发明概述
在第一方面，本文中提供了诊断受试者是否患有胃相关病症或处于发生胃相关病症的风险中，确定患有胃癌和/或相关病症的受试者的预后和/或治疗患有此类病症的受试者的方法，其包括：测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发生所述病症的风险中。
在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
在某些实施方案中，差异表达的至少一个生物标志物选自图13-表1中所列的组。
在某些实施方案中，病症包括慢性胃炎并且至少一个生物标志物选自上调的miR-1和miR-155。
在某些实施方案中，病症包括慢性胃炎并且至少一个生物标志物选自下调的miR-205、miR-203、miR-202、miR-20和miR-26b。
在某些实施方案中，差异表达的至少一个生物标志物选自图14-表2中所列的组。
在某些实施方案中，病症包括胃腺癌并且至少一个生物标志物选自上调的miR-21、miR-223、miR-25、miR-17-5-p、miR-125b、miR-181b、miR-106a、miR-107、miR-92、miR-103、miR-221、miR-93、miR-100、miR-181、miR-106b、miR-191、miR-214、miR-130、miR-342、miR-222、miR-320和miR-99b。
在某些实施方案中，病症包括胃腺癌并且至少一个生物标志物选自下调的miR-136、miR-218、miR-212、miR-96、miR-339和miR-130b。
在某些实施方案中，差异表达的至少一个生物标志物选自图16-表3中所列的组：miR-21、miR-223、miR-25、miR-92、miR-107、miR-93、miR-106b、miR-17-5p、miR-181b和miR-106a。
在某些实施方案中，至少一个生物标志物包括miR-160b-25簇：miR-106b、miR-93和miR-25。
在另一个方面，本文中提供了至少一个生物标志物(其包括miR-160b-25簇：miR-106b、miR-93和miR-25)在调控图18-表6中所列的一个或多个基因：PHLPPL、GM632、ALX4、PLEKHM1、JOSD1、ZFPM2、GATAD2B、ZNF238、ATXN1、NEUROD1、BCL2L11、KLF12、UBE2W、OSBPL5、SNF1LK、PCAF、PAPOLA和CFL2的表达中的用途。
在另一个方面，本文中提供了在有此需要的受试者中调控E2F1的表达的方法，其包括施用足以调控E2F1的表达的有效量的miR-106b和/或miR-93或其功能性变体。
在另一个方面，本文中提供了miR-106b和miR-93用于在有此需要的受试者中调控E2F1表达的用途。
在另一个方面，本文中提供了调控TGFE肿瘤抑制途径(tumor suppressor pathway)(其干扰CDKN1A(p21Waf1/Cip1)和/或BCL2L11(Bim)的表达)的方法，该方法包括上调miR-106b、miR-93和miR-25中的一个或多个。
在另一个方面，本文中提供了miR-106b-25簇在胃癌中在E2F1转录后调控和TGFE抗性发生的调控中的用途。
在另一个方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中控制E2F1表达的方法，其包括调控受试者中的miR-106b和miR-93的水平。
在另一个方面，本文中提供了E2F1在有此需要的受试者中调控miR-106b-25表达(与Mcm7平行)的用途。
在另一个方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中控制E2F1蛋白合成速率，防止其过量积累的方法，所述方法包括调控miR-106b-25簇在受试者中的水平。
在另一个方面，本文中提供了miR-106b和miR-93在有此需要的受试者中削弱TGFE-诱导的细胞周期停滞的用途。
在另一个方面，本文中提供了miR-106b和miR-93在有此需要的受试者中通过在转录后水平上抑制p21的表达干扰TGFO-诱导的细胞周期停滞的用途。
在另一个方面，本文中提供了miR-25与miR-106b和miR-93在有此需要的受试者中协同阻止TGFO-诱导的细胞凋亡的发生的用途。
在另一个方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中调控miR-106b-25簇的表达以阻止使胃癌细胞免受细胞凋亡的保护作用的方法。
在另一个方面，本文中提供了胃癌的独特微RNA表达特征(signature)，其包括调控肿瘤微RNA加工的一个或多个生物标志物的表达的改变。
在另一个方面，本文中提供了影响胃癌中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使有此需要的受试者中一个或多个微RNA失调。
在某些实施方案中，所述方法还包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
在某些实施方案中，所述方法还包括改变miR-106b、miR-93和miR-25中的一个或多个的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
在另一个方面，本文中提供了微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析用于鉴定在人胃癌中发生的微RNA功能的改变的用途。
权利要求1的方法，其包括确定胃癌受试者的预后，包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中：i)所述生物标志物与此类癌症中的不利预后相关；和ii)相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
在某些实施方案中，所述方法还包括诊断受试者是否患有胃癌或处于发生胃癌的风险中，其包括：1)从获自受试者的测试样品反转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；2)将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和3)将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有此类癌症或处于发生此类癌症的风险中。
在某些实施方案中，相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号下调，和/或其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号上调。
在某些实施方案中，选自表13、表14和表16中所列的组的至少一个生物标志物的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的此类癌症或处于发生所述癌症的风险中。
