对映异构体混合物的去消旋方法.pdf

《对映异构体混合物的去消旋方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《对映异构体混合物的去消旋方法.pdf（20页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 101981197 A (43)申请公布日 2011.02.23 CN 101981197 A *CN101981197A* (21)申请号 200980111538.7 (22)申请日 2009.03.26 A503/2008 2008.04.01 AT C12P 7/02(2006.01) C12P 41/00(2006.01) (71)申请人 赢创德固赛有限责任公司 地址 德国埃森 (72)发明人 U丁格迪森 J普费弗 W克劳蒂尔 C格鲁贝尔 C沃斯 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 石克虎 林森 (54) 发明名称 对映。

2、异构体混合物的去消旋方法 (57) 摘要 本发明涉及仲醇对映异构体混合物的酶去消 旋方法， 该方法通过借助立体选择性醇脱氢酶及 其辅因子的氧化和还原反应的结合进行， 其中旋 光活性仲醇中的一种对映异构体形式上选择性地 被氧化成相应的酮， 其随后选择性地被还原成光 学对映体， 同时为通过附加酶的还原反应提供了 还原形式的辅因子， 其特征在于使用了两种具有 相反立体选择性和不同辅因子选择性的醇脱氢酶 以及两种相应的不同辅因子， 用于氧化和还原反 应， 并且用附加酶在平行的酶反应中将氧化的和 还原的辅因子互变， 通过两种醇脱氢酶的选择或 使用附加酶对两种辅因子的选择性差异可以控制 去消旋的方向朝向两。

3、种对映异构体之一。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.09.29 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2009/053576 2009.03.26 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/121785 DE 2009.10.08 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 7 页 CN 101981205 A1/1 页 2 1. 仲醇对映异构体混合物的酶去消旋方法， 该方法通过借助立体选择性醇脱氢酶及其 辅因子的氧化和还原反应的结合进行， 其中光学活性仲醇中的一种对映异构。

4、体形式上选择 性地被氧化成相应的酮， 其随后选择性地被还原成光学对映体， 同时为通过附加酶的还原 反应提供了还原形式的辅因子， 其特征在于使用了两种具有相反立体选择性和不同辅因子选择性的醇脱氢酶以及两 种相应的不同辅因子， 用于氧化和还原反应， 并且用附加酶在平行的酶反应中将氧化的和 还原的辅因子互变， 通过两种醇脱氢酶的选择或使用附加酶对两种辅因子的选择性差异可 以控制去消旋的方向朝向两种对映异构体之一。 2. 根据权利要求 1 的方法， 其特征在于所用的醇脱氢酶是细菌的醇脱氢酶。 3.根据权利要求1或2的方法， 其特征在于所用的醇脱氢酶是来自芽孢杆菌属、 假单胞 菌属、 棒状杆菌属、 红球。

5、菌属、 乳杆菌属或热厌氧菌属的醇脱氢酶。 4. 根据权利要求 1 的方法， 其特征在于所用的醇脱氢酶是来自酵母菌株的酶。 5. 根据权利要求 4 的方法， 其特征在于所用的醇脱氢酶是来自曲霉属、 假丝酵母属、 毕 赤酵母属或糖酵母属的醇脱氢酶。 6. 根据权利要求 1 至 5 任一项的方法， 其特征在于以 1 1 的活性比来使用所述两种 醇脱氢酶。 7. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于以 1IE 的总量来使用所述两种醇脱氢 酶。 8. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于以至少 2mmol/l 的浓度来使用外消旋 仲醇。 9. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于所用的。

6、附加酶是葡萄糖脱氢酶， 葡萄 糖 6- 磷酸脱氢酶， 甲酸脱氢酶或核苷酸转氢酶。 10. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于以 2IE 的量来使用所述附加酶。 11. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于以每 mol 仲醇至少 0.3mol 的量来使 用所述附加酶的底物。 12. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于以催化量来使用所述辅因子。 13. 根据权利要求 9 的方法， 其特征在于以 2 至 3mol的量来使用所述辅因子， 基于仲 醇。 14. 根据前述权利要求任一项的方法， 其特征在于使用了选自水、 水和一种或多种有机 溶剂的单相或多相混合物以及离子液体的溶剂。 。

