技术领域
本发明采用微生物发酵法以工业废弃甘油作为原料生产D-乳酸，属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术
日益严重的全球性能源和环境问题促使世界各国纷纷发展生物柴油技术并构建生物柴油产业，以减缓对石油依赖并降低大气中温室气体排放的上升速度。据统计，2006年全球生物柴油总产量约65亿升，较2005年的39亿升增长67％，增长速度惊人。根据Global Industry Analysts所做的预估，2010年全球生物柴油市场将增长至180亿升，比2006年增长177％。随着世界范围内生物柴油需求量和生产量的迅猛增长，其经济生存能力越来越要依赖于对其废弃副产品甘油(产量按生物柴油产量的10％计算)的有效利用或大规模的转化。
与此同时，生物可降解材料如聚乳酸的需求也不断增加，同步推动了对其单体D-乳酸或L-乳酸的需求。近年来，乳酸发酵工艺及聚乳酸高分子材料的研究活跃，乳酸成为一个极具潜力的化学品，并有望成为继柠檬酸之后的又一大宗发酵产品。然而，外消旋型及低光学纯度的乳酸在很多领域的应用受到限制，人们不断寻找单一光学纯度D-乳酸或L-乳酸的生产方法，并探索其以廉价资源为原料，以高产量、高底物转化率、高生产强度、高化学纯度生产的可行性。
因此，如果能有效地将甘油作为原料发酵生产出高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸或L-乳酸，则既可以解决生物柴油或油脂加工中的甘油的回收利用问题，又可以节约D-乳酸的或L-乳酸的生产成本。相对于葡萄糖而言，以甘油为底物合成乳酸具有更高的还原态。刘德华等提出了以甘油为原料发酵生产乳酸的工艺路线，并分离出一株野生菌株，能直接利用未精制的甘油为原料发酵生产乳酸，在5L机械搅拌发酵罐进行通空气批次发酵研究，72h时发酵液中乳酸浓度68.53g/L，乳酸质量得率0.81，生产强度0.95g/(L·h)(许赟珍，等，过程工程学报，2008)。该课题组在筛选得到的菌株在发酵甘油获得乳酸的同时，乙酸，琥珀酸，酒精等副产物的终浓度分别达到7.0g/L，3.7g/L，1.4g/L(An-AnHong，et al，J Chem Technol Biotechnol，2009)。同一课题组还使用相似研究结果申请了国家发明专利(一种利用甘油生产乳酸的方法，专利号：200810102824.4；公开号：CN 101255451A)。但在此申请专利中，申请者使用的为野生细菌，未对菌株的发酵能力进行遗传改良，也没有研究其所生产的乳酸是L-型还是D-型或者是混合型，更未对乳酸发酵过程中必须严格控制的其它低分子特别是乙酸，琥珀酸的形成或含量严格控制，不能以此实施工业应用目的。本发明中以一株经过广范围基因修饰的D-乳酸高产菌株为生产菌株，在高效转化甘油合成乳酸的同时大幅度减少了副产物的生成，合成高光学纯度和高化学纯度的D-乳酸，并建立了相关的发酵工艺，与上述申请专利完全不同。
大肠杆菌是优秀的乳酸候选产生菌，特别是经过基因组有益改造的大肠杆菌可以快速高效的代谢葡萄糖生成高化学纯度和高光学纯度的乳酸。如pta和ppc的敲除可以提高乳酸的化学纯度(Dong-Eun Chang，et al，Applied and Environmental Microbiology，1999)。pflB，aceEF，poxB和pps也被证实可以提高乳酸的化学纯度(Y.Zhu，et al，Applied and Environmental Microbiology，2007)。
大肠杆菌在碳源利用方面存在明显的葡萄糖效应。当其他碳源和葡萄糖同时存在时，菌株优先利用葡萄糖而其他碳源的利用受到抑制，直到葡萄糖消耗殆尽时菌株才开始利用其他碳源。甘油和葡萄糖同时作为碳源时菌体生长存在二次利用现象，即使不添加葡萄糖，甘油作为唯一碳源时，菌株对甘油的利用也存在明显的延迟期过长现象。研究表明葡萄糖磷酸转移酶基因(ptsG)在葡萄糖效应中起着至关重要的作用，突变该基因，阻断磷酸转移酶的合成途径可以有效的解除葡萄糖对其他碳源代谢利用的抑制作用(Ranjini Chatterjee，et al，Applied and Environmental Microbiology，2001)。MarkA.Eiteman等的研究成果显示，除了葡萄糖磷酸转移酶基因(ptsG)之外，葡萄糖激酶基因(glk)、甘露糖磷酸转移透性酶(manZ)和木糖异构酶(xylA)在碳源的选择性利用方面也有重要的影响作用(Mark A.Eiteman，et al，Biotechmology and Bionengineering，2008)。
甘油的代谢需要氧气的参与，因此菌体代谢利用甘油进行生长的过程需要足够的通氧。而乳酸的合成过程则需要在厌氧条件下，因为氧气会将NADH氧化而使得乳酸合成途径受阻。NADH作为乳酸脱氢酶的辅酶为乳酸的合成提供足够的还原力。因此，利用甘油发酵生产乳酸的过程需要维持适宜的供氧浓度，既满足菌体代谢甘油生长的需要又可以维持一定的还原力用于乳酸的合成。
本发明经适当修改后，也可以用于代谢利用糖蜜、乳清或纤维素与半纤维素水解液等工业副产物高效生产D-乳酸、L-乳酸、丙酮酸、苹果酸、丁二酸、D-丙氨酸等其它有机酸。
发明内容
本发明的目的是：通过基因改造，解除葡萄糖的抑制效应实现菌株对甘油的快速代谢利用，并建立一种D-乳酸高效制备方法，获得光学纯度和化学纯度高的D-乳酸产品，同时形成一套简洁易控的D-乳酸发酵工艺条件。
本发明的特征是：本发明中使用的菌株可以快速利用甘油并合成D-乳酸。在pH5.0～7.5，30～45℃发酵条件下，提供适宜的通氧，D-乳酸生产菌株利用甘油生长的同时，代谢甘油合成乳酸，并几乎不形成其它有机酸和乙醇。本发明D-乳酸的生产工艺特征为：pH5.0～7.5和30～45℃条件下，发酵30～48h后，D-乳酸含量达到12～14％，D-乳酸的光学纯度达到99.9％以上，甘油对乳酸的转化率高于90％。本发明涉及的重组菌，其基因组中的一个或多个基因被删除或表达。所涉及到的基因产物包括：葡萄糖磷酸转移酶、葡萄糖激酶、甘露糖磷酸转移透性酶、木糖异构酶、FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶或苹果酸合酶等。所涉及到的工艺控制参数包括：培养基组成、pH、培养温度、溶氧或甘油浓度。
本发明使用的菌种、基因删除与表达方法、培养基和发酵工艺控制方法：
菌种：本发明使用的出发菌种为经过基因突变或修饰的野生型大肠杆菌。野生菌株从中国高校工业微生物资源与信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)购得。通过摇瓶发酵实验筛选获得产乳酸水平相对较高的菌株为出发菌株，再经过基因修饰技术进行基因组修饰，最终获得高产高光学纯度与化学纯度的D-乳酸生产菌。该菌株中甲酸、乙酸、琥珀酸、L-乳酸、D-乳酸等多种有机酸、乙醇的代谢途径以及甘油、葡萄糖代谢中的多个关键酶编码基因被删除或修饰。此菌种巳作为专利菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2010024。
基因删除技术：用合成的寡核苷酸引物，将特异性重组位点序列(dif序列；BloorEA & Cranenburgh MR，Appl Environ Microbiol，2006)引入选择性标记(如庆大霉素抗性基因)的两侧，形成可反复使用的选择性标记。运用PCR(多聚酶链反应)从大肠杆菌基因组中扩增获得目标删除基因的上游及下游序列各50～200bp。将可反复使用的选择性标记克隆入目标删除基因的上游和下游序列之间，形成目的基因删除序列，如dld’-dif-GmR-dif-dld’，即dld’::difGm。将此基因删除序列转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子，再在非选择性培养基上传代培养，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR对转化子的目的基因突变进行验证。由此获得的突变株再用于下一个目的基因删除的出发菌株。
