β- 内酰胺酶早 在 β- 内酰胺类抗生素应用于临床前便已发现， 它并不是细菌生长所必需的， 它的唯一功 能是水解 β- 内酰胺环。
至今发现的 β- 内酰胺酶已上千种， 在临床耐药细菌中广泛存在。 β- 内酰胺酶分 类比较多， 按照其生化特征可分为五类 ：
第一类为头孢菌素水解酶 ( 即 Amp-C 酶 )， 产生菌主要系革兰阴性菌， 如假单胞菌、 肠杆菌、 不动杆菌和克雷伯杆菌等。 AmpC 酶可分为诱导型、 结构型和质粒介导型。 其特性为 ： 不被克拉维酸、 舒巴坦、 他唑巴坦抑制， 可被氯唑西林抑制 ； 优先选择的底物为头孢菌素类 抗生素 ； 对头霉烯类抗生素 ( 如头孢西丁 ) 高水平耐药 ； 部分 Amp-C 酶表达可被克拉维酸、 第三代头孢菌素诱导。 治疗产 AmpC 酶细菌感染的药物， 主要有碳青霉烯类 ( 亚胺培南 )， 第 四代头孢菌素 ( 头孢吡肟， 头孢匹罗 ) 等。
第二类为超广谱酶 ( 包括由沙雷菌属与肠杆菌属产生的非金属碳青霉烯酶 )。其 特性为 ： 能水解青霉素类、 一二三代头孢菌素、 单环 β- 内酰胺类 ( 如氨曲南 )， 能被 β- 内 酰胺酶抑制剂抑制。治疗产超广谱酶细菌感染的药物有碳青霉烯类 ( 非金属碳青霉烯酶除 外 )、 青霉烯类、 头霉烯类以及 β- 内酰胺类 /β- 内酰胺酶抑制剂。头孢吡肟相当部分稳 定， 最有效的药物是碳青酶烯类。应避免第三代头孢菌素单药治疗。对于非金属碳青霉烯 酶， 一般避开选用 β- 内酰胺类抗生素治疗。
第三类为金属酶， 由假单胞菌属、 脆弱拟杆菌属、 产黄菌属、 沙雷菌属及嗜麦芽黄 单胞杆菌属产生。能水解各种 β- 内酰胺抗生素， 包括青霉素类、 头孢菌素类和碳青霉烯 类； 不被现有酶抑制剂抑制。选用药物进行治疗时一般避开 β- 内酰胺类抗生素。
第四类为耐酶抑制剂 β- 内酰胺酶 (IR-BLs)， 其特点是对阿莫西林、 替卡西林及 其酶抑制剂复合制剂耐药， 可选用广谱 β- 内酰胺抗生素治疗。
第五类为青霉素酶和广谱酶， 其特点是对青霉素及头孢一二代 β- 内酰胺类抗生 素耐药。可选用广谱 β- 内酰胺抗生素和酶抑制剂治疗。
控制耐药菌蔓延非常重要的一个方面是选择合适的抗菌药物来避免耐药性的发 生。鉴于 β- 内酰胺酶在细菌耐药中的广泛存在， 以及不同类型的 β- 内酰胺酶有不同的 用药原则， 很有必要对 β- 内酰胺酶进行快速检测及分类， 以选择合适的抗菌药物。
现在使用的 β- 内酰胺酶检测方法主要有微生物法、 碘量法、 纸片酸度定量法和 产色头孢菌素法。微生物法由于特异性差、 灵敏度低， 现在基本上很少被采用 ； 碘量法常用 于检测淋病奈瑟氏菌 ； 纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、 流感嗜血杆菌和葡萄 球菌 ； 产色头孢菌素法是目前检测 β- 内酰胺酶最常用的方法。产色头孢菌素法是利用产色头孢菌素如头孢硝噻吩 (nitrocefin) 的 β- 内酰胺环被 β- 内酰胺酶破坏后， 其颜色由 浅黄色变为粉红色， 以此来判定细菌是否产 β- 内酰胺酶。
检测 β- 内酰胺酶底物轮廓的方法主要有细菌培养法、 分光光度法和结合反应竞 争法三种。前两种操作较繁琐、 耗时长， 只在研究室使用。申请号为 2003801071 85.6 的专 利详细介绍了后一种方法， 即将将待检底物和显色底物进行混合后， 再同 β- 内酰胺酶进 行反应的方法， 由于待检底物同 β- 内酰胺酶的亲和力绝大多数低于显色底物同 β- 内酰 胺酶的亲和力， 因而灵敏度低， 假阴性率高， 结果的可信度低。
目前所有这些检测方法用于检测临床标本时， 从收集临床标本经细菌分离、 扩增 到检测出结果至少需要 72h。迄今尚无对临床标本细菌的 β- 内酰胺酶及其底物特性进行 快速检测的方法和产品。 发明内容 本发明的目的是克服现有技术检测 β- 内酰胺酶假阴性率高、 消耗时间长的缺 陷， 提供一种灵敏度高、 方便快捷的 β- 内酰胺酶的检测方法。
为了实现上述发明目的， 本发明采用以下技术方案 ：
一种 β- 内酰胺酶的检测方法， 包括以下步骤 ：