7、15. 根据权利要求 14 的方法， 其特征在于所用的溶剂是含水缓冲体系。 权 利 要 求 书 CN 101981197 A CN 101981205 A1/11 页 3 对映异构体混合物的去消旋方法 发明领域 0001 本发明涉及使用酶体系将对映异构体混合物去消旋的方法 现有技术 0002 在立体异构领域中， 近些年来在消旋和去消旋中已经获得了相当大的进展， 消旋 即光学异构体转化成其对应物， 以获得外消旋混合物， 去消旋是消旋程序的精确逆转。 尽管 在立体不稳定化合物的情况中， 例如， 氰醇、 半 ( 硫代 )- 乙缩醛、 - 取代的羰基化合物和 - 取代的乙内酰脲， 可以通过简单的、 温。

8、和的酸或碱催化实现外消旋， 但立体稳定化合物， 例如， 仲醇和手性胺， 外消旋要难得多。 0003 后者已经成为可能， 例如， 通过过渡金属配合物催化的氧化还原过程， 其中通过前 手性 sp2- 杂化中间产物将在手性中心是天然 sp3- 杂化的一个对映异构体转化成另一个。 参见， 例如， O.Pamies 和 J.E.的研究， Trends Biotechnol.22， 130-135(2004) 和 Chem.Rev.103， 3247-3261(2003) ； H.Pellissier， Tetrahedron 59， 8291-8327(2003) ； M.J.Kim， Y.Ahn 和 。

9、J.Park， Curr.Opin.Biotechnol.13， 578-587(2002) ； V.Zimmermann， M.Beller和U.Kragl， Org.Process Res.Dev.10， 622-627(2006) ； Y.Asano和S.Yamaguchi， J.Am.Chem.Soc.127， 7696-7697(2005)。 0004 在生物合成领域中， 其固有地是高度特异性的， 仅有少数 “真实” 的外消旋酶是 已知的， 因为在自然界对外消旋几乎不存在任何需求这与工业相反。例如， 用于 - 羟 基羧酸 ( 例如， 扁桃酸衍生物 )、 - 氨基酸和乙内酰脲的外消旋催。

10、化的少数一些特异 性酶是已知的 ( 参见， 例如， B.Schnell， K.Faber 和 W.Kroutil， Adv.Synth.Catal.345， 653-666(2003)。对于仲醇和伯胺的外消旋， 长期以来实际上没有定义的酶是已知的。 0005 本发明人的研究组在 Chem.Eur.J.13， 8271-8276(2007) 中公开了一种新的外消 旋策略， 其是基于反应的热力学观点， 替代了反应的动力学观点 ： 在由两种对映异构体 R 和 S 以及前手性中间产物 P 组成的反应体系中， 两种光学对映体中的每一种与中间产物是处 于化学和热力学平衡的， 即，和使用两种相反 (entg。

11、egengesetzt) 对映选择性 的醇脱氢酶(下文中称为缩写ADH)的数种组合， 这些酶利用相同的辅因子， NAD或NADP(烟 酰胺 - 腺嘌呤 - 二核苷酸 ( 磷酸 )， 可以使不同光学活性的仲醇 ( 包括偶姻 ) 外消旋。通 过辅因子量以及氧化和还原形式的之间的比例 ( 即， NAD+:NADH 和 NADP+:NADPH) 的合适选 择将醇 / 酮平衡保持在醇的一侧 ； 对于解释， 参见图 1。 0006 将 NAD(P)+的比例设定为最小时， 从纯 (S)- 异构体出发进行， 在几个小时的反应 时间后， 获得了所需的外消旋化合物。酮中间产物的量降至低于 10， 并且在一些情况中。

12、， 降至低于 1。相反， 仅使用一种高选择性 ADH 的比较实验对于大部分测试的 ADH 是失败 的。只有在一种情况中， 在 14 天的反应时间后， 获得了 82 ee 的产量 ( 对映异构体过量， 即， 光学产量 )。 0007 在最近才由本发明人公开的研究中 (C.V.Voss， C.C.Gruber 和 W.Kroutil， Angew. Chem.Int.Ed.47， 741-745(2008)， 公开了使用由粪产碱杆菌 (Alcaligenes faecalis) 细 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A2/11 页 4 胞形式的用于醇氧化的对映选择。