基因克隆与表达：运用PCR技术，从大肠杆菌基因组中克隆出目的基因如编码乙醇脱氢酶的基因adhE和NAD+依赖性D-乳酸脱氢酶编码基因ldhA，用ldhA基因代替adhE基因的部分碱基序列构建突变核，在利用上面的方法删除adhE基因的同时完成ldhA基因的替代，并获得重组菌株获得高产D-乳酸的重组菌。
利用上述重组方法，按照以下步骤，完成高产高光学纯度与化学纯度的D-乳酸重组菌CCTCC NO：M 2010024的构建。
①出发菌株的筛选：野生菌株从中国高校工业微生物资源与信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)购得。通过摇瓶发酵实验在补加50g/L葡萄糖和10g/L碳酸钙的M9培养基(萨姆布鲁克J，弗里奇E F.分子克隆实验指南第三版[M].北京：科学出版社，2002)中发酵70h后，测定其乳酸生产量，筛选获得产乳酸水平相对较高的菌株CICIM BEC2198为出发菌株。
②利用上述基因删除技术，将步骤①所获得的出发菌株基因组中的目的基因如编码FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的基因dld删除，并获得重组菌株BEC-1(BEC2198，dld)。
③利用上述基因删除技术，将步骤②所获得的重组菌株基因组中的目的基因如编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pfl删除，并获得重组菌株BEC-2(BEC2198，dld、pfl)。
④利用上述基因删除技术，将步骤③所获得的重组菌株基因组中的目的基因如编码磷酸转乙酰酶和乙酸激酶的基因ack-pta删除，并获得重组菌株BEC-3(BEC2198，dld、pfl、ack-pta)。
⑤利用上述基因删除与基因修饰技术，将步骤④所获得的重组菌株基因组中的目的基因如编码乙醇脱氢酶的基因adhE删除，并用NAD+依赖性D-乳酸脱氢酶编码基因ldhA替代，并获得重组菌株BEC-4(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA)。
⑥利用上述基因删除技术，将出发菌株中的目的基因如编码葡萄糖磷酸转移酶的基因ptsG删除，并获得重组菌株BEC-5(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG)。
⑦利用上述基因删除技术，将出发菌株中的目的基因如编码葡萄糖激酶的基因glk删除，并获得重组菌株BEC-6(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk)。
⑧利用上述基因删除技术，将出发菌株中的目的基因如编码甘露糖磷酸转移透性酶的基因manZ删除，并获得重组菌株BEC-7(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk、ΔmanZ)。
⑨利用上述基因删除技术，将出发菌株中的目的基因如编码木糖异构酶的基因xylA删除，并获得重组菌株BEC-8(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk、ΔmanZ、ΔxylA)。
培养基：本发明使用的培养基(简称MG培养基)组成为：添加葡萄糖或甘油为碳源，由五种无机盐和微量元素组成(g/L)：Na2HPO4 6，KH2PO4 3，NH4Cl 1，NaCl 0.5，灭菌后每升培养基加入1mL无菌的lmol/L MgSO4和1mL无菌的微量元素母液(配方见表1)，甘油初始添加浓度为5g/L。
表1微量元素母液配方
D-乳酸的发酵生产：
⑩将步骤⑤、⑥、⑦、⑧、⑨所获得的重组菌株以及野生菌株BEC2198分别在7L全自动发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、甘油消耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸分析等。
溶氧控制方法：本发明中涉及的大肠杆菌为兼性厌氧菌，适宜的通氧条件下菌体利用甘油生长，并同时快速合成乳酸。发酵过程采用不完全供氧策略，既保证了菌体生长需求，又可以实现乳酸的大量合成，同时少生成或不生成各种有机酸等副产物。菌体生长阶段前期，控制融氧不低于30％，转速达到500r/min时，解除融氧和转速的关联，融氧会逐渐减低至1.0～2.0，固定转速500r/min和通风量5L/min。
甘油流加方法：本发明中涉及的大肠杆菌可以代谢甘油合成乳酸，同时积累乳酸。其合成甲酸，琥珀酸乙酸和乙醇的代谢途径被有效阻断。发酵过程采用分批间歇补加甘油，从而实现了D-乳酸的高效制备。菌体生长初始甘油浓度3％，发酵过程中监控溶氧浓度，当溶氧浓度迅速上升时(甘油耗尽)补加甘油至终浓度5％，整个发酵过程中四次补加甘油至终浓度5％。
样品分析：发酵样品硫酸酸化处理后，离心取上清，经10％三氯乙酸沉淀，再次离心，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，用于高压液相分析。高压液相采用Shodex SUGARSH1011，柱温50℃，紫外检测，波长为210nm。流动相为0.01mol/L H2SO4，流速0.7ml/L，柱压44Bar。高压液相采用Shodex SUGAR SH1011，柱温50℃，示差检测。流动相为0.01mol/L H2SO4，流速0.7ml/L，柱压44Bar。
本发明的突出的实质性特点和显著进步主要体现在：
1、本发明中构建的重组菌可以制备高光学纯度及高化学纯度的D-乳酸。在pH5.0-7.5，30～45℃的条件下发酵30～48h，产D-乳酸水平达到12～14％，D-乳酸的光学纯度达到99.9％以上，甘油对乳酸的转化率高于90％，几乎不形成其它有机酸或乙醇。
2、本发明中构建的重组菌代谢利用甘油的性能得到显著改善，可以快速将甘油转化为D-乳酸，代谢速率提高25％以上，并且该重组菌对甘油的耐受性得到显著提高，提高幅度高达30％。
3、本发明的建立的发酵工艺操作简单，易于实现，发酵过程全程采用Ca(OH)2调节pH，中间过程只需要根据溶氧的变化间歇补加甘油，全程维持恒定的通气强度。并且，在发酵液中基本没有杂酸等副产物的合成，保障了后续聚合级D-乳酸的加工。
说明附图
图1重组质粒pUC-difEc-GmR
图2重组质粒pUC-adhE′::ldhA-dif-GmR
具体实施方式
实施例1——野生D-乳酸生产菌株的发酵筛选
原始菌株由两部分组成.其中871株为芽孢杆菌；1329株为肠杆菌，平板培养采用LB培养基.菌株发酵产乳酸均采用MG培养基(M9培养基补充5％葡萄糖作为碳源).
筛选分两步进行.由于原始菌株数量较多初筛过程为多批次完成，所以首先同样采用试管培养的方法，对初筛得到的D-乳酸产生菌株进行同批次筛选.然后选择产乳酸水平较高的菌株，采用摇瓶发酵，进一步筛选高产菌株.
摇瓶发酵包括种子培养和发酵产酸.
种子培养250ml三角瓶种子培养基装液量20ml，100rpm 37℃摇床培养20h即得种子液.
发酵产酸250ml三角瓶发酵培养基装液量40ml，100rpm 37℃摇床培养12h后37℃静置培养42h.
通过分析菌株的乳酸产量筛选获得嗜热D-乳酸高产菌.
通过目测菌液浑浊度和测定菌液OD600值相结合的方法判断菌体生长情况，采用4级记录符号(-、±、+、++)记录菌液浑浊度.
高压液相色谱法测定总乳酸的产量.