步骤 (1) ： 对可能含微生物的样本培养 2-24 小时 ；
步骤 (2) ： 用产色头孢菌素法对样本进行 β- 内酰胺酶的检测。
优选地， 还包括步骤 (3) ： 用底物优势结合法检测所述 β- 内酰胺酶的底物特性。
所述步骤 (1) 优选在 16℃ -38℃、 0-300rpm 条件下培养。
所述步骤 (1) 可以加入抑制某些微生物生长的药物进行选择性培养。
所述抑制微生物生长的药物可以为青霉素、 阿莫西林、 青霉素 G 钾、 青霉素 G 钠、 长 效西林、 苯唑青霉素、 氯唑青霉素、 氨苄青霉素、 羟氨苄青霉素、 羧苄青霉素、 氧哌嗪青霉素、 呋苄青霉素、 美西林、 匹美西林、 头孢噻吩、 头孢噻唑、 头孢唑林、 头孢乙腈、 头孢匹林、 头孢 替唑， 头孢来星、 头孢氨苄、 头孢羟氨苄、 头孢拉定、 头孢曲嗪、 头孢沙定、 头孢克洛、 氯碳头 孢， 头孢孟多、 头孢替安、 头孢尼西、 头孢呋辛、 头孢西丁中的一种或两种以上的组合。
所述药物浓度优选为 0.5 ～ 32ug/ml。
步骤 (3) 中所述检测方法为 ： 使 β- 内酰胺酶先结合待检底物， 再与显色底物结合 显色， 所述待检底物的浓度应高于所述显色剂浓度， 优选所述检测底物的浓度为所述显色 剂浓度的 10 倍以上。
步骤 (3) 所述待检底物优选为青霉素类抗生素、 第一代头孢菌素、 第二代头孢菌 素、 第三代头孢菌素、 第四代头孢菌素、 青霉烯类抗生素、 单环 β- 内酰胺类抗生素、 单环 β- 内酰胺类抗生素、 金属离子螯合剂、 氯唑西林中的一种或任意两种以上的组合。
对步骤 (3) 的检测结果按表 1 所示进行判断， 从而选择合适的抗菌药物。 待检底物 为 A、 B、 C、 D、 E 中的任何一种或多种， 以及任何方式的组合。检测结果按照表 1 进行分类 ：
表 1.β- 内酰胺酶的分类
注： +， 待测药物为 β- 内酰胺酶的底物 ； -， 待测药物不是 β- 内酰胺酶的底物。
抗生素 A 可以为任何一种或几种青霉素类抗生素， 如青霉素、 阿莫西林、 青霉素 G 钾、 青霉素 G 钠、 长效西林、 苯唑青霉素 ( 新青 II 号 )、 氯唑青霉素、 氨苄青霉素、 羟氨苄青霉 素等、 羧苄青霉素、 氧哌嗪青霉素、 呋苄青霉素、 美西林及其酯匹美西林等等。
也可以为任何一种或几种第一二代头孢菌素， 如头孢噻吩、 头孢噻唑、 头孢唑林、 头孢乙腈、 头孢匹林、 头孢替唑， 头孢来星、 头孢氨苄、 头孢羟氨苄、 头孢拉定、 头孢曲嗪、 头 孢沙定、 头孢克洛、 氯碳头孢， 头孢孟多、 头孢替安、 头孢尼西、 头孢呋辛、 头孢西丁， 头孢美 唑、 头孢呋辛乙酰氧甲酯、 头孢替安环己氧羰氧基乙酯等。
还可以为青霉素类抗生素和第一二代头孢菌素的任何组合。
抗生素 B 可以为任何一种或几种第三、 四代头孢菌素， 如头孢噻肟、 头孢唑肟、 头 孢甲肟、 头孢曲松、 头孢唑南、 头孢地秦、 头孢他啶、 头孢咪唑、 头孢哌酮、 头孢匹胺、 头孢匹 罗、 头孢吡肟、 头孢替坦、 头孢拉宗、 头孢米诺、 拉氧头孢、 氟氧头孢、 头孢克肟、 头孢布汀、 头 孢地尼、 头孢特仑特戊酰氧基甲酯、 头孢泊肟异丙氧羰氧基乙酯、 头孢他美特戊酰氧基甲 酯、 头孢地灵特戊酰氧基甲酯、 头孢吡肟、 头孢噻利、 头孢匹罗、 头孢唑喃钠、 头孢唑兰等。
也可以为任何一种或几种其它广谱 β- 内酰胺抗生素， 包括 ： 碳青霉烯类抗生素 如亚胺培南、 亚胺培南 / 西司他汀、 帕尼培南、 帕尼培南 /N- 苯甲酰 β 丙氨酸、 美罗培南、 欧 他培南等 ； 青霉烯类抗生素如呋罗培南 ； 单环 β- 内酰胺类抗生素如氨曲南和卡芦莫南等。
抗生素 C 可以为任何一种或几种 β- 内酰胺酶抑制剂， 如棒酸、 舒巴坦、 他唑巴坦 等。
也可以为一种或几种 β- 内酰胺酶抑制剂同任何其它 β- 内酰胺类抗生素的任何 组合。