13、性细菌酶构成的串联系统， 立体选择性 ADH 和 NAD 作为辅 因子， 通过前手性酮作为中间产物的仲醇外消旋化合物的去消旋。通过作为 “附加酶” 或 “辅助酶” 的葡萄糖脱氢酶 ( 下文中， 缩写为 GHD) 平行进行的催化氧化使葡萄糖被氧化成葡 糖酸内酯或葡糖酸， 辅因子有效 “再生” ， 即， 从氧化形式返回至还原形式 ； 对于解释， 参见图 2。 0008 在使用冻干粪产碱杆菌细胞的初步实验中， 令人惊讶地， 发现没有去消旋， 而替代 的是作为起始底物的对映异构体纯的醇的消旋化， 这归因于作为冻干结果的细胞渗透性的 增强。 使用具有完整细胞膜的新鲜收集的细胞， 使得氧化和还原彼此分开进。

14、行， 使得可以选 择性地转化不同仲醇的外消旋化合物， 并且所需对映异构体的产量 99 ee。 0009 然而， 该现有技术具有几个缺陷。 首先， 提供用于氧化的酶混合物的粪产碱杆菌体 系不能以精确的术语来限定， 使得在其进行的反应中可能存在相当大的变化， 并且因此再 现性根本不高。其次， 在所有现有的方法中， 对于每摩尔异构化醇的辅因子再生， 消耗 1mol 用于氧化的氧， 和化学计量上， 1mol 葡萄糖， 并且作为副产物， 另外获得了 1mol 葡糖酸或葡 糖酸内酯。 0010 因此， 本发明的目的是提供改良的去消旋方法， 其避免了以上的缺陷。 0011 发明描述 0012 已经令人惊讶地。

15、发现了通过改良的方法实现了这个目的， 该方法通过借助立体选 择性醇脱氢酶及其辅因子的氧化和还原反应的结合用于仲醇对映异构体混合物的酶去消 旋， 其中光学活性仲醇的一个对映异构体形式上 (formal) 选择性地被氧化成对应的酮， 其 随后选择性地被还原成光学对映体， 同时给通过附加酶的还原反应提供辅因子的还原形 式。 根据本发明的方法的特征在于使用了两种具有相反立体选择性和不同辅因子选择性的 醇脱氢酶， 和两种对应的不同辅因子， 用于氧化和还原反应， 并且氧化的和还原的辅因子在 使用附加酶的平行酶反应中互变， 通过两种醇脱氢酶的选择或使用附加酶对两种辅因子的 选择性差异可以控制去消旋的方向朝向。

16、于两种对映异构体之一。 0013 通过根据本发明的方法， 可以实现具有实质上定量的光学产量的去消旋， 即 99 ee， 而不会出现当系统一达到稳定的平衡， 平行反应过程中就化学计量地消耗试剂， 正 如之后将详细地解释的。此外， 精确地限定， 使用纯的酶 ( 两种 ADH 和附加酶 ) 用于催化， 这独有地导致了过程中的可逆反应和极好的再现性。最后， 该方法可以在简单的一锅法反 应中进行， 就时间或空间而言， 不需要各个部分反应之间的分离。 0014 所用的醇脱氢酶优选是可购得的或容易获得的醇脱氢酶， 例如， 来自芽孢杆菌 属 (Bacillus)、 假单胞菌属 (Pseudomonas)、 棒。

17、状杆菌属 (Corynebacterium)、 红球菌属 (Rhodococcus)、 乳杆菌属 (Lactobacillus) 和 / 或热厌氧菌属 (Thermoanaerobium) 的菌 株的细菌酶， 例如， 来自赤红球菌 (Rhodococcus ruber)、 马乳酒样乳杆菌 (Lactobacillus kefir) 或布氏热厌氧杆菌 (Thermoanaerobium brockii) 菌株的那些或来自酵母菌株的 酶， 如曲霉属 (Aspergillus)、 假丝酵母属 (Candida)、 毕赤酵母属 (Pichia) 或糖酵母属 (Saccharomyces)， 因为这些对。

18、于对映异构体过量和反应速率特别给予了特别好的结果。 然 而， 对于合适ADH对的选择是特别关键的需求， 两种ADH必须具有相反的立体选择性和不同 的辅因子选择性。 辅因子相应地从ADH的特别选择而产生， 通常是NAD和NADP， 并优选只以 催化的量来使用。 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A3/11 页 5 0015 图3说明了本发明方法中的反应过程， 其中HTS表示 “氢负离子转移体系” ， 将理解 其表示辅因子 “再生” 的副反应， 其通过称为 “Aux” 的附加酶来催化， 即， 氧化和还原形式的 互变。k1至 k4表示氢负离子转移体系的一级反应的表观。