筛选数据见下表：
表2野生D-乳酸生产菌株的发酵筛选
其中，BEC2198产酸水平相对较高，作为出发菌株用于后续基因工程改造。
实施例2——可反复使用基因删除与基因整合的遗传标记的制备
EcDif-Gm1：
5’-GATGCCCGGGAGGCCTGGTGCGCATAATGTATATTATGTTAAATAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCAT-3’(序列表中SEQ ID №：1)
EcDif-Gm2：5’-GATGCCCGGGATTTAACATAATATACATTATGCGCACCAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGT-3’(序列表中SEQ ID №：2)
以合成的寡核苷酸引物和为引物，以pBR-MCS5(Kovach ME et al，Gene 166，175-176(1995))DNA为模板，运用PCR从中扩增获得庆大霉素抗性基因，将此PCR产物用SmaI酶切后克隆入pUC18(Yanisch-Perron C et al，Gene 33，103-119(1985))的SmaI位点，获得重组质粒pUC-difEc-GmR(见图1)。其中的difEc-GmR(序列表中SEQ ID №：3)可以用SmaI酶切重组质粒pUC-difEc-GmR并用胶回收方式制备获得。
实施例3——删除FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P1：
5’-ATAGGATCCAGTACGTCTTGATACCTTCGAAGCGG-3’(序列表中SEQ ID №：4)
合成的寡核苷酸引物P2：
5’-CATCAGGATCCGGATTCATGCTGTTGGTCGGATC-3’(序列表中SEQ ID №：5)
以合成的寡核苷酸引物P1和P2为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶部分基因(dld’，序列表中SEQID №：6)，将此PCR产物克隆入pUC18的BamHI位点中，获得重组质粒pUC-dld。用EcoRV酶切去除其中的438bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得重组质粒pUC-dld’::dif-GmR，用BamHI酶切该重组质粒，获得FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的基因删除序列，dld’-dif-GmR-dif-dld’，即：dld’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC2198。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-1(BEC2198，dld)并用于后续研究的出发菌株。
实施例4——删除丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P3：
5’-ATAGAATTCCCGCGAACTGGATCCGATGA-3’(序列表中SEQ ID №：7)
合成的寡核苷酸引物P4：
5’-CCAGAATTCTTCAGACTTCGGACCAACCTGCA-3’(序列表中SEQ ID №：8)
以合成的寡核苷酸引物P3和P4为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl’，序列表中SEQ ID №：9)，将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-pfl。用PstI酶切去除其中的582bp的片段并用T4DNA Polymerase将粘性末端平滑化，再与实施例-中的difEc-GmR连接，获得重组质粒pUC-pfl’::GmRdif，用EcoRI酶切该重组质粒，获得丙酮酸甲酸裂解酶的基因删除序列，pfl’-dif-GmR-dif-pfl’，即：pfl’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-1(BEC2198，dld)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-2(BEC2198，dld、pfl)并用于后续研究的出发菌株。
实施例5——删除磷酸转乙酰酶和乙酸激酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P5：
5’-TGAACATCATCACCTGCCACCTG-3’(序列表中SEQ ID №：10)
合成的寡核苷酸引物P6：
5’-CAGCGCAAAGCTGCGGATG-3’(序列表中SEQ ID №：11)
以合成的寡核苷酸引物P5和P6为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得磷酸转乙酰酶和乙酸激酶(ack-pta’，序列表中SEQ ID№：12)，将此PCR产物克隆入pUC18的SmaI位点中，获得重组质粒pUC-ack-pta’。用EcoRV酶切去除其中的2633bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得重组质粒pUC-ack-pta’::GmRdif，用EcoRI、PstI双酶切该重组质粒，获得丙酮酸甲酸裂解酶的基因删除序列，ack’-dif-GmR-dif-pta’，即：ack-pta’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-2(BEC2198，dld、pfl)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-3(BEC2198，dld、pfl、ack-pta)并用于后续研究的出发菌株。
实施例5——乳酸脱氢酶替换乙醇脱氢酶基因
合成的寡核苷酸引物P7：
5’-GATCTGCAGATCTGATCGGCTGGATCGATCAAC-3’(序列表中SEQ ID №：13)
合成的寡核苷酸引物P8：
5’-GATCTGCAGGAACCAGGTTGGCGTCGACAAT-3’(序列表中SEQ ID №：14)
以合成的寡核苷酸引物P7和P8为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得乙醇脱氢酶部分基因(adhE’，序列表中SEQ ID №：15)，将此PCR产物克隆入pUC18的PstI位点中，获得重组质粒pUC-adhE’。
合成的寡核苷酸引物P9：
5’-TAAGGATCCTTATGAAACTCGCCGTTTATAGCACA-3’(序列表中SEQ ID №：16)
合成的寡核苷酸引物P10：
5’-CTTGAATTCGCTGCCGGAAATCATCATTTTTT-3’(序列表中SEQ ID №：17)
以合成的寡核苷酸引物P9和P10为引物，从菌株BEC2198基因组中克隆出NAD依赖性的D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhA，序列表中SEQ ID №：18)。重组质粒pUC-adhE’用EcoRV酶切去除其中的1047bp的片段并克隆入ldhA基因片段，获得重组质粒pUC-adhE’::ldhA。
用SmaI酶切重组质粒pUC-adhE’::ldhA，并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得重组质粒pUC-adhE’::ldhA-dif-GmR(见图2)，用PstI酶切该重组质粒，获得乳酸脱氢酶替换乙醇脱氢酶的基因序列，adhE’-ldhA-dif-GmR-dif-adhE’，即：adhE’::ldhA-GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-3(BEC2198，dld、pfl、ack-pta)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-4(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA)并用于后续研究的出发菌株。
实施例6——删除葡萄糖磷酸转移酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P11：
5’-CCGGAATTCCAATCCATCCGTTGAATGAG-3’(序列表中SEQ ID №：19)
合成的寡核苷酸引物P12：
5’-CCGGAATTCCTGTCATGCCAGAGTTGACGGTC-3’(序列表中SEQ ID №：20)
以合成的寡核苷酸引物P11和P12为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得葡萄糖磷酸转移酶基因(ptsG’，序列表中SEQ ID №：21)，将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-ptsG’。用EcoRV酶切去除其中的700bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得葡萄糖磷酸转移酶的基因删除序列，ptsG’-dif-GmR-dif-ptsG’，即：ptsG’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-4(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-5(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG)并用于后续研究的出发菌株。
实施例7——删除葡萄糖激酶酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P13：
5’-CCGGAATTCGATCGATATTTACAGGGAGC-3’(序列表中SEQ ID №：22)
合成的寡核苷酸引物P14：
5’-CCGGAATTCAGTGATAGTTGACGAG-3’(序列表中SEQ ID №：23)
以合成的寡核苷酸引物P13和P14为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得葡萄糖磷酸转移酶基因(glk’，序列表中SEQ ID №：24)