在另一个方面，本文中提供了胃病症或疾病的生物标志物，其包括miR-106b、miR-93和mir-25中的一个或多个。
在另一个方面，本文中提供了用于在胃癌细胞中调控蛋白质表达的方法，其包括在胃癌细胞中调控下列中的一个或多个的表达：miR-106b、miR-93和mir-25。
在另一个方面，本文中提供了用于在胃癌细胞中调控E2F1、CDKN1A(p21Waf1Cip1)和BCL2L11(Bim)中的一个或多个的表达的组合物，所述组合物包括下列中的一个或多个：miR-106b、miR-93和mir-25或其功能变体。
在另一个方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中调控E2F1和p21/WAF1蛋白水平中的一个或多个的方法，其包括使用下列中的一个或多个：miR-106b、miR-93和mir-25，或其功能性变体中。
在另一个方面，本文中提供了用于在有此需要的受试者中增加胃癌细胞中p21/WAF1和/或E2F1蛋白水平的包含反义miR-106b的组合物。
在另一个方面，本文中提供了治疗患有胃癌的受试者的胃癌的方法，在所述胃癌中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调，所述方法包括：1)当至少一个生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制；或2)当至少一个生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一个生物标志物的表达的化合物，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。
在另一个方面，本文中提供了治疗受试者的胃癌的方法，其包括：1)测定相对于对照细胞，胃癌细胞中至少一个生物标志物的量；和2)通过：i)如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物；或ii)如果癌细胞中表达的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个生物标志物的表达的化合物来改变胃癌细胞中表达的生物标志物的量。
在另一个方面，本文中提供了用于治疗胃癌的药物组合物，其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体。
在某些实施方案中，至少一个分离的生物标志物相应于相对于对照细胞在胃癌细胞中下调的生物标志物。
在某些实施方案中，药物组合物包含至少一个miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
在另一个方面，本文中提供了鉴定抗胃癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与胃癌细胞中减少的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗胃癌试剂。
在另一个方面，本文中提供了鉴定抗胃癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与胃癌细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗癌症试剂。
在另一个方面，本文中提供了评估疗法预防、诊断和/或治疗胃癌相关疾病的有效性的方法，其包括：i)使动物经历其有效性有待评估的疗法，和ii)通过估计表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物来测定测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性水平。
前述权利要求的方法，其中候选治疗剂包括：药物组合物、营养组合物(nutraceutical composition)和顺势疗法组合物中的一种或多种。
在某些实施方案中，待评估的疗法用于人受试者。
在另一个方面，本文中提供了制品，其包含：至少一个结合胃癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
在另一个方面，本文中提供了用于筛选治疗胃癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中试剂盒包括：表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物的一个或多个试剂和表达至少一个生物标志物的细胞。
在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一个生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
在另一个方面，本文中提供了干扰胃癌相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体中疾病并发症的严重度，其中所述试剂包括表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
在另一个方面，本文中提供了治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体中胃癌相关疾病并发症的严重度的方法，其包括：给个体施用干扰至少胃癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包括表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
在另一个方面，本文中提供了干扰至少胃癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体中胃癌相关疾病并发症的严重度，其中所述试剂包括表13、14和16的一个或多个中所列的至少一个生物标志物。
在另一个方面，本文中提供了包含miR-106b、miR-93和miR-25中的一个或多个的反义抑制剂的组合物。
在另一个方面，本文中提供了治疗有此需要的受试者的胃病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的组合物。
在某些实施方案中，预防性施用组合物。
在某些实施方案中，组合物的施用延迟了胃癌的一个或多个症状的发作。
在某些实施方案中，组合物的施用抑制胃癌的发生。
在某些实施方案中，组合物的施用抑制肿瘤生长。
在另一个方面，本文中提供了用于检测生物学样品中胃癌的存在的方法，该方法包括：i)将怀疑包含胃癌的生物学样品暴露于为此的标志物；和ii)如果有的话，检测样品中标志物的存在或不存在。
在某些实施方案中，标志物包括可检测的标记。