药物 D 可以为任何一种或几种金属离子螯合剂， 如三聚磷酸钠、 多聚磷酸钠、 六偏 磷酸钠、 焦磷酸钠、 乙二胺四乙酸 (ED-TA)、 氮川三乙酸 (NTA)、 二乙撑三胺五乙酸 (DTPA)、 N- 羟乙基乙胺三乙酸 (HEDTA)、 乙二醇 - 双 -(B- 氨基乙醚 )-N， N- 四乙酸 (EGTA)、 氨基三亚 甲基膦酸 (ATMP)、 1- 羟乙叉 -1， 1- 二膦酸 (HEDP)、 乙二胺四甲叉膦酸 (EDTMP)、 二乙烯三胺 五甲叉膦酸 (DTPMP)、 氨基三甲叉膦酸 (ATP)、 葡萄糖酸、 聚丙烯酸 (PAA)、 马来酸 (MAO) 等
所述抗生素 E 可以为氯唑西林。
根据步骤 (3) 检测 β- 内酰胺酶的底物特性的结果及表 1， 对 β- 内酰胺酶进行分 类， 从而选择合适的抗菌药物来避免耐药性的发生， 指导临床用药。
步骤 (3) 所述显色底物包括头孢硝噻吩及其生理上可以接受的盐， 或为头孢硝噻 吩的衍生物， 即包括 3-[2， 4- 二硝基苯乙烯基 ]-7-(2- 噻嗯基乙酰基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧基亚氨基 ) 乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝 基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧 基亚氨基 ) 乙酰氨基 ]-3-(2， 6- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻 唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧基亚氨基 ) 乙酰氨基 ]-3-(4- 硝基苯乙烯基 )-3- 头 孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧基亚氨基 ) 乙酰氨 基 ]-3-(2， 4- 二氰基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧 基 -1- 甲 基 乙 氧 基 亚 氨 基 ) 乙 酰 氨 基 ]-3-(4- 氰 基 苯 乙 烯 基 )-3- 头 孢 环 -4- 羧 酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧基亚氨基 ) 乙酰氨基 ]-3-(2- 氰 基 苯 乙 烯 基 )-3- 头 孢 环 -4- 羧 酸、 7-[2-(1- 羧 基 -1- 甲 基 乙 氧 基 亚 氨 基 )-2-( 噻 唑 -4- 基 ) 乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基 噻唑 -4- 基 )-2-(1- 羧基 -1- 甲基乙氧基亚氨基 ) 乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝基苯乙烯 基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸 -1- 氧化物、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 甲氧基亚氨基乙酰 氨基 ]-3-(4- 硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 甲氧 基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻 唑 -4- 基 )-2- 甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2， 6- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2 氰基苯乙烯基 )-3- 头孢 环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝 基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲氧基亚氨基乙酰 氨基 ]-3-(2， 6- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧 基甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(4- 硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基 噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2- 硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧 酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二氰基苯乙 烯 基 )-3- 头 孢 环 -4- 羧 酸、 7-[2-(2- 氨 基 噻 唑 -4- 基 )-2- 羧 基 甲 氧 基 亚 氨 基 乙 酰 氨 基 ]-3-(4- 氰基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲 氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2- 氰基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-2- 羧基甲氧基 亚氨基 -2-( 噻唑 -4- 基 )- 乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝基苯乙烯基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸、 7-[2-(2- 氨基噻唑 -4- 基 )-2- 羧基甲氧基亚氨基乙酰氨基 ]-3-(2， 4- 二硝基苯乙烯 基 )-3- 头孢环 -4- 羧酸 -1 氧化物。
本发明还提供一种 β- 内酰胺酶检测试纸， 包含以下部分 ： 加样区、 检测区和显色 区。所述显色区含有显色底物 ； 所述检测区含有待检底物。
所述待检底物优选为青霉素类抗生素、 第一代头孢菌素、 第二代头孢菌素、 第三代 头孢菌素、 第四代头孢菌素、 青霉烯类抗生素、 单环 β- 内酰胺类抗生素、 金属离子螯合剂、 氯唑西林中的一种。
所述显色底物包括头孢硝噻吩及其生理上可以接受的盐， 或为头孢硝噻吩的衍生 物， 这些化合物在前面有详细的描述。
本发明还提供一种 β- 内酰胺酶检测多臂试纸， 包含两条以上所述 β- 内酰胺酶 检测试纸， 所述 β- 内酰胺酶检测试纸共用一个加样区。所述 β- 内酰胺酶检测多臂试纸优选的是每条试纸检测区含有的待检底物各不相同。 本发明还提供一种 β- 内酰胺酶检测试剂盒， 包含上述 β- 内酰胺酶检测试纸或 β- 内酰胺酶检测多臂试纸。
本发明通过对临床标本进行短时 ( 约 2-24 小时 ) 混合或选择性培养， 从而快速检 出产 β- 内酰胺酶耐药菌。然后对培养液进行短时乳化后， 通过扩散的方法， 使 β- 内酰胺 酶先同高浓度的待检底物结合， 再同显色底物接触， 大大提高了检出的灵敏性。此外， 在显 色滤纸上进行， 结果容易观察， 也有助于提高检测的灵敏度。
本发明所述的检测方法， 相对于现有的检测方法， 其优点在于 ：
1) 采用扩散原理， β- 内酰胺酶先结合较高浓度待检底物， 再接触较低浓度显色 底物的检测方法， 提高了检测的灵敏度。
2) 多个底物检测融合在一个多臂检测试纸条上， 一次加样就完成底物特性的检 测， 操作性强， 便于各臂间的比较， 提高了检测的准确性。
3) 本发明所述方法操作简便、 检测快速， 最快仅需 5 小时， 结果稳定， 具有广泛的 临床应用前景。
附图说明 图 1 示 β- 内酰胺酶检测试纸条 ；
1 为支撑材料， 2 为显色试纸片。
图 2 是本发明所述 β- 内酰胺酶的 6 臂检测试纸的示意图。
A-F ： 六臂的编号 ； 1 区为标签区， 用以标注臂号及底物 ； 2 区为显色区， 含显色底 物； 3 区待试底物区， 滤纸上含有待检底物 ； 4 区为中央加样区。