将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-glk’。用EcoRV酶切去除其中的687bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得葡萄糖磷酸转移酶的基因删除序列，glk’-dif-GmR-dif-glk’，即：glk’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-5(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-6(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk)并用于后续研究的出发菌株。
实施例8——删除甘露糖磷酸转移透性酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P15：
5’-CCGGAATTCAGGTGAGCGAAATGGTTGA-3’(序列表中SEQ ID №：25)
合成的寡核苷酸引物P16：
5’-CCGGAATTCCAACAGTCTTACAGTCC-3’(序列表中SEQ ID №：26)
以合成的寡核苷酸引物P15和P16为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得葡萄糖磷酸转移酶基因(manZ’，序列表中SEQ ID №：27)，将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-manZ’。用EcoRV酶切去除其中的561bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得葡萄糖磷酸转移酶的基因删除序列，manZ’-dif-GmR-dif-manZ’，即：manZ’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-6(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-7(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk、ΔmanZ)并用于后续研究的出发菌株。
实施例9——删除木糖异构酶的编码基因
合成的寡核苷酸引物P17：
5’CCGGAATTCCCTGATTATGGAGTTCAATATGCAAGCC-3’(序列表中SEQ ID №：28)
合成的寡核苷酸引物P18：
5’-CCGGAATTCGACTGCACAGTTAGCCGTTATTTGTCGA-3’(序列表中SEQ ID №：29)
以合成的寡核苷酸引物P17和P18为引物，以大肠杆菌BEC2198染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得木糖异构酶基因(xylA’，序列表中SEQ ID №：26)
将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-xylA’。用EcoRV酶切去除其中的1299bp的片段并与实施例一中的difEc-GmR连接，获得木糖异构酶的基因删除序列，xylA’-dif-GmR-dif-xylA’，即：xylA’::GmRdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌BEC-7(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk、ΔmanZ)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子BEC-8(BEC2198，dld、pfl、ack-pta、adhE::ldhA、ΔptsG、Δglk、ΔmanZ、ΔxylA)(CCTCC M 2010024)并用于后续研究的出发菌株。
实施例10——7L发酵罐中发酵甘油生产D-乳酸
采用LB培养基32～40℃的条件下，摇床转速200r/min培养至对数生长期中后期，获得一级种子；5％接种量转接至MG培养基(g/L)：Na2HPO4 6，KH2PO4 3，NH4Cl 1，NaCl 0.5，灭菌后每升培养基加入0.5～2mL无菌的1mol/L MgSO4，甘油初始添加浓度为5g/L。30～42℃的条件下，摇床转速200～230r/min培养至对数生长期中后期，获得二级种子，用于发酵罐接种。
采用MG培养基作为发酵培养基，7L发酵罐装液量3L，1～5％接种量。菌体生长初始甘油浓度2～5％，培养温度为30～42℃，控制溶氧不低于30％，Ca(OH)2维持pH为6.5～7.4；转速达到400～500r/min时，停止溶氧和转速的关联，溶氧会逐渐减低至1.0～2.0，固定转速400～500r/min和通风量4～6L/min，补加甘油至终浓度4～6％，发酵过程中监控溶氧浓度，当溶氧浓度迅速上升时(甘油耗尽)，再次补加甘油至终浓度4～6％。发酵过程中定时取样用于高压液相分析。
筛选获得的野生D-乳酸生产菌BEC2198可以代谢甘油发酵生产乳酸，发酵36h，D-乳酸产量可达99.1g/L。发酵过程伴生乙酸，琥珀酸，甲酸，丙酮酸和酒精的副产物，总的副产物浓度约12.5g/L。发酵获得的D-乳酸光学纯度为98.90％。同时其耐受甘油的最高浓度约160g/L。由于副产物较多，D-产量相对较低，且所产D-乳酸光学纯度较低限制了该菌株的直接工业化应用。对该菌株进行副产物合成途径关键基因的敲除，阻断副产物的合成，并阻断其利用D-乳酸转化成丙酮酸的途径，不仅提高了D-乳酸的产量，其光学纯度也得到了有效的提高。
经过基因修饰的重组菌BEC-4即是基于上述思路获得的目标菌株，该菌株利用甘油发酵36h产酸水平提高103g/L，产酸量比野生菌株提高近4％，生成的D-乳酸光学纯度也提高到99.9％以上，由于减少了副产物的生成，其对甘油的耐受性也提高了165g/L。
改善菌株对甘油的耐受性能可以有效的提高产酸强度。葡萄糖，甘露糖，木糖等作为碳源均较甘油更易于被菌体利用。通过对这三种糖类代谢关键基因的敲除，阻断其代谢途径，可以有效的提高菌株对甘油的利用率。不仅可以提高产酸强度，菌株对甘油的耐受性也得到了较大提高。
ptsG基因和glk基因在葡萄糖代谢利用过程中起着关键的作用。ptsG敲除后葡萄糖代谢途径部分被阻断，基于此获得的重组菌BEC-5产酸达109.2g/L，产酸水平较原始菌提高10％以上，该重组菌耐受甘油浓度也提高至170g/L，较原始菌提高6％以上。同时敲除glk基因后，获得的重组菌BEC-6，葡萄糖代谢途径被完全阻断，产酸量为114g/L，较原始菌提高幅度约15％，甘油耐受浓度也提高了15％以上。
甘露糖磷酸转移透性酶的编码基因敲除后，获得的重组菌BEC-7，其耐受甘油的能力得到大幅度提高，耐受甘油最高浓度为200g/L，提高幅度较原始菌高25％，D-乳酸的产量也接近120g/L，较原始菌提高了20％以上。
xylA为木糖异构酶的编码基因，敲除该基因后，木糖代谢途径被完全阻断，而获得的重组菌BEC-8可耐受最高达210g/L的甘油浓度，甘油耐受性能较原始菌提高30％以上，产酸水平提高至124g/L，较原始菌提高25％以上。该重组菌生成D-乳酸的同时仅伴生不高于0.5g/L的副产物，所产D-乳酸的光学纯度高达99.95％，是一株优良的代谢甘油发酵生产D-乳酸生产菌株，具有极高的工业利用价值。
相关发酵数据见表3-5。
表3经过基因修饰的重组菌对甘油的耐受性和D-乳酸产量的提高
*：参考J.E.Purvis等定义的MIC值耐受强度考察方法(J.E.Purvis，L.P.Yomano，L.O.Ingram，Applied and Environmental Microbiology，2005)
表4经过基因修饰的重组菌发酵甘油产D-乳酸过程中副产物生成情况
表5经过基因修饰的最优重组菌BEC-8发酵甘油产D-乳酸的重复实验
*：对照菌株为经过基因修饰的重组菌BEC2198
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
gatgcccggg aggcctggtg cgcataatgt atattatgtt aaatagaggc ggtttgcgta ttgggcgcat 70
<210>SEQ ID NO：2
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
gatgcccggg atttaacata atatacatta tgcgcaccaa gccgatctcg gcttgaacga attgt 65
<210>SEQ ID NO：3
<211>1033
<212>DNA
<213>difEc-GmR
1 GGGAGGCCTG GTGCGCATAA TGTATATTAT GTTAAATAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG
61 CATGCATAAA AACTGTTGTA ATTCATTAAG CATTCTGCCG ACATGGAAGC CATCACAAAC
121 GGCATGATGA ACCTGAATCG CCAGCGGCAT CAGCACCTTG TCGCCTTGCG TATAATATTT
181 GCCCATGGAC GCACACCGTG GAAACGGATG AAGGCACGAA CCCAGTTGAC ATAAGCCTGT
241 TCGGTTCGTA AACTGTAATG CAAGTAGCGT ATGCGCTCAC GCAACTGGTC CAGAACCTTG
301 ACCGAACGCA GCGGTGGTAA CGGCGCAGTG GCGGTTTTCA TGGCTTGTTA TGACTGTTTT
361 TTTGTACAGT CTATGCCTCG GGCATCCAAG CAGCAAGCGC GTTACGCCGT GGGTCGATGT
421 TTGATGTTAT GGAGCAGCAA CGATGTTACG CAGCAGCAAC GATGTTACGC AGCAGGGCAG
481 TCGCCCTAAA ACAAAGTTAG GTGGCTCAAG TATGGGCATC ATTCGCACAT GTAGGCTCGG
541 CCCTGACCAA GTCAAATCCA TGCGGGCTGC TCTTGATCTT TTCGGTCGTG AGTTCGGAGA
601 CGTAGCCACC TACTCCCAAC ATCAGCCGGA CTCCGATTAC CTCGGGAACT TGCTCCGTAG