在某些实施方案中，所述方法还包括将来自受试者的生物学样品中标志物的量与来自正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比。
在某些实施方案中，所述方法还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在受试者中随时间增加还是减少。
在另一个方面，本文中提供了用于治疗受试者的胃癌的方法，所述方法包括：胃癌受体激动剂。
在某些实施方案中，受体激动剂是：miR-106b、miR-93和miR-25中的一个或多个的反义抑制剂。
在另一个方面，本文中提供了制造用于治疗胃癌的药物的用途，其包含选自下列的核酸分子：表13、14和16中显示的miR、来源于其的序列、来自此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
在某些实施方案中，所述药物包含提供选自下列的序列的核酸分子：表13、14和16中所列的miR、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
在另一个方面，本文中提供了鉴定诱导胃癌细胞的分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，该方法包括步骤：i)培养来源于胃肿瘤的细胞，ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析步骤(i)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化和iv)鉴定诱导步骤(i)与(ii)之间miR的表达水平的改变的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，化合物是治疗癌症的治疗剂。
当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
优选实施方案的详述
在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本公开内容以更全面地描述本发明涉及的现有技术。
E2F1活性的下调和对TGFE的抗性是胃癌的标志。微RNA(miRNA)是在人恶性肿瘤中被频繁误调的(misregulated)小非编码RNA。
此处我们显示，在人胃肿瘤的亚组中上调的miR-106b-25簇与其宿主基因Mcm7平行地被E2F1激活。反过来，miR-106b和miR-93调控E2F1的表达，从而建立了miRNA-指导的负反馈回路。此外，此类miRNA的上调削弱了干扰CDKN1A(p21Waf1/Cip1)和BCL2L11(Bim)的表达的TGFE肿瘤抑制途径。结合起来，这些结果显示，miR-106b-25簇参与E2F1转录后调控并且可在胃癌中在TGFE抗性的发生中起着至关重要的作用。
微RNA(miRNA)是可调控大约30％的所有人基因的表达(通过抑制靶mRNA翻译或诱导其降解)的小非编码RNA。此类基因在人恶性肿瘤中异常表达，这使得它们的生物学重要性变得日益明显。胃癌引起每年12％的所有癌症相关死亡，这要求基于对该疾病发作背后的分子机制的更深刻理解的更好的治疗。
此处，我们显示miR-106b-25簇的过表达导致重要的癌症相关基因例如TGFE效应物p21Waf1/Cip1和Bim的失调，从而中断了G1/S检查点并且赋予对依赖于TGFE的细胞凋亡的抗性。
我们还显示微RNA(miRNA)可参与胃肿瘤发生。MiRNA是据认为调控达到30％的人基因的表达(通过抑制mRNA翻译或诱导其降解)的非蛋白质编码性基因(Lewis等人，2005)。除了在细胞分化和器官发育中的至关重要的作用外(Kloosterman和Plasterk，2006)，miRNA在人癌症中被频繁误调(Lu等人，2005；Volinia等人，2006)并且它们可充当有效的癌基因或肿瘤抑制基因(Esquela-Kersher等人2006)。
此处我们显示E2F1调控miR-106b、miR-93和miR-25(包含在Mcm7基因中的一簇内含子miRNA)，包括它们在胃原发性肿瘤中的积累。反过来，miR-106b和miR-93控制E2F1的表达，从而建立了在阻止E 2F1自激活和可能地细胞凋亡中可能是非常重要的负反馈回路。
在另一方面，我们发现miR-106b、miR-93和miR-25的过表达通过干扰p21和Bim(分别为依赖于TGFE的细胞周期停滞和细胞凋亡的两个最下游的效应物)的合成引起减少的胃癌细胞对TGFE的应答。
此类miRNA促成了癌细胞中TGFE抗性的产生，在本文中本发明者现相信其代表了用于治疗胃癌的新型治疗靶。
在下列实施例中进一步解释本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，表示本发明的优选实施方案的这些实施例仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离其精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。
实施例I
人胃癌中miRNA表达的失调
大多数胃腺癌在通常与幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，HP)感染相关的慢性炎性背景的环境中发生(Uemura等人，2001)。然而，导致HP致癌性的分子机制仍然不清楚，尽管Th1免疫应答似乎在癌前病变例如胃萎缩和肠化生的发生中至关重要(Houghton等人，2002；Fox等人，2000)。
在搜索可能参与胃肿瘤发生的miRNA中，我们使用定制的miRNA微阵列分析了20个肠类型的胃原发性肿瘤(每一个肿瘤与来自相同患者的相邻非肿瘤胃组织配对)和6个胃癌细胞系的总体miRNA表达。为了鉴定与炎症和/或癌前病变相关的特异改变，我们首先将具有慢性胃炎的组织学体征的非肿瘤组织(n＝13)与另外的正常粘膜(n＝7)相比较。通过未配对微阵列显著性分析(SAM)显示，7个miRNA与慢性炎症相关，包括已知对癌症易感(Costinean等人，2006)并且在免疫应答的调控中起主要作用(Rodriguez等人，2007；Thai等人，2007)的miR-155(图1A，图13-表1)。
然后我们检查了胃原发性肿瘤和癌细胞系的miRNA表达特征谱：通过配对SAM显示，与非肿瘤对照相比较，总共14个miRNA在原发性肿瘤中展示了2倍或更大的中值过表达(图1B，图14-表2)。在这些miRNA中，除了不表达的miR-223以外，14个中有13个在表达方面排列高于第80百分位数(图15-表3)。只有5个miRNA在癌症中下调(图1B，图14-表2)。通过茎-环qRT-PCR验证了10个测试miRNA中的9个的微阵列数据(图16-表4)。在被误调的miRNA当中，miR-21、miR-223、miR-25和miR-17-5p在肿瘤中显示了最高的过表达，其分别具有4.5、4.2、3.7和3.7的中值倍数改变。