具体实施方式
实施例 1 ： β- 内酰胺酶检测试纸条的制备
结构见图 1 所示。1 为支撑材料， 其上黏贴的 2 为显色试纸片， 外用避光材料包装 及贴上标签。
显色试纸片的制作 ： 显色剂用稀释液配制成终浓度为 0.01 ～ 1mg/ml。滤纸片剪 成适当大小后， 显色试纸片可以为各种形状如圆形、 矩形等， 面积为 0.2 ～ 1.5cm2 为宜。用 显色液润湿， 干燥。干燥方法可以为 30-80℃短时烤干， 最好用冻干法。干燥后的纸片贴在 支撑材料上， 避光包装， 低温避光保存。6 个月内使用。
显色试纸片可以为各种形状如圆形、 矩形等， 面积为 0.2 ～ 1.5cm2 为宜。
实施例 2 ： β- 内酰胺酶多臂检测试纸的制备 ( 以 6 臂为例 )
结构如图 2 所示 ： A-F ： 六臂的编号。
每臂分 4 区 ： 1 为标签区， 用以标注臂号及底物 ； 2 区为显色区， 含头孢硝基酚 ； 3区 待试底物区， 滤纸上含有待检底物 ； 4 区为中央区加样区。
尺寸 ： 每臂长 2 ～ 4cm， 宽 0.5 ～ 1.5cm。
4区： 直径 0.5 ～ 1.0cm ； 宽 0.5 ～ 1.5cm。
3区： 长 0.5 ～ 1.5cm ； 宽 0.5 ～ 1.5cm。2区： 长 0.3 ～ 1.5cm， 宽 0.5 ～ 1.5cm。
1区： 长 0.5 ～ 1.5cm， 宽 0.5 ～ 1.5cm。
1 区注明内容 ： 臂号， 该臂 3 区药品中文或英文缩写。
步骤 1 ： 制作含药纸片 ：
3 区所有检测药品浓度要求 ： 要高于所用的显色剂浓度。优选检测底物的浓度为 显色剂浓度的 10 倍以上， 更优选倍数为 100 ～ 500 倍。
药品用稀释液配制成上述要求的浓度后， 参照实施例 1 所述方法制备含待检药物 试纸片。
步骤 2 ： 制作检测多臂试纸条
1) 将支持介质如塑料胶片制成六臂 ；
2) 六臂上贴上双面胶 ；
3) 依次粘贴标签纸 (1 区 )， 间隔 2 ～ 5mm， 贴显色纸片 (2 区 )， 覆盖 2 ～ 4mm 处粘 贴药物纸片 (3 区 )， 最后贴上中间的圆形滤纸片 ( 供加样用， 4 区 )， 圆形滤纸片要覆盖药物 纸片 (3 区 )2 ～ 4mm。药物纸片 (3 区 ) 未覆盖 2 区和 4 区部分为 3 ～ 8mm。
4) 压膜包装 ( 中心加样孔不能包膜 )， 膜透明。 5) 以其中的一臂为阳性对照， 该臂 3 区纸片不含待检药物， 故显色纸片 (2 区 ) 颜 色由浅黄变为粉红表示多臂试纸条有效。其它五臂 3 区纸片应该尽可能包含待检药物的一 种或几种。
步骤 3 ： 加样量的确定
经检测 ： 试纸条的吸水量大约为 50-100ul/cm2. 加样量要求液体刚好能扩散到 2 区， 并能湿润 2 区的 1/3 ～ 3/4 为宜。
实施例 3 ： 本发明所述试剂盒的制备
试剂盒包括的内容 ：
1、 细菌扩增瓶， 内含细菌快速扩增培养基粉末， 4-8℃保存。
2、 1.0mL 的 EP 管 ( 内含乳化剂溶菌酶、 短杆菌素、 多粘菌素中的一种或几种 )， 4-8℃保存。
3、 实施例 1 制备 β- 内酰胺酶检测试纸条， -20℃避光保存。
4、 实施例 2 制备的 β- 内酰胺酶型检测多臂试纸， -20℃避光保存。
实施例 4 ： 微生物的快速培养
步骤 1 ： 待检临床标本为固体 ( 如粪便 )、 半固体 ( 如痰液、 脓液 ) 及少量液体 ( 如 分泌物， 前列腺液 ) 时， 取适量蒸溜水或双蒸溜水或超纯水于培养瓶 ( 内含培养基粉末如高 营养肉汤 ) 内， 摇匀至培养基粉末完全溶解， 然后放入临床标本， 摇匀。
待检临床标本为大量液体 ( 如尿液、 引流液 ) 时， 则直接取适量标本于培养瓶内， 摇匀至培养基粉末完全溶解。
步骤 2 ： 上述临床标本经 16℃ -38℃， 0-300rpm 震荡或不震荡培养 2-24 小时。
检出 β- 内酰胺酶需要的最低菌液浓度为 105CFU/mL。研究结果显示 ： 37 ℃， 150-200rpm 震荡培养 5 小时， 同培养 24 小时的检出一致。如果 37℃静止培养， 则需要培养 5 18 小时， 菌液浓度即可达到 10 CFU/mL。