19、速率常数。 0016 如图3A中所示的， 通过两种相反立体选择性的ADH催化仲醇对映异构体的氧化和 还原反应 ( 图解中未显示 )。当进行 (S)- 来产生 (R)- 对映异构体的反应时， 具有 NAD 辅 因子优先的 (S)- 选择性 ADH 的 (S)- 异构体的氧化消除了来自醇的氢阴离子， 并将其转移 至辅因子的氧化形式 NAD+， 作为结果， 其转化成还原形式 NADH。基本上同时地， 附加酶 Aux 从 NADH 获取该氢阴离子 ( 这产生了 “Aux-H” )， 然后将其转移至氧化形式的第二个辅因子 NADP+， 这提供了 NADP+的还原形式 NADPH。这通过第二个具有 NAD。

20、P 优先的 (R)- 选择性 ADH 依次将氢化物转移至酮中间产物 P， 这将酮中间产物 P 还原成 (R)- 对映异构体。在反方向 中， 即， 在 (R)- 异构体转化成 (S)- 形式中， 类似地进行了相反的反应过程。 0017 如果表现出酶 / 辅因子体系保持平衡， 同一个氢阴离子通过以上解释的反应， 并 最终返回到新的立体反转的醇分子。 0018 当附加酶是核苷酸转氢酶时， 以上述的简单形式进行氢阴离子通过附加酶从一个 辅因子至另一个的转移。在这种情况中， 图 3B 中的 Aux-H 表示酶与氢阴离子的复合物。然 而， 由于测试的核苷酸转氢酶没有产生令人满意的结果， 本发明人在他们对替。

21、代物的研究 中发现了替代直接转移氢化物的核苷酸转氢酶， 其他的脱氢酶 / 底物体系来呈现其作用也 是可能的。在这种情况中， Aux-H 表示对应于附加酶的底物的还原形式。 0019 原则上有用的附加酶包括所有辅因子依赖性氧化还原酶， 其不会破坏待去消旋的 仲醇的氧化和还原反应。脱氢酶， 优选葡萄糖脱氢酶 (GDH)、 葡萄糖 6- 磷酸脱氢酶 (G6PDH) 和甲酸脱氢酶 (FDH)， 产生了非常好的结果， 并且因此是优选的附加酶。 0020 在头两种情况中， 作为氢化物转移至底物的结果， 葡糖酸或葡糖酸内酯或其 6- 磷 酸盐被还原成葡萄糖或葡萄糖 6- 磷酸盐 ( 其产生 “Aux-H” 。

22、)， 并立即被再次氧化。在使用 CO2的第三种情况中， 情形相似， CO2与作为 Aux-H 的甲酸盐保持平衡， 尽管甲酸盐被氧化成 CO2的反应平衡远离二氧化碳侧， 原则上证实了反应的可逆性。 因为在根据本发明的方法中 没有 ( 或几乎没有 ) 消耗附加的底物， 并因此只需要少量， 甲酸脱氢酶 / 甲酸盐 /CO2体系 完全适于本发明的目的， 之后的实施例将显示。 0021 如上所述， 一达到平衡状态， 根据本发明的方法就不再导致试剂的化学计算消耗。 由于这取决于具体的酶 / 底物组合及其选择性， 因此预测或预先调节是不可能的。因此， 在 实践中， 在去消旋过程的开始时建立这种平衡。在该阶段。

23、中， 其通常持续几分钟， 实际上消 耗了少量的附加底物， 即， 葡萄糖或葡萄糖酸， 甲酸盐或 CO2。 0022 其中进行仲醇异构化的方向主要取决于两种 ADH 的立体选择性和辅因子选择性， 但随后也取决于附加酶对两种辅因子的不同选择性。对于以上方案中所示的实例， 其从具 有 NAD 优先的 (S)- 选择性 ADH 和具有 NADP 优先的 (R)- 选择性 ADH 开始进行， 实际上可以 通过附加酶的辅因子选择性来预先调整去消旋的方向， 这是为什么也可以相当合适地将其 称为 “控制酶” 。 附加酶的氧化或还原模式中的辅因子选择性导致NADH和NADP+转化成NAD+ 和 NADPH 的作用。