这些结果表明miRNA表达模式的特定改变是人胃癌的特征，因为肿瘤发生的最早步骤牵涉具有已知的致癌特性的miRNA例如miR-21(Meng等人，2006)和miR-17-5p(He等人，2005)。
miR-106b-25簇在胃癌中过表达
在过表达的miRNA当中，发现miR-25是特别有用的吸引人的候选物，因为其在胃肿瘤发生中起作用。事实上，这是在原发性胃肿瘤中第3强上调的miRNA(中值倍数改变：3.7；范围1.0-26.8)并且在所有人胃癌细胞系中排列在最高表达的miRNA之中(高于第97百分位数)。miR-106b(中值倍数改变：2.0；范围1.0-6.5)和miR-93(中值倍数改变：2.3；范围1.0-7.7)也在原发性肿瘤中上调并且在所有胃癌细胞系中高度表达(分别高于第82百分位数和第89百分位数)。
这3个miRNA(在下文中miR-106b-25)簇集在染色体7q22上的Mcm7的内含子13中并且在Mcm7初级RNA转录物的背景中活跃地共转录(Kim等人，2007和图1C-E)。几个研究报导了该区域在胃肿瘤中的扩增(Weiss等人，2004；Peng等人，2003；Takada等人，2005)。然而，我们在我们的样品中未能检测到miR-106b-25基因座的任何扩增(数据未显示)，这暗示着一定有其他机制促成miR-106b-25在胃癌中的过表达。
Mcm7在G1/S期转变中起着中枢作用，其协调染色体DNA上的复制叉的正确组装以及确保所有基因组在每一个细胞周期中复制一次并且只复制一次(Blow和Hodgson，2002)。由于Mcm7的过表达已与前列腺和子宫内膜癌中的不良预后相关联(Ren等人，2006；Li等人，2005)，因此我们假定Mcm7的致癌性可能至少部分地与包含的miRNA的过表达关联。此外，miR-106b-25簇与显示具有致癌作用的miR-17-92簇(He等人，2005；O′Donnell等人，2005；Dews等人，2006)共有高度的同源性(图1C)。
然后我们研究miR-106b-25簇。我们首先确定茎-环qRT-PCR的特异性。用于miR-106b、miR-93和miR-25的引物是高度特异的，然而miR-17-5p和miR-92的探针分别与miR-106a和miR-25交叉杂交(图9A)。然后，我们使用茎-环qRT-PCR在独立的一组10个胃原发性肿瘤(与来自相同患者的非肿瘤胃粘膜配对)中测定成熟miRNA类别的表达。
成熟miR-106b、miR-93和miR-25分别在6/10、6/10和5/10的这些肿瘤中过表达，虽然在它们的表达水平中不存在相互关联(图9B)。
我们通过常规qRT-PCR检查了相同肿瘤中miRNA前体的水平(图9C)，我们发现miR-106b、miR-93和miR-25前体类别在肿瘤中协同表达[r(106b/93)＝0.93；r(106b/25)＝0.78；r(93/25)＝0.88，图17-表5]。
在5个过表达miR-106b-25前体的肿瘤中，3个肿瘤也表达高水平的成熟miR-106b、miR-93和miR-25，然而剩余的肿瘤展示可变的各成熟miRNA的表达，这显示控制个体miRNA的另外的转录后调控水平。
Mcm7 mRNA也在5/10的肿瘤中过表达，这显示与miR-106b、miR-93和miR-25前体的水平几乎完全相关(分别地r＝0.98、0.92、0.72，图9C和图17-表5)。
这些数据显示，miR-106b-25前体与Mcm7 mRNA平行地在胃原发性肿瘤亚组中特异性过表达。虽然我们不能排除miR-106b-25具有独立启动子的可能性，但我们的结果显示胃肿瘤中miR-106b-25的转录由其宿主基因Mcm7驱动。此外，转录后机制也在决定成熟miR-106b-25的水平中起主要作用，如最近对于其他miRNA所提出的(Thomson等人，2006)。
负反馈回路控制E2F1和miR-106b-25的表达。
E2F1是反式激活参与染色体DNA复制的众多基因(Johnson和DeGregori，2006)(包括Mcm7(Suzuki等人，1998；Arata等人，2000))的转录因子。在本文中本发明者现相信，miR-106b-25的转录可类似地受E2F1调控。为了进行检测，我们首先确定E2F1蛋白水平的内源性波动是否相应于Mcm7和miR-106b-25表达的相似变化。有趣地，通过诺考达唑处理12小时而在有丝分裂中停滞的AGS胃癌细胞不表达E2F1蛋白并且显示Mcm7转录物(2倍)以及miR-106b、miR-93和miR-25前体(分别地4.0、5.2和12.0倍)的减少(与指数生长的细胞相比)。当细胞被释放并且重新进入G1期时，E2F1表达平行于Mcm7、miR-106b、miR-93和miR-25前体RNA的再积累。(图2A-C)。
该过程与E2F1表达直接相关，因为其特异性过表达(通过腺病毒转导)(图2D)或沉默(通过RNA干扰)(图2E)也诱导了miR-106b-25前体水平的一致改变。E2F1功能的丧失也在72小时后影响成熟miRNA的表达(图2F)。
为了进一步在体内验证数据，我们通过Western印迹分析了E2F1蛋白在10个原发性胃肿瘤中的表达并且发现E2F1蛋白与Mcm7/miR-106b-25前体表达之间的正相关(图2G)。事实上，5个过表达E2F1的肿瘤中有4个展示更高水平的Mcm7和miR-106b-25前体(图9C)。在这些肿瘤中，3个肿瘤也过表达成熟miR-106b、miR-93和miR-25(图9B)。然而，一个肿瘤显示Mcm7和miR-106b-25前体上调，而无可检测的E2F1水平，这显示其他转录因子也参与了miR-106b-25的调控。
这些结果表明E2F1同时调控miR-106b-25和Mcm7的表达，从而显示，胃癌中此类miRNA的过表达至少部分因E2F1的上调而引起。
最近，已提出miR-17-5p为E2F1的新转录后调控剂(O′Donnell等人，2005)。鉴于miR-17-5p、miR-106b和miR-93序列之间的相似性，我们探究了miR-106b和miR-93可能也参与E2F1表达的调控的可能性。因为这些miRNA广泛地在一组12个胃癌细胞系中表达(通过qRT-PCR进行分析)(图3A)，所以我们采用功能丧失法来拮抗miR-106b-25。抗miR-106b和miR-93的LNA反义寡核苷酸(ASO)的转染在Snu-16细胞中诱导E2F1蛋白的积累，这表明此类miRNA的内源水平控制其表达(图3B)。
此外，通过寡核苷酸转染或慢病毒转导产生的此类miRNA的过表达(图9D)明确地减少Snu-16和AGS胃癌细胞系中E2F1蛋白的水平(图3C和图3D)并且抑制含有E2F1 3′UTR的报告基因载体的表达。报告基因载体中预测的miRNA结合位点的突变消除该效应，从而表明miR-106b和miR-93直接与E2F1 3′UTR相互作用(图3E)。然而，在miR-106b和miR-93转染后，E2F1 mRNA减少2倍，这可能是由于部分mRNA降解或E2F1转录激活子的下调(图3F)。