661 TAAGACATTC ATCGCGCTTG CTGCCTTCGA CCAAGAAGCG GTTGTTGGCG CTCTCGCGGC
721 TTACGTTCTG CCCAGGTTTG AGCAGCCGCG TAGTGAGATC TATATCTATG ATCTCGCAGT
781 CTCCGGCGAG CACCGGAGGC AGGGCATTGC CACCGCGCTC ATCAATCTCC TCAAGCATGA
841 GGCCAACGCG CTTGGTGCTT ATGTGATCTA CGTGCAAGCA GATTACGGTG ACGATCCCGC
901 AGTGGCTCTC TATACAAAGT TGGGCATACG GGAAGAAGTG ATGCACTTTG ATATCGACCC
961 AAGTACCGCC ACCTAACAAT TCGTTCAAGC CGAGATCGGC TTGGTGCGCA TAATGTATAT
1021TATGTTAAAT CCC
<210>SEQ ID NO：4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
ataggatcca gtacgtcttg ataccttcga agcgg 35
<210>SEQ ID NO：5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
catcaggatc cggattcatg ctgttggtcg gatc 34
<210>SEQ ID NO：6
<211>876
<212>DNA
<213>dld’
1 AGTACGTCTT GATACCTTCG AAGCGGAAAA AAATCAGCAG GTGTTTTATA TCGGCACCAA
61 CCAGCCGGAA GTGCTGACCG AAATCCGCCG TCATATTCTG GCTAACTTCG AAAATCTGCC
121 GGTTGCCGGG GAATATATGC ACCGGGATAT CTACGATATT GCGGAAAAAT ACGGCAAAGA
181 CACCTTCCTG ATGATTGATA AGTTAGGCAC CGACAAGATG CCGTTCTTCT TTAATCTCAA
241 GGGACGCACC GATGCGATGC TGGAGAAAGT GAAATTCTTC CGTCCGCATT TTACTGACCG
301 TGCGATGCAA AAATTCGGTC ACCTGTTCCC CAGCCATTTA CCGCCGCGCA TGAAAAACTG
361 GCGCGATAAA TACGAGCATC ATCTGCTGTT AAAAATGGCG GGCGATGGCG TGGGCGAAGC
421 CAAATCGTGG CTGGTGGATT ATTTCAAACA GGCCGAAGGC GATTTCTTTG TCTGTACGCC
481 GGAGGAAGGC AGCAAAGCGT TTTTACACCG TTTCGCCGCT GCGGGCGCAG CAATTCGTTA
541 TCAGGCGGTG CATTCCGATG AAGTCGAAGA CATTCTGGCG TTGGATATCG CTCTGCGGCG
601 TAACGACACC GAGTGGTATG AGCATTTACC GCCGGAGATC GACAGCCAGC TGGTGCACAA
661 GCTCTATTAC GGCCATTTTA TGTGCTATGT CTTCCATCAG GATTACATAG TGAAAAAAGG
721 CGTGGATGTG CATGCGTTAA AAGAACAGAT GCTGGAACTG CTACAGCAGC GCGGCGCGCA
781 GTACCCTGCC GAGCATAACG TCGGTCATTT GTATAAAGCA CCGGAGACGT TGCAGAAGTT
841 CTATCGCGAG AACGATCCGA CCAACAGCAT GAATCC<210>SEQ ID NO：7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
atagaattcc cgcgaactgg atccgatga 29
<210>SEQ ID NO：8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
ccagaattct tcagacttcg gaccaacctg ca 32
<210>SEQ ID NO：9
<211>1012
<212>DNA
<213>pfl’
1 CCGCGAACTG GATCCGATGA TCAAAAAAAT CTTCACTGAA TACCGTAAAA CTCACAACCA
61 GGGCGTGTTC GACGTTTACA CTCCGGACAT CCTGCGTTGC CGTAAATCTG GTGTTCTGAC
121CGGTCTGCCA GATGCATATG GCCGTGGCCG TATCATCGGT GACTACCGTC GCGTTGCGCT
181GTACGGTATC GACTACCTGA TGAAAGACAA ACTGGCACAG TTCACTTCTC TGCAGGCTGA
241TCTGGAAAAC GGCGTAAACC TGGAACAGAC TATCCGTCTG CGCGAAGAAA TCGCTGAACA
301GCACCGCGCT CTGGGTCAGA TGAAAGAAAT GGCTGCGAAA TACGGCTACG ACATCTCTGG
361TCCGGCTACC AACGCTCAGG AAGCTATCCA GTGGACTTAC TTCGGCTACC TGGCTGCTGT
421TAAGTCTCAG AACGGTGCTG CAATGTCCTT CGGTCGTACC TCCACCTTCC TGGATGTGTA
481CATCGAACGT GACCTGAAAG CTGGCAAGAT CACCGAACAA GAAGCGCAGG AAATGGTTGA
541CCACCTGGTC ATGAAACTGC GTATGGTTCG CTTCCTGCGT ACTCCGGAAT ACGATGAACT
601GTTCTCTGGC GACCCGATCT GGGCAACCGA ATCTATCGGT GGTATGGGCC TCGACGGTCG
661TACCCTGGTT ACCAAAAACA GCTTCCGTTT CCTGAACACC CTGTACACCA TGGGTCCGTC
721TCCGGAACCG AACATGACCA TTCTGTGGTC TGAAAAACTG CCGCTGAACT TCAAGAAATT
781CGCCGCTAAA GTGTCCATCG ACACCTCTTC TCTGCAGTAT GAGAACGATG ACCTGATGCG
841TCCGGACTTC AACAACGATG ACTACGCTAT TGCTTGCTGC GTAAGCCCGA TGATCGTTGG
901TAAACAAATG CAGTTCTTCG GTGCGCGTGC AAACCTGGCG AAAACCATGC TGTACGCAAT
961CAACGGCGGC GTTGACGAAA AACTGAAAAT GCAGGTTGGT CCGAAGTCTG AA
<210>SEQ ID NO：10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
tgaacatcat cacctgccac ctg 23
<210>SEQ ID NO：11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
cagcgcaaag ctgcggatg 19
<210>SEQ ID NO：12
<211>2839
<212>DNA
<213>ack-pta’
1 TGAACATCAT CACCTGCCAC CTGGGCAACG GTGGTTCCGT TTCTGCTATC CGCAACGGTA
61 AATGCGTTGA CACCTCTATG GGCCTGACCC CGCTGGAAGG TCTGGTCATG GGTACCCGTT
121CTGGTGATAT CGATCCGGCG ATCATCTTCC ACCTGCACGA CACCCTGGGC ATGAGCGTTG
181ACGCAATCAA CAAACTGCTG ACCAAAGAGT CTGGCCTGCT GGGTCTGACC GAAGTGACCA
241GCGACTGCCG CTATGTTGAA GACAACTACG CGACGAAAGA AGACGCGAAG CGCGCAATGG
301ACGTTTACTG CCACCGCCTG GCGAAATACA TCGGTGCCTA CACTGCGCTG ATGGATGGTC
361GTCTGGACGC TGTTGTATTC ACTGGTGGTA TCGGTGAAAA TGCCGCAATG GTTCGTGAAC
421TGTCTCTGGG CAAACTGGGC GTGCTGGGCT TTGAAGTTGA TCATGAACGC AACCTGGCTG
481CACGTTTCGG CAAATCTGGT TTCATCAACA AAGAAGGTAC CCGTCCTGCG GTGGTTATCC
541CAACCAACGA AGAACTGGTT ATCGCGCAAG ACGCGAGCCG CCTGACTGCC TGATTTCACA
601CCGCCAGCTC AGCTGGCGGT GCTGTTTTGT AACCCGCCAA ATCGGCGGTA ACGAAAGAGG
661ATAAACCGTG TCCCGTATTA TTATGCTGAT CCCTACCGGA ACCAGCGTCG GTCTGACCAG
721CGTCAGCCTT GGCGTGATCC GTGCAATGGA ACGCAAAGGC GTTCGTCTGA GCGTTTTCAA
781ACCTATCGCT CAGCCGCGTA CCGGTGGCGA TGCGCCCGAT CAGACTACGA CTATCGTGCG
841TGCGAACTCT TCCACCACGA CGGCCGCTGA ACCGCTGAAA ATGAGCTACG TTGAAGGTCT
901GCTTTCCAGC AATCAGAAAG ATGTGCTGAT GGAAGAGATC GTCGCAAACT ACCACGCTAA
961CACCAAAGAC GCTGAAGTCG TTCTGGTTGA AGGTCTGGTC CCGACACGTA AGCACCAGTT