24、 ( 图 3B 中 ： k1+k3 k2+k4)， 或导致 NAD+和 NADPH 转化成 NADH 和 NADP+的 作用 ( 图 3B 中 ： k1+k3 k2+k4)， 这在前一种情况中导致 (R)- 对映异构体的形成， 在另一种 情况中导致 (S)- 对映异构体的形成。当省略控制酶或其底物或控制酶对两种辅因子之一 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A4/11 页 6 不具有选择性时 ( 公认这是非常不可能的 )， 不仅没有观察到任何去消旋而且 - 从光学纯 的醇开始进行 - 实际上是逆反应， 即， 外消旋， 从图 4 中也能明显看出 ： 图 4A 和 。

25、4B 显示了使 用 2- 辛醇作为仲醇各自对一种甲酸脱氢酶的反应特征， 甲酸脱氢酶具有相反的辅因子选 择性， 并且图 4C 显示了没有 FDH 的体系的反应特征。 0023 然而， 也可以通过具有相反立体选择性或辅因子选择性的逆转的 ADH 对的选择来 逆转去消旋的方向。例如， 在以上的方案中， - 使用相同的附加酶时 - 使用了具有 NADP 优 先的(S)-选择性ADH和具有NAD优先的(R)-选择性ADH， 外消旋化合物选择性地形成任选 光学纯的 (S)- 对映异构体， 替代了 (R)- 对映异构体。 0024 根据本发明的方法通常在溶剂中进行， 溶剂选自水， 水和一种或多种有机溶剂的 。

26、单相或多相混合物， 和离子液体， 尽管出于成本和稳定性的原因， 优选使用常规的含水缓冲 体系。 0025 理解含水缓冲体系意思是含有物质 ( 例如盐 ) 的含水溶剂， 这使得溶液对 pH 变化不敏感。已知的含水缓冲体系为， 例如， 碳酸 / 碳酸氢盐体系， 碳酸 - 硅酸盐缓冲 剂， 醋酸 / 醋酸盐缓冲剂， 磷酸盐缓冲剂， Michaelis 巴比妥 / 醋酸盐缓冲剂， 氨缓冲剂， HEPES(4-(2- 羟乙基 )-1- 哌嗪乙烷磺酸 ) 和 MES(2-(N- 吗啉代 ) 乙烷磺酸 )。 0026 附图简述 0027 图 1 显示了 ： 在通过前手性酮下通过两种特定的 ADH 的酶催化外。

27、消旋的原理 0028 图 2 显示了 ： 具有限定菌株背景的光学拆分和随后的辅因子再生 0029 图 3 显示了 ： 本发明的通过两种特定的 ADH 和用于辅因子再生的辅助酶 ( 氢负离 子转移体系 ： HTS) 的酶 - 催化去消旋的原理 0030 图 4 显示了 ： 1- 苯乙醇的外消旋混合物的迁移 ： A 和 B ： 使用甲酸脱氢酶 (FDH)， C ： 没用甲酸脱氢酶 (FDH) 0031 图 5 显示了 ： 通过 NAD- 或 NADP- 特异性甲酸脱氢酶 (FDH) 的外消旋混合物的迁移 0032 图 6 显示了 ： 不同反应参数变化对反应平衡的影响 0033 图 7 显示了 ： 。

28、不同浓度的附加葡萄糖底物对外消旋平衡的建立的影响， A ： 不同葡 萄糖浓度对时间的曲线， B ： 在 6 小时的反应时间后， ee 与特定葡萄糖浓度的关联。 0034 实施例 ： 0035 现在参照代表性的、 非限制性的工作实施例详细描述本发明。 0036 材料、 来源和方法 0037 酶 0038 ADH-A ： 来自赤红球菌的醇脱氢酶 ( 可从 BioCatalytics Inc. 购得， 现在为 Codexis， Pasadena， USA)。 0039 LK-ADH ： 来自马乳酒样乳杆菌的醇脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich， Vienna 购得， #05643， 0.4。