已争辩，miR-17-5p可能通过抑制实际上激活E2F1转录并且也是miR-17-5p的靶的AIB-1蛋白来间接地抑制E2F1表达(Hossain等人，2006)。虽然miRNA作用于相同途径内的不同靶是非常合理的，但我们分析了AGS和Snu-16细胞中AIB-1蛋白的水平，并且我们发现，在分别用miR-106b或miR-93转染的细胞中水平微小减少或根本无差异，这显示AIB-1是miR-106b的真正低亲和力的靶，其可能只部分地促成E2F1的下调(图3C)。
总的来说，这些结果显示E2F1调控miR-106b-25的表达但也是miR-106b和miR-93的靶，从而建立了胃癌细胞中的负反馈回路。因为已知E2F1通过正反馈回路自激活其自己的启动子，因此此类miRNA可控制E2F1蛋白合成的速率，从而阻止其过度积累，如最近对于同源物miR-17-5p和miR-20a所提出的(Sylvestre等人，2007；Woods等人，2007)。
miR-106b和miR-93削弱TGFE-诱导的细胞周期停滞。
这些结果显示当细胞退出有丝分裂并且重新进入G1期时，E2F1迅速诱导miR-106b-25的转录。在此基础上，我们假设miR-106b-25与E2F1理想地协同抑制G0/G1相关活性的可能作用。因此，我们探询TargetScan数据库以寻找已知受E2F1负调控的基因，并且我们将CDKN1A(p21)鉴定为miR-106b和miR-93的假定的靶。该基因，通常在人癌症中功能失调，是细胞周期的关键抑制剂(Mattioli等人，2007)。有趣地，我们确认在Snu-16细胞中内源表达的miR-106b和miR-93转录后调控p21。事实上，它们的抑制(通过ASO)增强了p21蛋白的表达(图4A)。相反地，通过寡核苷酸转染(图4B)或慢病毒转导(图4C)获得的miR-106b和miR-93的上调抑制p21蛋白的表达而不显著改变p21 mRNA的水平(图4D)。此外，miR-106b和miR-93模拟物抑制含有p21 3′UTR的报告基因载体的表达，而预测的miRNA结合位点的突变消除该效应(图4E)。
鉴于p21在细胞周期调控中的重要性，我们决定阐明miR106b-25在控制胃癌细胞增殖中的作用。出人意料地，通过ASO转染诱导的miR-106b、miR-93和/或miR-25的功能丧失不产生Snu-16细胞的细胞周期和增殖的任何显著变化(图10A和图10C)。类似地，通过寡核苷酸转染或慢病毒转导产生的所述3个miRNA的过表达不显著改变AGS细胞的增殖速率和集落形成效率，虽然我们注意到在miR-93过表达时有限的但可重现的细胞周期干扰(+8％的S期细胞，图10B、10D和10E)。
我们使用GTL-16和MKN-74胃癌细胞系获得相似的结果(数据未显示)，这表明miR-106b-25的功能不是胃癌细胞体外存活和增殖所必需的。然而，通过RNAi对p21或E2F1的特异性沉默同样没有产生增殖的显著改变(图10G和10H)，从而确认这些癌症细胞系不对p21基础水平作出响应并且可很好地补偿E2F1表达的缺失。
然后我们阐明miR-106b-25在TGFO存在的情况下的作用：该细胞因子，通过诱导p21和其他抗增殖分子的表达，在胃肠道中适时确保成熟细胞的协同的细胞周期停滞和细胞凋亡，从而控制上皮细胞的生理更新(van den Brink和Offerhaus，2007)。该至关重要的肿瘤抑制途径的削弱是胃癌的标志(Ju等人，2003；Park等人，1994)。然而，Snu-16细胞是在体外仍然对相对高剂量的TGFO作出响应，经历G1/S停滞和随后大量细胞凋亡的少数胃癌细胞系之一(Ohgushi等人，2005和图5A)。然而，细胞活力在24小时后降低，这打开了研究与TGFO相关的早期分子变化的窗口。
有趣地，使用TGFO的刺激在16小时后(此时细胞生理性经历G1/S停滞)诱导E2F1蛋白、Mcm7 mRNA和miR-106b-25前体的显著下调，这表明此类miRNA的下调是对TGFO的生理响应的一部分(图5B和5C)。为了确定该过程的重要性，我们在TGFO存在的情况下通过在Snu-16细胞中引入miR-106b、miR-93和/或miR-25模拟物来中和miR-106b-25的下调。值得注意地，miR-93的过表达完全消除TGFO诱导的细胞周期停滞，而miR-106b部分地减少该效应(p＜0.0002)，与由此类miRNA诱导的p21下调的程度一致(图5D)。
相反地，通过ASO拮抗内源miR-106b和miR-93的表达显著增加经历依赖于TGFO的细胞周期停滞的Snu-16细胞的数目(p＜0.0013)并且恢复了细胞对亚适量的TGFO的敏感性(p＜0.0001)(否则这些细胞对所述剂量具有抗性)(图6A和6B)。
因此，在TGFO存在的情况下通过抑制内源miR106b和miR-93获得的p21上调的程度(图6C)是基础条件下的2倍(图4A)，这可能由p21 mRNA的活跃转录支持(图6D)。
为了确定p21在诱导与miR-106b和miR-93的功能获得/丧失相关的表型中的作用，我们通过RNAi(si-p21)在用TGFP处理的Snu-16细胞中特异性沉默p21。这几乎全面概括了miR-106b和miR-93的过表达对细胞周期分布的作用(图5D)，然而si-p21与miR-106b和miR-93的共转染显著减少了此类miRNA对TGFO-诱导的细胞周期停滞的作用，这表明p21是该生物学背景中的主要靶(图6E)。然而，在p21不存在的情况下仍然可观察到miR-93对依赖于TGFO的细胞周期停滞的小的但统计学上显著的作用(p＝0.0272)，这暗示着其他直接或间接的靶与p21协同作用。参与G1/S检查点的基因的表达的分析将p27指定为miR-93的可能的间接靶(图6F)。
这些数据显示miR-106b和miR-93主要通过在转录后水平上抑制p21的表达来干扰TGFO诱导的细胞周期停滞。然而，不依赖于p21的途径也可参与传递miR-93对细胞周期控制的完全作用。
miR-25与miR-106b和miR-93协同阻止TGFO诱导的细胞凋亡的发生。
这些结果显示miR-106b和miR-93在TGFP刺激的早期调控细胞周期停滞的作用。我们分析在延长的对TGFP的暴露(其最终导致细胞凋亡)后的miR-106b-25的功能(Ohgushi等人，2005，和图5B)。
我们通过四唑还原测定检查用TGFP刺激24至48小时的Snu-16细胞的活力。miR-106b、miR-93和/或miR-25模拟物在此类细胞中的引入诱导显著的对TGFP的抗性(图7A)。相反地，当所有3种miRNA同时被抑制时，ASO转染在活细胞数目方面诱导了达到统计学显著性(p＝0.003)的负趋势(图7B)。该结果通过FACS分析得到证实，其显示在沉默3种miRNA后亚二倍体细胞的数目显著增加(p＜0.001)。此外，该测定的更高的灵敏度允许检测在miR-106b、miR-93或miR-25的个别抑制后亚二倍体细胞的百分比的更小但显著的变化(p＜0.001)(图7C)。最后，miR-106b-25的沉默部分恢复对TGFE的敏感性(否则MKN-74细胞对其具有抗性)(图11)。结合起来，这些结果与其中内源miR-106b、miR-93和miR-25协同调控一个或多个介导依赖于TGFE的细胞凋亡的靶的表达的模型相符。