1021TGCCCAGTCT CTGAACTACG AAATCGCTAA AACGCTGAAT GCGGAAATCG TCTTCGTTAT
1081GTCTCAGGGC ACTGACACCC CGGAACAGCT GAAAGAGCGT ATCGAACTGA CCCGCAACAG
1141CTTCGGCGGT GCCAAAAACA CCAACATCAC CGGCGTTATC GTTAACAAAC TGAACGCACC
1201GGTTGATGAA CAGGGTCGTA CTCGCCCGGA TCTGTCCGAG ATTTTCGACG ACTCTTCCAA
1261AGCTAAAGTA AACAATGTTG ATCCGGCGAA GCTGCAAGAA TCCAGCCCGC TGCCGGTTCT
1321CGGCGCTGTG CCGTGGAGCT TTGACCTGAT CGCGACTCGT GCGATCGATA TGGCTCGCCA
1381CCTGAATGCG ACCATCATCA ACGAAGGCGA CATCAATACT CGCCGCGTTA AATCCGTCAC
1441TTTCTGCGCA CGCAGCATTC CGCACATGCT GGAGCACTTC CGTGCCGGTT CTCTGCTGGT
1501GACTTCCGCA GACCGTCCTG ACGTGCTGGT GGCCGCTTGC CTGGCAGCCA TGAACGGCGT
1561AGAAATCGGT GCCCTGCTGC TGACTGGCGG TTACGAAATG GACGCGCGCA TTTCTAAACT
1621GTGCGAACGT GCTTTCGCTA CCGGCCTGCC GGTATTTATG GTGAACACCA ACACCTGGCA
1681GACCTCTCTG AGCCTGCAGA GCTTCAACCT GGAAGTTCCG GTTGACGATC ACGAACGTAT
1741CGAGAAAGTT CAGGAATACG TTGCTAACTA CATCAACGCT GACTGGATCG AATCTCTGAC
1801TGCCACTTCT GAGCGCAGCC GTCGTCTGTC TCCGCCTGCG TTCCGTTATC AGCTGACTGA
1861ACTTGCGCGC AAAGCGGGCA AACGTATCGT ACTGCCGGAA GGTGACGAAC CGCGTACCGT
1921TAAAGCAGCC GCTATCTGTG CTGAACGTGG TATCGCAACT TGCGTACTGC TGGGTAATCC
1981GGCAGAGATC AACCGTGTTG CAGCGTCTCA GGGTGTAGAA CTGGGTGCAG GGATTGAAAT
2041CGTTGATCCA GAAGTGGTTC GCGAAAGCTA TGTTGGTCGT CTGGTCGAAC TGCGTAAGAA
2101CAAAGGCATG ACCGAAACCG TTGCCCGCGA ACAGCTGGAA GACAACGTGG TGCTCGGTAC
2161GCTGATGCTG GAACAGGATG AAGTTGATGG TCTGGTTTCC GGTGCTGTTC ACACTACCGC
2221AAACACCATC CGTCCGCCGC TGCAGCTGAT CAAAACTGCA CCGGGCAGCT CCCTGGTATC
2281TTCCGTGTTC TTCATGCTGC TGCCGGAACA GGTTTACGTT TACGGTGACT GTGCGATCAA
2341CCCGGATCCG ACCGCTGAAC AGCTGGCAGA AATCGCGATT CAGTCCGCTG ATTCCGCTGC
2401GGCCTTCGGT ATCGAACCGC GCGTTGCTAT GCTCTCCTAC TCCACCGGTA CTTCTGGTGC
2461GGTAGCGACG TAGAAAAAGT TCGCGAAGCA ACTCGTCTGG CGCAGGAAAA ACGTCCTGAC
2521CTGATGATCG ACGGTCCGCT GCAGTACGAC GCTGCGGTAA TGGCTGACGT TGCGAAATCC
2581AAAGCGCCGA ACTCTCCGGT TGCAGGTCGC GCTACCGTGT TCATCTTCCC GGATCTGAAC
2641ACCGGTAACA CCACCTACAA AGCGGTACAG CGTTCTGCCG ACCTGATCTC CATCGGGCCG
2701ATGCTGCAGG GTATGCGCAA GCCGGTTAAC GACCTGTCCC GTGGCGCACT GGTTGACGAT
2761ATCGTCTACA CCATCGCGCT GACTGCGATT CAGTCTGCAC AGCAGCAGTA ATCTCGTCAT
2821CATCCGCAGC TTTGCGCTG
<210>SEQ ID NO：13
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
gatctgcaga tctgatcggc tggatcgatc aac 33
<210>SEQ ID NO：14
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
gatctgcagg aaccaggttg gcgtcgacaa t 31
<210>SEQ ID NO：15
<211>1425
<212>DNA
<213>adhE’
1 ATCTGATCGG CTGGATCGAT CAACCTTCTG TTGAACTGTC TAACGCACTG ATGCACCACC
61 CAGACATCAA CCTGATCCTC GCGACTGGTG GTCCGGGCAT GGTTAAAGCC GCATACAGCT
121 CCGGTAAACC AGCTATCGGT GTAGGCGCGG GCAACACTCC AGTTGTTATC GATGAAACTG
181 CTGATATCAA ACGTGCAGTT GCATCTGTAC TGATGTCCAA AACCTTCGAC AACGGCGTAA
241 TCTGTGCTTC TGAACAGTCT GTTGTTGTTG TTGACTCTGT TTATGACGCT GTACGTGAAC
301 GTTTTGCAAC CCACGGCGGC TATCTGTTGC AGGGTAAAGA GCTGAAAGCT GTTCAGGATG
361 TTATCCTGAA AAACGGTGCG CTGAACGCGG CTATCGTTGG TCAGCCAGCC TATAAAATTG
421 CTGAACTGGC AGGCTTCTCT GTACCAGAAA ACACCAAGAT TCTGATCGGT GAAGTGACCG
481 TTGTTGATGA AAGCGAACCG TTCGCACATG AAAAACTGTC CCCGACTCTG GCAATGTACC
541 GCGCTAAAGA TTTCGAAGAC GCGGTAGAAA AAGCAGAGAA ACTGGTTGCT ATGGGCGGTA
601 TCGGTCATAC CTCTTGCCTG TACACTGACC AGGATAACCA ACCGGCTCGC GTTTCTTACT
661 TCGGTCAGAA AATGAAAACG GCGCGTATCC TGATTAACAC CCCAGCGTCT CAGGGTGGTA
721 TCGGTGACCT GTATAACTTC AAACTCGCAC CTTCCCTGAC TCTGGGTTGT GGTTCTTGGG
781 GTGGTAACTC CATCTCTGAA AACGTTGGTC CGAAACACCT GATCAACAAG AAAACCGTTG
841 CTAAGCGAGC TGAAAACATG TTGTGGCACA AACTTCCGAA ATCTATCTAC TTCCGCCGTG
901 GCTCCCTGCC AATCGCGCTG GATGAAGTGA TTACTGATGG CCACAAACGT GCGCTCATCG
961 TGACTGACCG CTTCCTGTTC AACAATGGTT ATGCTGATCA GATCACTTCC GTACTGAAAG
1021CAGCAGGCGT TGAAACTGAA GTCTTCTTCG AAGTAGAAGC GGACCCGACC CTGAGCATCG
1081TTCGTAAAGG TGCAGAACTG GCAAACTCCT TCAAACCAGA CGTGATTATC GCGCTGGGTG
1141GTGGTTCCCC GATGGACGCC GCGAAGATCA TGTGGGTTAT GTACGAACAT CCGGAAACTC
1201ACTTCGAAGA GCTGGCGCTG CGCTTTATGG ATATCCGTAA ACGTATCTAC AAGTTCCCGA
1261AAATGGGCGT GAAAGCGAAA ATGATCGCTG TCACCACCAC TTCTGGTACA GGTTCTGAAG
1321TCACTCCGTT TGCGGTTGTA ACTGACGACG CTACTGGTCA GAAATATCCG CTGGCAGACT
1381ATGCGCTGAC TCCGGATATG GCGATTGTCG ACGCCAACCT GGTTA
<210>SEQ ID NO：16
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
taaggatcct tatgaaactc gccgtttata gcaca 35
<210>SEQ ID NO：17
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
cttgaattcg ctgccggaaa tcatcatttt tt 32
<210>SEQ ID NO：18
<211>1298
<212>DNA
<213>ldhA
1 CTTATGAAAC TCGCCGTTTA TAGCACAAAA CAGTACGACA AGAAGTACCT GCAACAGGTG
61 AACGAGTCCT TTGGCTTTGA GCTGGAATTT TTTGACTTTC TGCTGACGGA AAAAACCGCT
121 AAAACTGCCA ATGGCTGCGA AGCGGTATGT ATTTTCGTAA ACGATGACGG CAGCCGCCCG
181 GTGCTGGAAG AGCTGAAAAA GCACGGCGTT AAATATATCG CCCTGCGCTG TGCCGGTTTC