29、IE/mg)。 0040 RE-ADH ： 来自红串红球菌 (Rhodococcus erythropolis) 的醇脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich， Vienna 购得， #68482， 20IE/ml)。 0041 LB-ADH ： 醇脱氢酶 002( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在为 Codexis， #05.11)。 0042 ADH-T ： 醇脱氢酶 005( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在为 Codexis， 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A5/11 页 7 #2。

30、6.10)。 0043 ADH-PR2 ： 醇 脱 氢 酶 007(Jlich Chiral Solutions 购 得， 现 在 为 Codexis， #42.10)。 0044 TB-ADH ： 来自布氏热厌氧杆菌的醇脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich 购得， #A9287， 30-90IE/mg)。 0045 G6PDH ： 来自面包酵母的葡萄糖 6- 磷酸脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich 购得， #49271， 240IE/mg)。 0046 GLY-DH ： 来自白地霉(Geotrichum candidum)的甘油脱氢酶(可从Sigma-Aldrich 购得，。

31、 #49860， 30IE/mg)。 0047 LDH-SC ： 来自葡萄球菌的 D- 乳酸脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich 购得， #17847， 120IE/mg)。 0048 LDH-LS ： 来自乳杆菌的D-乳酸脱氢酶(可从Sigma-Aldrich购得， #59023， 400IE/ mg)。 0049 LDH-RM ： 来自兔子肌肉的 L- 乳酸脱氢酶 ( 可从 Sigma-Aldrich 购得， #61311， 500IE/mg)。 0050 FDH1 ： NADP- 特异性甲酸脱氢酶 001( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在 为 C。

32、odexis， #25.10， 47IE/ml)。 0051 FDH2 ： NADP- 特异性甲酸脱氢酶 002( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在 为 Codexis， #24.11， 200IE/ml)。 0052 FDH3 ： NAD- 特异性甲酸脱氢酶 001( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在为 Codexis， #09.11， 200IE/ml)。 0053 FDH4 ： 来自酵母的甲酸脱氢酶 ( 可从 Boehringer Mannheim， GmbH 购得， #204226， 0.5IE/ml)。 0054 FDH。

33、5 ： 来自博伊丁假丝酵母 (Candida boidinii) 的甲酸脱氢酶 ( 来自 Martina Pohl 的礼物， 杜塞尔多夫大学， 德国 )。 0055 GDH-BM ： D- 葡萄糖脱氢酶 001( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在为 Codexis， #22.10， 30IE/ml)。 0056 GDH-BS ： D- 葡萄糖脱氢酶 002( 可从 Jlich Chiral Solutions 购得， 现在为 Codexis， #29.10， 500IE/ml)。 0057 酶的特性 0058 表 1 ： 醇脱氢酶 说 明 书 CN 101981。

34、197 A CN 101981205 A6/11 页 8 0059 0060 表 2 ： 附加酶 0061 0062 a ： 来自文献或来自制造商的数据 0063 b ： 未找到数据 0064 化学物质 0065 rac-2- 辛 醇 (#04504， MW 130.23g/mol)， (R)-2- 辛 醇 (#74864， MW 130.23g/ mol)， (S)-2- 辛 醇 (#74863， MW 130.23g/mol)， 2- 辛 酮 (#53220， MW 128.21g/mol)， 甲酸铵 (#09739， 63.06g/mol)， 甲酸钠 (#3996-15-4， 69.02。

35、g/mol) 和作为钾盐的甲酸 (#57444-81-2， MW 85.13g/mol) 购自 Sigma-Aldrich， Vienna。 0066 用于提取和后处理的化学物质 ： 0067 用于提取的乙酸乙酯 (#441977) 购自 Brenntag CEE GmbH， Ort， 并以新蒸馏的形 式来使用。用于乙酰化的 DMAP(#29224， MW 122.17g/mol) 和醋酸酐 (#45830， MW 102.09g/ 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A7/11 页 9 mol) 购自 Sigma-Aldrich， Vienna。 0068 一。

36、般程序 0069 用于迁移光学组成的建模方法 ： 0070 商业酶的活性通常以国际单位 (IE) 来记录。然而， 这些单位总体上报告了特定的 酶对不同于在此所用底物的活性。因此测定了使用合适 “再生” 体系 ( 通常是 FDH 和甲酸 铵， 5eq.) 的 2- 辛酮还原中所用的酶活性。对于所有的实验， 使用了 1IE2- 辛醇的 ADH。 0071 体系 1 ： 将 ADH-A， LK-ADH， NADP- 特异性 FDH(2IE)， 甲酸铵 ( 底物浓度的 3eq.)， NAD+和 NADP+( 底物， 3mol ) 悬浮于 TRIS-HCl 中 (50mM， pH7.5， 总体积 0.5。