我们搜索TargetScan数据库以寻找细胞凋亡的效应物，并且我们在18个同时具有假定的miR-106b、miR-93和miR-25结合位点的人基因中将BCL2L11(Bim)鉴定为唯一强的候选物(图18-表6)。Bim是通过激活促凋亡分子如Box和Bad以及拮抗抗凋亡分子如Bcl2和Bill来在多种组织中关键性地调控细胞凋亡的仅BH3的蛋白(BH3-only protein)(Gross等人，1999)。为了正确地调控细胞凋亡，Bim与其伴侣蛋白的细胞内浓度的精细平衡是至关重要的。Bim是单倍不足的并且单个等位基因的失活甚至在不丧失另一个等位基因的情况下也可加速小鼠中Myc诱导的肿瘤的发生(Egle等人，2004)。值得注意的是，Bim是TGFE途径的最下游细胞凋亡效应物并且其下调在Snu-16细胞中消除了依赖于TGFE的细胞凋亡(Ohgushi等人，2005)。
我们确定了Bim是否是miR-106b-25的直接靶。Snu-16细胞表达Bim的所有3个主要的同种型，即Bim EL、Bim L和Bim S。有趣地，通过ASO转染拮抗内源miR-25在Snu-16细胞中诱导了所有3个同种型的积累，而通过寡核苷酸转染或慢病毒转导产生的miR-25的过表达减少了它们的表达。相反地，miR-106b和miR-93在所有3个测试的胃癌细胞系中不影响Bim的表达(图7D)。
虽然miR-106b和miR-93与miR-25在其他组织中协同调控Bim的表达仍然是可能的，但这支持其中细胞凋亡的多个效应物在胃癌中被3个miRNA中的每一个协同抑制的模型。
我们关注于作为此类细胞凋亡效应物之一的Bim并且通过萤光素酶测定确定，在其3′UTR上的miR-25的预测的结合位点介导靶识别和随后的翻译抑制(图7E)。此外，Bim EL和Bim L mRNA的水平在miR-25过表达后在Snu-16细胞中未发生改变，这标示着转录后调控机制(图7F)。
为了确定与miR-25的特异性抗细胞凋亡功能相关的Bim下调的重要性，我们使用抗其3个主要同种型的siRNA(si-Bim，图7D)在Snu-16细胞中抑制Bim蛋白，然后我们用TGFE处理这些细胞24小时。值得注意地，由si-Bim和miR-25赋予的免受细胞凋亡的保护作用非常相似，如通过亚二倍体DNA含量和膜联蛋白V染色所测定的。此外，Bim和miR-25的共转染不具有显著的累加效应(p＝0.6328)，这表明Bim下调在过表达miR-25的细胞中是对TGFE诱导的细胞凋亡的抗性的主要机制(图7G和图12)。
我们显示，被E2F1激活并且在人胃腺癌中上调的miR-106b-25簇改变了胃癌细胞对造成细胞周期停滞和细胞凋亡的TGFE的生理应答(图8)。
这些发现在胃癌模型中具有特别的意义，因为TGFE肿瘤抑制途径的削弱是胃肿瘤发生中的至关重要的步骤。
讨论
我们在胃癌发生的不同步骤中进行miRNA表达的基因组范围的分析。因为绝大多数胃肿瘤源于慢性炎性背景(Uemura等人，2001)，因此我们考虑区分癌前改变与肿瘤特异性改变的特定关联。
我们第一次鉴定了迄今为止一直被忽略的miRNA簇在人肿瘤中的特异性过表达。虽然我们关注于胃癌，但miR-106b、miR-93和miR-25在其他类型的癌症中的过表达也可能是共同的(但仍然被低估的)事件。
事实上，miR-106b-25的表达与参与细胞增殖的基础机制的E2F1和Mcm7的表达密切相关。例如，Mcm7通常在前列腺癌中过表达(Ren等人，2006)并且，事实上，我们之前在对该类型的癌症的大规模miRNA研究中描述了miR-25的上调(Volinia等人，2006)。此外，我们显示，通常用于测定miR-92(其在大多数人肿瘤中过表达(Volinia等人，2006))的表达的茎-环qRT-PCR探针，与miR-25交叉杂交。然而，鉴于几乎相同的序列，miR-106b-25和miR-17-92极可能协同发挥相似的(如果不相同的话)功能：事实上，我们发现miR-17-5p、miR-18a和miR-20a也抑制p21的表达，而miR-92抑制Bim的表达(F.P.和A.V.，未公布的数据)。此外，miR-106b-25和miR-17-92都受E2F1调控。然而此类簇也展示一些差异。例如，miR-106b与miR-17-5p相似，但其短3个核苷酸：据报导3′末端中的特定序列可确定miRNA的细胞内定位(Hwang等人，2007)。此外，miR-19家族不由miR-106b-25簇代表(图2A)。
在另一方面，miR-93属于miR-372和miR-373的相同家族：这3个miRNA在睾丸生殖细胞肿瘤中过表达，在所述细胞中它们减少LATS2的表达，从而使细胞对高p21水平不敏感(Voorhoeve等人，2006)。
如本文中所显示的，miR-93在相同的途径中起作用，直接靶向p21的表达。因此，现相信该miRNA家族参与调控细胞周期的至关重要的中枢的控制并且可在癌症中具有特殊关联性。
此外，miR-93与miR-291-3p、miR-294和miR-295共有高度序列同源性：此类miRNA在多能性ES细胞中特异性表达并且它们在分化后沉默或下调(Houbaviy等人，2003)。然而不希望受理论束缚，本发明者在本文中现相信，此类miRNA可类似地参与p21的调控。
本发明者显示，miRNA通过不同机制在细胞周期的控制中起作用。在E2F1的情况下，miRNA显示主要在调控性、冗余反馈回路的背景中起作用。事实上，位于分开的miRNA簇上的miR-106b、miR-93、miR-17-5p和miR-20a受E2F1调控并且可能协同抑制其翻译。
同时，我们发现此类miRNA参与p21表达的控制和对TGFE的早期应答。本发明者还相信，它们也控制汇聚于p21上的其他肿瘤抑制途径。由于突变、缺失、超甲基化、泛素化或错误定位(mislocalization)而产生的p21功能丧失是人胃癌中的常见事件和不利预后因素(Mattioli等人，2007)。然而，之前从未探究过miRNA在p21调控中的作用。因为80％的研究的胃原发性肿瘤不表达可检测水平的p21蛋白，因此我们不能确定miRNA与p21蛋白表达之间的负相关。然而，原发性肿瘤中的p21 mRNA水平通常与正常组织相当，这表明转录后调控是胃癌中p21下调的常见原因(F.P和A.V.，未公布的数据)。
有趣地，p21表达的诱导似乎是在TGFE刺激的早期引发miR-106b/miR-93相关应答的前提条件。相反地，通过RNAi沉默p21显著地减少了此类miRNA对细胞周期的作用。虽然通过计算机方法预测了每一个miRNA的数百个不同的靶，但存在日益增加的证据表明，“主要的miRNA靶”对于特定生物学功能可能是至关重要的。例如，miR-10b增强乳腺癌细胞的细胞运动性和侵袭力，但该表型在其靶HOXD10的组成型表达后被完全回复，尽管对于该miRNA预测了100多个靶(Ma和Weinberg，2007)。当然，要指出的是，这些观察不排除其中多个靶受单个miRNA的平行调控是发挥特定功能所必需的其他背景。此外，多个miRNA可协同发挥相同的功能。