241 AATAACGTCG ACCTTGACGC GGCAAAAGAA CTGGGGCTGA AAGTAGTCCG TGTTCCAGCC
301 TATGATCCAG AGGCCGTTGC TGAACACGCC ATCGGTATGA TGATGACGCT GAACCGCCGT
361 ATTCACCGCG CGTATCAGCG TACCCGTGAT GCTAACTTCT CTCTGGAAGG TCTGACCGGC
421 TTTACTATGT ATGGCAAAAC GGCAGGCGTT ATCGGTACCG GTAAAATCGG TGTGGCGATG
481 CTGCGCATTC TGAAAGGTTT TGGTATGCGT CTGCTGGCGT TCGATCCGTA TCCAAGTGCA
541 GCGGCGCTGG AACTCGGTGT GGAGTATGTC GATCTGCCAA CCCTGTTCTC TGAATCAGAC
601 GTTATCTCTC TGCACTGCCC GCTGACACCG GAAAACTATC ATCTGTTGAA CGAAGCCGCC
661 TTCGAACAGA TGAAAAATGG CGTGATGATC GTCAATACCA GTCGCGGTGC ATTGATTGAT
721 TCTCAGGCAG CAATTGAAGC GCTGAAAAAT CAGAAAATTG GTTCGTTGGG TATGGACGTG
781 TATGAGAACG AACGCGATCT ATTCTTTGAA GATAAATCCA ACGACGTGAT CCAGGATGAC
841 GTATTCCGTC GCCTGTCTGC CTGCCACAAC GTGCTGTTTA CCGGGCACCA GGCATTCCTG
901 ACAGCAGAAG CTCTGACCAG TATTTCTCAG ACTACGCTGC AAAACTTAAG CAATCTGGAA
961 AAAGGCGAAA CCTGCCCGAA CGAACTGGTT TAATCTTGCC GCTCCCCTGC ATTCCAGGGG
1021AGCTGATTCA GATAATCCCC AATGACCTTT CATCCTCTAT TCTTAAAATA GTCCTGAGTC
1081AGAAACTGTA ATTGAGAACC ACAATGAAGA AAGTAGCCGC GTTTGTTGCG CTAAGCCTGC
1141TGATGGCGGG ATGTGTAAGT AATGACAAAA TTGCTGTTAC GCCAGAACAG CTACAGCATC
1201ATCGCTTTGT GCTGGAAAGC GTAAACGGTA AGCCCGTGAC CAGCGATAAA AATCCGCCAG
1261AAATCAGCTT TGGTGAAAAA ATGATGATTT CCGGCAGC
<210>SEQ ID NO：19
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
ccggaattcc aatccatccg ttgaatgag 29
<210>SEQ ID NO：20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
ccggaattcc tgtcatgcca gagttgacgg tc 32
<210>SEQ ID NO：21
<211>2071
<212>DNA
<213>ptsG’
1 CAATCCATCC GTTGAATGAG TTTTTTTAAA GCTCGTAATT AATGGCTAAA ACGAGTAAAG
61 TTCACCGCCG AAAATTGGGC GGTGAATAAC CACGTTTGAA ATATTGTGAC ATATGTTTTG
121 TCAAAATGTG CAACTTCTCC AATGATCTGA AGTTGAAACG TGATAGCCGT CAAACAAATT
181 GGCACTGAAT TATTTTACTC TGTGTAATAA ATAAAGGGCG CTTAGATGCC CTGTACACGG
241 CGAGGCTCTC CCCCCTTGCC ACGCGTGAGA ACGTAAAAAA AGCACCCATA CTCAGGAGCA
301 CTCTCAATTA TGTTTAAGAA TGCATTTGCT AACCTGCAAA AGGTCGGTAA ATCGCTGATG
361 CTGCCGGTAT CCGTACTGCC TATCGCAGGT ATTCTGCTGG GCGTCGGTTC CGCGAATTTC
421 AGCTGGCTGC CCGCCGTTGT ATCGCATGTT ATGGCAGAAG CAGGCGGTTC CGTCTTTGCA
481 AACATGCCAC TGATTTTTGC GATCGGTGTC GCCCTCGGCT TTACCAATAA CGATGGCGTA
541 TCCGCGCTGG CCGCAGTTGT TGCCTATGGC ATCATGGTTA AAACCATGGC CGTGGTTGCG
601 CCACTGGTAC TGCATTTACC TGCTGAAGAA ATCGCCTCTA AACACCTGGC GGATACTGGC
661 GTACTCGGAG GGATTATCTC CGGTGCGATC GCAGCGTACA TGTTTAACCG TTTCTACCGT
721 ATTAAGCTGC CTGAGTATCT TGGCTTCTTT GCCGGTAAAC GCTTTGTGCC GATCATTTCT
781 GGCCTGGCTG CCATCTTTAC TGGCGTTGTG CTGTCCTTCA TTTGGCCGCC GATTGGTTCT
841 GCAATCCAGA CCTTCTCTCA GTGGGCTGCT TACCAGAACC CGGTAGTTGC GTTTGGCATT
901 TACGGTTTCA TCGAACGTTG CCTGGTACCG TTTGGTCTGC ACCACATCTG GAACGTACCT
961 TTCCAGATGC AGATTGGTGA ATACACCAAC GCAGCAGGTC AGGTTTTCCA CGGCGACATT
1021CCGCGTTATA TGGCGGGTGA CCCGACTGCG GGTAAACTGT CTGGTGGCTT CCTGTTCAAA
1081ATGTACGGTC TGCCAGCTGC CGCAATTGCT ATCTGGCACT CTGCTAAACC AGAAAACCGC
1141GCGAAAGTGG GCGGTATTAT GATCTCCGCG GCGCTGACCT CGTTCCTGAC CGGTATCACC
1201GAGCCGATCG AGTTCTCCTT CATGTTCGTT GCGCCGATCC TGTACATCAT CCACGCGATT
1261CTGGCAGGCC TGGCATTCCC AATCTGTATT CTTCTGGGGA TGCGTGACGG TACGTCGTTC
1321TCGCACGGTC TGATCGACTT CATCGTTCTG TCTGGTAACA GCAGCAAACT GTGGCTGTTC
1381CCGATCGTCG GTATCGGTTA TGCGATTGTT TACTACACCA TCTTCCGCGT GCTGATTAAA
1441GCACTGGATC TGAAAACGCC GGGTCGTGAA GACGCGACTG AAGATGCAAA AGCGACAGGT
1501ACCAGCGAAA TGGCACCGGC TCTGGTTGCT GCATTTGGTG GTAAAGAAAA CATTACTAAC
1561CTCGACGCAT GTATTACCCG TCTGCGCGTC AGCGTTGCTG ATGTGTCTAA AGTGGATCAG
1621GCCGGCCTGA AGAAACTGGG CGCAGCGGGC GTAGTGGTTG CTGGTTCTGG TGTTCAGGCG
1681ATTTTCGGTA CTAAATCCGA TAACCTGAAA ACCGAGATGG ATGAGTACAT CCGTAACCAC
1741TAATCCGTAA GACGTTGGGG AGACTAAGGC AGCCAGATGG CTGCCTTTTT TACAGGTGTT
1801ATTCAGAATT GATACGTGCC GGTAATGCTG AAATTACGCG GTGTGCCGTA GACGATAGAA
1861CCTTCCACGT TGGTATCGTA GGTTTTGTCG AACAGGTTAT TGACGTTCCC CTGTAACGAG
1921AAGTTTTTCG TCACCTGGTA GCGGGTGAAG AGATCCACCA GCGCGTAGCT ACCTTGCTCG
1981GCGCGGAAGG TGCCATACGG CGTCACGGTG TCGGTATACA CGCGATTTTG CCAGTTAACA
2041CCACCGCCGA CCGTCAACTC TGGCATGACA G
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
ccggaattcg atcgatattt acagggagc 29
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
ccggaattca gtgatagttg acgag 25
<210>SEQ ID NO：24
<211>1272
<212>DNA
<213>glk’
1 GATCGATATT TACAGGGAGC CTGCCTTTCC GGCGTTGTTG TTATGCCCCC AGGTATTTAC
61 AGTGTGAGAA AGAATTATTT TGACTTTAGC GGAGCAGTTG AAGAATGACA AAGTATGCAT
121 TAGTCGGTGA TGTGGGCGGC ACCAACGCAC GTCTTGCTCT GTGTGATATT GCCAGTGGTG
181 AAATCTCGCA GGCTAAGACC TATTCAGGGC TTGATTACCC CAGCCTCGAA GCGGTCATTC
241 GCGTTTATCT TGAAGAACAT AAGGTCGAGG TGAAAGACGG CTGTATTGCC ATCGCTTGCC
301 CAATTACCGG TGACTGGGTG GCGATGACCA ACCATACCTG GGCGTTCTCA ATTGCCGAAA