37、ml)。通过加入 外消旋 2- 辛醇 (0.5l， 8mmol/ml， ee 3 ) 开始反应。在 30下振荡 (130 转每分 )3h 后， 用 EtOAc(500l) 提取混合物并离心， 以产生相分离。 0072 体系 2 ： 除了使用 NAD- 特异性 FDH(2IE) 以外， 与体系 1 相同。 0073 体系3 ： 除了使用GDH-BS(2IE)和-D-葡萄糖(1eq.， 8mmol/l)以外， 与体系1相 同。 0074 体系 4 ： 除了使用 ADH-T 和 ADH-PR2 以外， 与体系 1 相同。 0075 体系 5 ： 除了使用 ADH-T、 ADH-PR2 和 NAD- 。

38、特异性 FDH 以外， 与体系 1 相同。 0076 体系 6 ： 除了使用 RE-ADH 和布氏热厌氧杆菌 ADH 以外， 与体系 1 相同。 0077 分析方法 0078 手性 GC-FID 分析 ： 0079 通过在30下2h内添加醋酸酐(100ml)和DMAP(0.5mg)， 将醇乙酰化。 后处理后， 通过 GC-FID 和 GC-MSD， 使用手性固定相， 来分析产物。 0080 在装有FID检测仪的气相色谱仪上， 使用Chrompack Chirasil DEXCB柱(Varian， 25m0.32mm0.25mm， 1.0 巴 H2)， 进行手性 GC-FID 分析， 检测仪温度。

39、 250， 分流比 90 1。 0081 手性 GC-MSD 分析 ： 0082 在装有质量选择性的Agilent 5975C检测仪和FID的Agilent 7890AGC 系统上， 使用Chrompack Chirasil DEX CB柱(Varian 25m0.32mm0.25mm， 1.0巴H2)， 进行手性 GC-MSD 分析， 检测仪温度 250， 分流比 90 1。 0083 手性 HPLC 分析 ： 0084 在装有 DGU-20A5 脱气装置、 LC-20AD 液相色谱仪、 SIL-20AC 自动取样器、 CBM-20A 通信总线、 SPD-M20A 二极管阵列检测器和 CTO。

40、-20AC 柱式加热炉的 Shimadzu HPLC 系统 上， 使用 Chiralpak AD 柱 (Daicel， 0.4625cm)， 进行 HPLC 分析， 使用 n- 庚烷 / 异丙醇 90 10， 0.5ml/min， 18。 0085 实施例 1 至 13， 比较实施例 1 至 4 0086 在以下条件下， 使用 2- 辛醇作为仲醇， 使用不同的 ADH/ 附加酶组合进行去消旋 ： 底物浓度 8mmol/l， 反应时间 3-12h， 30， 在 TRIS-HCl(pH7.5， 50mM) 或磷酸盐缓冲液中 (pH7.5， 50mM)， 在130转每分下振荡。 ADH的每一种为约1。

41、IE(对于2-辛醇作为底物) ； NAD+ 和 NADP+为催化量 ( 大约 3mol )。附加酶 ： 2IE( 对于其天然底物， 如制造商给出的 )。附 加底物 ( 甲酸盐、 葡萄糖、 葡萄糖 6- 磷酸盐、 乳酸盐和甘油 ) ： 16mmol/l。组成和结果汇集 在以下的表 3 中。 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A8/11 页 10 0087 表 3 ： rac-2- 辛醇的去消旋 0088 0089 显然本发明实施例 1 至 13 中测试的酶组合从 2- 辛醇外消旋化合物以显著的良好 性获得了对映异构体之一， 在一些情况中， 实质上定量的对映异构体。