这在miR-106b-25簇的情况下是保护胃癌细胞免受细胞凋亡。这样的作用在协同抑制不同促凋亡分子的表达的3个miRNA之间分配。我们将Bim(TGFE途径的最下游的细胞凋亡效应物(Ohgushi等人，2005))鉴定为miR-25的关键靶。这在胃癌模型中具有特别的意义。事实上，TGFE是胃动态平衡(homeostasis)的主要调控剂之一并且在通过细胞凋亡调控上皮细胞的生理更新中是必需的(van den Brink和Offerhaus，2007)。虽然miR-106b和miR-93的促凋亡靶的身份(identify)仍然不清楚，但我们可清楚地检测到分别与miR-106b、miR-93和/或miR-25的过表达和抑制相关的抗凋亡和促凋亡应答；这些特性出现在TGFE刺激的后期，此时细胞周期停滞消除并且细胞凋亡成为占优势的过程(其表征了胃细胞对TGFE的应答)。当3种ASO被一起递送时，可通过分析亚二倍体DNA含量容易地检测到的、在抑制单个miRNA后观察到的小的但显著的改变获得生物学一致性，这确认了这些成簇的miRNA之间的协同关系。
虽然通过四唑还原测定和亚二倍体DNA含量的分析在用单个ASO转染的TGFE刺激的细胞中观察到负趋势，但这在四唑还原测定中未达到统计学显著性。这归咎于与该测定相关的5-10％的标准误差，该标准误差在统计上排除更小的差异。相反地，亚二倍体DNA含量的分析中的标准误差在我们的手中低于2％。
当我们在原发性肿瘤中观察Bim表达时，我们注意到与正常组织相比普遍的过表达(F.P.和A.V.未公布的数据)。这与之前显示致癌胁迫(oncogenic stress)诱导Bim作为防止异常增殖的保卫机制的研究相符。特别地，Bim在Myc转基因小鼠中过表达，这决定了正常细胞的大量细胞凋亡。然而，肿瘤在这些小鼠中的发生与一个Bim等位基因的缺失(Bim变得不足)一致。尽管如此，与未经历致癌胁迫的健康组织相比较，Bim仍然明确地在肿瘤中过表达(Egle等人，2004)。因此，难以确定低于其发生Bim的不足的阈值，从而需要可选择的策略来确定miR-25上调在体内的重要性。
已描述了导致癌症中Bim下调的几个机制(从转录调控至蛋白降解)(Yano等人，2006；Tan等人，2005)。虽然所有这些机制明确地促成了Bim沉默，但我们提出miR-25干扰作为胃癌中Bim的转录后调控的新机制。
miRNA是否是恰当的细调分子或它们是否用作关键基因开关一直存在广泛争议。最近的研究表明，取决于特定的生物学背景，两个假说都可能是正确的。从这个角度看，miRNA在癌症中的治疗潜能可以与依赖于特定miRNA的功能变化的发生严格相关。了解肿瘤相关miRNA的作用机制在建立依赖于miRNA的肿瘤的分子诊断，允许合理地选择最终对基于miRNA的疗法应答的患者中是有用的。
实验方法
细胞培养和处理：
所有细胞系获自ATCC并且培养在补充有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中。用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，使用100nM微RNA前体(Ambion)、100nM si-p21(Santa Cruz)、100nM si-Bim(Cell Signalling)或100nM LNA微RNA反义寡核苷酸(Exiqon)转染细胞。在指定的时间收集蛋白质裂解物和总RNA。通过Northern印迹和茎-环qRT-PCR验证MiRNA的加工和表达。我们使用BLOCK-IT Fluorescent Oligo(Invitrogen)验证所有细胞系的转染效率(＞95％)。
为了进行同步化实验，将AGS细胞在含有0.03Pg/ml诺考达唑的10％FBS RPMI 1640中培养12小时，然后释放在新鲜培养基中。通过FACS分析跟踪通过细胞周期的进展直至8小时，之后细胞迅速丧失同步化。
为了进行TGFE实验，在6孔板中使用5ul Lipofectamine 2000和100nM miRNA前体(Ambion)或LNA反义寡核苷酸(Exiqon)在1∶1的Optimem(GIBCO)和RPMI 1640 10％FBS(Sigma)的混合物中转染2x106个Snu-16细胞。12小时后，用含有1ng/ml人重组TGFE1(Sigma)的RPMI 1640 10％FBS替换培养基。按照制造商的说明书，使用WST四唑盐(CCK-8，Dojindo)测定活细胞的数目。以一式三份进行所有实验。结果表示为平均值±SD。
qRT-PCR：
按照制造商的说明书(Applied Biosystems，Foster City，CA)，分别使用单管TaqMan MicroRNA Assays和Gene Expression Assay来测定成熟miRNA和其他mRNA。在GeneAmp PCR 9700 Thermocycler(Applied Biosystems)上进行所有RT反应，包括无模板对照和RT阴性对照。使用NanoDrop(NanoDrop Technologies，Inc.)测定RNA浓度。将样品针对RNU49或CAPN2(Applied Biosystems)进行标准化，如所指定的。使用ABI Prism 7900HT Sequence检测系统(Applied Biosystems)定量基因表达水平。以一式三份进行比较实时PCR，包括无模板对照。使用比较Ct法计算相对表达。
萤光素酶测定
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用1ug pGL3萤火虫萤光素酶报告基因载体(参见补充的实验方法)、0.1ug phRLSV40对照载体(Promega)和100nM微RNA前体(Ambion)在6孔板中共转染MKN-74胃癌细胞。在转染后24小时使用Dual Luciferase Assay(Promega)连续地测量萤火虫和海肾萤光素酶的活性。将各报告基因质粒转染至少2次(在不同天)并且以一式三份测定各样品。
流式细胞术
为了进行细胞周期分析，将2x106个细胞固定在冷的乙醇中，用RNA酶处理，然后用碘化丙啶(Sigma)染色。通过使用双重辨别门控(doublet discrimination gating)利用EPICS-XL扫描(Beckman Coulter)就DNA含量分析细胞。以一式三份进行所有分析，计数20,000个门控事件/样品。为了进行细胞凋亡分析，在冷的PBS中清洗细胞，将其与膜联蛋白V-FITC(BD Biopharmingen)和PI(Sigma)在黑暗中一起温育15分钟，然后在1小时内进行分析。
统计分析
实验的结果表示为平均值+/-SD。使用学生氏未配对t检验来比较测试样品与对照样品的值。P＜0.05表示显著差异。