361 TGAAAAAGAA TCTCGGTTTT AGCCATCTGG AAATTATTAA CGATTTTACC GCTGTATCGA
421 TGGCGATCCC GATGCTGAAA AAAGAGCATC TGATTCAGTT TGGTGGCGCA GAACCGGTCG
481 AAGGTAAGCC TATTGCGGTT TACGGTGCCG GAACGGGGCT TGGGGTTGCG CATCTGGTCC
541 ATGTCGATAA GCGTTGGGTA AGCTTGCCAG GCGAAGGCGG TCACGTTGAT TTTGCGCCGA
601 ATAGTGAAGA AGAGGCCATT ATCCTCGAAA TATTGCGTGC GGAAATTGGT CATGTTTCGG
661 CGGAGCGCGT GCTTTCTGGC CCTGGGCTGG TGAATTTGTA TCGCGCAATT GTGAAAGCTG
721 ACAACCGCCT GCCAGAAAAT CTCAAGCCAA AAGATATTAC CGAACGCGCG CTGGCTGACA
781 GCTGCACCGA TTGCCGCCGC GCATTGTCGC TGTTTTGCGT CATTATGGGC CGTTTTGGCG
841 GCAATCTGGC GCTCAATCTC GGGACATTTG GCGGCGTGTT TATTGCGGGC GGTATCGTGC
901 CGCGCTTCCT TGAGTTCTTC AAAGCCTCCG GTTTCCGTGC CGCATTTGAA GATAAAGGGC
961 GCTTTAAAGA ATATGTCCAT GATATTCCGG TGTATCTCAT CGTCCATGAC AATCCGGGCC
1021TTCTCGGTTC CGGTGCACAT TTACGCCAGA CCTTAGGTCA CATTCTGTAA ATCCTTCCTT
1081TTATATCGGG AGGTAACTCT CCCGATAATC TTTTAAATCA TACAGTTTAT TCAATTTTTC
1141TTTGTGTCCC CTCACAAGGT CGACCTGCGT CACACTTCCG TACAGCGGGA TTAATTCTCC
1201AGTAAATGCA TTATTTGTCT GGTAACGGCG ATTTGTTTTG CACGTTCATA ATTTCACTCG
1261TCAACTATCA CT
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
ccggaattca ggtgagcgaa atggttga 28
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<211>26
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ccggaattcc aacagtctta cagtcc 26
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<213>manZ’
1 AGGTGAGCGA AATGGTTGAT ACAACTCAAA CTACCACCGA GAAAAAACTC ACTCAAAGTG
61 ATATTCGTGG CGTCTTCCTG CGTTCTAACC TCTTCCAGGG TTCATGGAAC TTCGAACGTA
121 TGCAGGCACT GGGTTTCTGC TTCTCTATGG TACCGGCAAT TCGTCGCCTC TACCCTGAGA
181 ACAACGAAGC TCGTAAACAA GCTATTCGCC GTCACCTGGA GTTCTTTAAC ACCCAGCCGT
241 TCGTGGCTGC GCCGATTCTC GGCGTAACCC TGGCGCTGGA AGAACAGCGT GCTAATGGCG
301 CAGAGATCGA CGACGGTGCT ATCAACGGTA TCAAAGTCGG TTTGATGGGG CCACTGGCTG
361 GTGTAGGCGA CCCGATCTTC TGGGGAACCG TACGTCCGGT ATTTGCAGCA CTGGGTGCCG
421 GTATCGCGAT GAGCGGCAGC CTGTTAGGTC CGCTGCTGTT CTTCATCCTG TTTAACCTGG
481 TGCGTCTGGC AACCCGTTAC TACGGCGTAG CGTATGGTTA CTCCAAAGGT ATCGATATCG
541 TTAAAGATAT GGGTGGTGGC TTCCTGCAAA AACTGACGGA AGGGGCGTCT ATCCTCGGCC
601 TGTTTGTCAT GGGGGCATTG GTTAACAAGT GGACACATGT CAACATCCCG CTGGTTGTCT
661 CTCGCATTAC TGACCAGACG GGCAAAGAAC ACGTTACTAC TGTCCAGACT ATTCTGGACC
721 AGTTAATGCC AGGCCTGGTA CCACTGCTGC TGACCTTTGC TTGTATGTGG CTACTGCGCA
781 AAAAAGTTAA CCCGCTGTGG ATCATCGTTG GCTTCTTCGT CATCGGTATC GCTGGTTACG
841 CTTGCGGCCT GCTGGGACTG TAAGACTGTT G
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ccggaattcc ctgattatgg agttcaatat gcaagcc 37
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<211>37
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ccggaattcg actgcacagt tagccgttat ttgtcga 37
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<213>xylA’
1 CCTGATTATG GAGTTCAATA TGCAAGCCTA TTTTGACCAG CTCGATCGCG TTCGTTATGA
61 AGGCTCAAAA TCCTCAAACC CGTTAGCATT CCGTCACTAC AATCCCGACG AACTGGTGTT
121 GGGTAAGCGT ATGGAAGAGC ACTTGCGTTT TGCCGCCTGC TACTGGCACA CCTTCTGCTG
181 GAACGGGGCG GATATGTTTG GTGTGGGGGC GTTTAATCGT CCGTGGCAGC AGCCTGGTGA
241 GGCACTGGCG TTGGCGAAGC GTAAAGCAGA TGTCGCATTT GAGTTTTTCC ACAAGTTACA
301 TGTGCCATTT TATTGCTTCC ACGATGTGGA TGTTTCCCCT GAGGGCGCGT CGTTAAAAGA
361 GTACATCAAT AATTTTGCGC AAATGGTTGA TGTCCTGGCA GGCAAGCAAG AAGAGAGCGG
421 CGTGAAGCTG CTGTGGGGAA CGGCCAACTG CTTTACAAAC CCTCGCTACG GCGCGGGTGC
481 GGCGACGAAC CCAGATCCTG AAGTCTTCAG CTGGGCGGCA ACGCAAGTTG TTACAGCGAT
541 GGAAGCAACC CATAAATTGG GCGGTGAAAA CTATGTCCTG TGGGGCGGTC GTGAAGGTTA
601 CGAAACGCTG TTAAATACCG ACTTGCGTCA GGAGCGTGAA CAACTGGGCC GCTTTATGCA
661 GATGGTGGTT GAGCATAAAC ATAAAATCGG TTTCCAGGGC ACGTTGCTTA TCGAACCGAA
721 ACCGCAAGAA CCGACCAAAC ATCAATATGA TTACGATGCC GCGACGGTCT ATGGCTTCCT
781 GAAACAGTTT GGTCTGGAAA AAGAGATTAA ACTGAACATT GAAGCTAACC ACGCGACGCT
841 GGCAGGTCAC TCTTTCCATC ATGAAATAGC CACCGCCATT GCGCTTGGCC TGTTCGGTTC
901 TGTCGACGCC AACCGTGGCG ATGCGCAACT GGGCTGGGAC ACCGACCAGT TCCCGAACAG
961 TGTGGAAGAG AATGCGCTGG TGATGTATGA AATTCTCAAA GCAGGCGGTT TCACCACCGG
1021TGGTCTGAAC TTCGATGCCA AAGTACGTCG TCAAAGTACT GATAAATATG ATCTGTTTTA
1081CGGTCATATC GGCGCGATGG ATACGATGGC ACTGGCGCTG AAAATTGCAG CGCGCATGAT
1141TGAAGATGGC GAGCTGGATA AACGCATCGC GCAGCGTTAT TCCGGCTGGA ATAGCGAATT
1201GGGCCAGCAA ATCCTGAAAG GCCAAATGTC ACTGGCAGAT TTAGCCAAAT ATGCTCAGGA
1261ACATCATTTG TCTCCGGTGC ATCAGAGTGG TCGCCAGGAA CAACTGGAAA ATCTGGTAAA
1321CCATTATCTG TTCGACAAAT AACGGCTAAC TGTGCAGTCC GTTGGCCCGG TTATCGGTAG
1381CGATACCGGG CATTTTTTTA AGGAACGATC GATATGTATA TCGGGATAGA TCTTGGCACC
1441TCGGGCGTAA AAGTTATTTT GCTCAACGAG CAGGGTGAGG TGGTTGCTGC GCAAACGGAA
1501AAGCTGACCG TTTCGCGCCC GCATCCACTC TGGTCGGAAC AAGACCCGGA ACAGTGGTGG
1561CAGGCAACTG ATCGCGCAAT GAAAGCTCTG GGCGATCAGC ATTCTCTGCA GGAC