实施例 5 ： 微生物的快速选择性培养
为了某些研究需要， 需筛出耐某种或某些抗生素的感染患者或耐药菌株， 则可以 向培养基中加入该种抗生素， 适宜浓度为 0.5 ～ 32ug/ml。
例如 ： 对头孢他啶 / 舒巴坦复方制剂的进行临床研究， 临床研究中需要筛选出对 头孢他啶耐药， 而对头孢他啶 / 舒巴坦敏感的感染患者作为研究对象。 可采用的方法为 ： 对 采集自受试者的临床标本， 分为两份。第一份采用含有头孢他啶 (0.5 ～ 32ug/ml) 培养基 培养， 第二份采用头孢他啶 (0.5 ～ 32ug/ml) 联用舒巴坦 (2 ～ 32ug/ml) 的培养基培养， 然 后检测 β- 内酰胺酶。第一份标本 β- 内酰胺酶检出为阳性， 同时后第二份标本 β- 内酰 胺酶检出为阴性者作为入选病例。
实施例 6 ： β- 内酰胺酶的检测
取实施例 4 所得菌液 1 滴， 滴加在产色头孢菌素显色滤纸上， 室温下观察滤纸颜色 变化， 按如下方式判断结果 ：
如果滤纸在 30min 内颜色没有变化， 则 β- 内酰胺酶检测为阴性。如果滤纸在 30min 内颜色由浅黄色变为粉红或红色， 则 β- 内酰胺酶检测为阳性， 则进行实施例 7 的检 测以判断 β- 内酰胺酶的底物特性， 并对 β- 内酰胺酶进行分类。
实施例 7 ： β- 内酰胺酶的底物特性的检测及 β- 内酰胺酶的分类
取 0.5-1mL 培养液加入到内含乳化剂多粘菌素的 EP 管中， 充分混匀溶解， 37℃温 孵 10min， 得到乳化菌液。乳化剂还可选用短杆菌素、 溶菌酶的一种或任何组合。
取适量的上述乳化菌液加入到多臂检测试纸 ( 见图 1) 的中央加样区 (4 区 )， 液体 逐渐向滤纸 2 区扩散。30min 内观察结果。
检测结果按照表 1 进行对 β- 内酰胺酶分类 ：
表 1.β- 内酰胺酶的分类
+， 待测药物为 β- 内酰胺酶的底物 ； -， 待测药物不是 β- 内酰胺酶的底物。
结果判断 ：
1) 检测有效的条件为 ： 各臂 2 区试纸颜色浅黄， 同时检测中 A 臂 2 区颜色由浅黄 变为粉红色。
2) 判为 “+” 的标准 ： 同 A 臂 2 区颜色改变为对照， 其它臂颜色不变或变化明显低
于 A 臂 2 区变化则判为 “+” 。
3) 判为 “-” 的标准 ： 同 A 臂 2 区颜色改变为对照， 其它臂颜色变化类似或明显强 于 A 臂 2 区颜色变化则判为 “-” 。
实施例 8 ： 本发明所述方法检测 β- 内酰胺酶底物特性与常规方法比较
实验方法如下 ：
1) 收集感染患者标本 31 例， 标本类型有痰液、 尿液、 穿刺液、 脓液、 分泌物、 前列腺 液。每份标本分为两份。
2) 第一份采用本试剂盒的快速培养方法， 37℃， 150rpm 震荡培养 5 小时， 头孢硝基 噻吩显色法检测 β- 内酰胺酶。对于 β- 内酰胺酶阳性标本， 采用本专利所述的方法检测 β- 内酰胺酶的底物特性。
3) 第二份标本送检临床微生物科室按常规培养、 分离菌株， 采用 2003801071 85.6 所述的方法 ( 简称微孔板法 ) 检测 β- 内酰胺酶的底物特性。同时对分离的致病菌进 行扩增， 按照超声破碎法提取 β- 内酰胺酶， 采用紫外分光光度法测定 β- 内酰胺酶底物特 性。
4) 以紫外分光光度法检测结果为标准考察微孔板法和本专利所述的方法的灵敏 度和准确性。所有实验重复 5 次， 以考察方法的重复性。 研究结果 ： 紫外分光光度法检出 6 个标本含产 ESBLs 菌株， 重复检测五次， 结果完 全一致， 检出所需时间约为 84 小时。微孔板法检出 2 标本含产 ESBLs 菌株， 2 标本可疑， 重 复性差， 检出所需时间约为 72 小时。本专利方法的检测结果同紫外分光光度法完全一致， 而检测仅需 5 小时。此外， 紫外分光光度法操作繁琐， 实验技术要求高， 而本发明所述方法 操作简单。 同现有技术相比， 本发明所述方法具有操作简便、 检测快速、 反应灵敏、 结果稳定 的优点。