42、过量， 并且几乎完全定 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A9/11 页 11 量产生。在使用相同 ADH 对的情况中， 附加酶的辅因子特异性的逆转使得可以控制去消旋 的方向 ： 参考实施例 1/2+3、 8/9、 10/11、 12/13。实施例 8 和 9 的结果也以图形形式显示于 图 5 中。 0090 相反， 在比较实施例1至4的使用乳酸脱氢酶或甘油脱氢酶的情况中， 不管怎样都 不存在去消旋。 0091 实施例 14 至 22 0092 在这些实施例中， 使用实施例 1 的酶体系， 改变不同的反应参数， 以研究其对反应 过程的作用。实施例 14 至 2。

43、1 的结果以图形形式显示于图 6A-H 中， 并且实施例 22 的那些 结果显示于图 7A-B 中。 0093 实施例 14 0094 在此将反应时间在1至6h之间变化， 并且发现了在3h后已经获得了定量转化。 因 此将该组的更多实施例进行 3h( 图 6A)。 0095 实施例 15 0096 使用 6h 的给定反应时间， 将醇浓度在 1 至 243mmol/l 之间变化， 并且 2 至 8mmol/ l 给出了最好的结果。在较高的浓度下， 需要较长的反应时间或较大量的酶， 以实现完全转 化 ( 图 6B)。 0097 实施例 16 0098 将两种ADH的总量在0.1至3.4IE之间变化，。

44、 并且发现1IE是最佳活性量(图6C)。 0099 实施例 17 0100 将两种 ADH 彼此的活性比 ( 以 IE 计 ) 在 0.01 至 13.5 之间变化， 并且发现了约 0.2 至约 0.7 之间的比例是最有效的， 尽管缺少 1 1 比例的值 ( 图 6D)。 0101 实施例 18 和 19 0102 每种情况中两种 ADH 之一的活性在 0.1 至 7.6 或 3.4IE 之间变化， 使用 1IE 的第 二种 ADH 的活性， 并且发现了 1IE 也构成了第二种酶的最佳活性量， 因此 1 1 是两种 ADH 的最佳活性比 ( 图 6E， 6F)。 0103 实施例 20 010。

45、4 将 FDH 的量在 0.3 至 64.0IE 之间变化， 并且发现了从 2IE 的量已经获得了定量转 化 ( 图 6G)。 0105 实施例 21 0106 将辅因子 NAD 和 NADP 的合并浓度在 0 至 96mol之间变化， 并且发现了约 2 至 3mol的浓度是最有效的 ( 图 6H)。 0107 实施例 22 0108 重复实施例5， 除了在0.5至12h的反应时间内， 附加底物(即， 葡萄糖)的浓度在 醇浓度的 0.1 至 3 当量之间变化， 如图 7A 中所示。图 7B 中显示了随着葡萄糖当量在 0.1 至 1 之间的变化， 6h 后的对映异构体过量 ee。从 0.3 当量。

46、开始， 已经获得了 99 ee， 这 表明了明显化学计量不足比例的附加底物也足够了。 0109 实施例 23 至 32 0110 在这些实施例中， 使用实施例 1 的酶体系， 尝试了 10 种其他仲醇的外消旋化合物 的去消旋。醇的选择考虑了文献中对涉及的两种 ADH 描述的底物谱。原则上， 通过本发明 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A10/11 页 12 的方法， 以这种方式应当可以去消旋， 所有底物存在于两种 ADH 的底物谱中。这些实施例中 所用的仲醇的结构列于以下的表 4 中。 0111 表 4 ： 实施例 1 和 23 至 32 的结构 0112 。

47、0113 外消旋化的结果汇集于以下的表 5 中。 0114 表 5 ： 仲醇的外消旋化合物的去消旋结果 0115 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A11/11 页 13 0116 a) ： 外消旋底物的 ee 3。 0117 b)Cahn-Ingold-Prelog 顺序规则的变化 0118 从表中可以清楚地看到， 通过根据本发明的方法， 所有测试的外消旋化合物可以 在短时间内以极好的选择性得到实质性的定量去消旋， 并且更多官能度的存在没有降低根 据本发明的方法的效率。 0119 因此， 本发明构成了对立体异构化领域的有价值的充实， 并且因此本发明毫无疑 问。

48、地存在工业实用性。 说 明 书 CN 101981197 A CN 101981205 A1/7 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A2/7 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A3/7 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A4/7 页 17 图 4 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A5/7 页 18 图 5 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A6/7 页 19 图 6 说 明 书 附 图 CN 101981197 A CN 101981205 A7/7 页 20 图 7 说 明 书 附 图 CN 101981197 A 。