实施例II
组织样品：
原发性胃肿瘤样品获自Department of Histopathology(Sant’Andrea Hospital，University of Rome “La Sapienza”，Italy)。所有样品具有患者的知情同意书并且进行了组织学确认。用于获得组织的方案由Sant’Andrea Hospital Bioethical Committee批准。将各肿瘤与来自相同患者的非肿瘤胃粘膜对照配对。
微阵列：
如所描述的(Liu等人，2004)进行微阵列分析。简而言之，将5ug总RNA用于在第2代miRNA微阵列芯片(V2)上进行杂交。这些芯片包含通过接触技术点印并且共价连接至聚合物基质的250个人miRNA的基因特异性40聚体寡核苷酸探针。将微阵列在25℃下于6X SSPE(0.9M NaCl_60mM NaH2PO4_H2O_8mM EDTA，pH 7.4)、30％甲酰胺中杂交18小时，在37℃下于0.75X TNT(Tris/HCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分钟，然后通过用链霉抗生物素蛋白-Alexa Fluor 647缀合物直接检测含有生物素的转录物的方法进行处理。通过使用微阵列扫描仪(将激光设置至635nm，使用固定的PMT设置和10mm的扫描分辨率)扫描经处理的载玻片。使用Global Median、Lowess或Quantile法标准化阵列数据，获得相似的结果。在本研究中公布的数据来源于Quantile标准化法。通过使用微阵列显著性分析(SAM)中的t检验法来鉴定差异表达的miRNA。
Western印迹：
用于免疫印迹的抗体如下：E2F1(Santa Cruz，小鼠单克隆抗体，1∶500)、AIB-1(Cell Signalling，小鼠单克隆抗体，1∶1000)、p21(Cell Signalling，小鼠单克隆抗体，1∶1000)、p27(Santa Cruz，小鼠单克隆抗体1∶500)、CDK2(Cell Signalling，小鼠单克隆抗体，1∶1000)、CDK4(Cell Signalling，小鼠单克隆抗体，1∶1000)、细胞周期蛋白D1(Cell Signalling，小鼠单克隆抗体，1∶1000)、细胞周期蛋白E(Santa Cruz，兔多克隆抗体，1∶500)、p15(Cell Signalling，兔多克隆抗体，1∶1000)、Bim(Cell Signalling，兔多克隆抗体1∶1000)、纽蛋白(Santa Cruz，小鼠单克隆抗体，1∶500)、GAPDH(Calbiochem，小鼠单克隆抗体，1∶3000)。使用GelDoc软件(Biorad)定量条带。
腺病毒和慢病毒感染：
Adeno-E2F1由G.Leone友好提供，并且如所描述的(Leone等人，1998)进行感染。从293T/17细胞基因组DNA PCR-扩增MiR-106b、miR-93、miR-25和miR-106b-25前体cDNA并且将其在CMV启动子之下克隆入变异的第三代慢病毒载体pRRL-CMV-PGK-GFP-WPRE(称为Tween)以同时转导报告基因GFP和miRNA。如所描述的(Bonci等人，2003)进行慢病毒上清液的制备和感染。慢病毒转导产生710倍的miRNA表达的变化，如通过qRT-PCR所测定的。通过荧光显微镜检查确认转导效率＞90％。
qRT-PCR(miRNA前体)：
为了进行微RNA前体qRT-PCR，在DNA酶处理(Ambion)后使用ThermoScript试剂盒(Invitrogen)通过逆转录将使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离的总RNA直接加工成cDNA。使用Power Syb-Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)通过qPCR扩增靶序列。将样品针对U6标准化。在请求后可获得引物序列。
传感器质粒：
通过PCR从基因组DNA(293T/17细胞)扩增含有预测的miRNA结合位点的E2F1、p21和Bim 3′UTR，然后通过利用紧在萤火虫萤光素酶的终止密码子下游的Xba-I位点将其插入pGL3对照载体(Promega)。按照制造商的方案，使用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)将miRNA种子区域互补位点中的前3个核苷酸的缺失插入突变型构建体。在请求后可获得引物序列。
其用途和定义的实例
除非另外指出，否则本发明的实施将使用在本领域技术人员的能力之内的药物学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见，例如，Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)。
因此，本文中提供了用于进一步解释的定义，所述定义不应解释为限定性的。
冠词“a”和“an”在本文中是指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“an element”是指一个元素或多于一个的元素。
“标志物”和“生物标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比，其在组织或细胞中改变的表达水平与病症和/或疾病状态相关的基因和/或蛋白质和/或其功能性变体。
标志物的“正常”的表达水平是标志物在未患病症和/或疾病状态的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于估量表达的测定的标准误，在某些实施方案中，至少2倍，在其他实施方案中，3、4、5或10倍于对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。
标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平比对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍，在某些实施方案中低3、4、5或10倍。
试剂盒是包含至少一种试剂，例如用于特异性检测标志物的表达的探针的任何产品(例如，包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。
“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段；变异标志物蛋白和它们的片段；包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽；以及包含标志物或变异标志物蛋白，或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。
本文中所述的组合物、试剂盒和方法特别地具有下列非限定性用途：
1)评估受试者是否患有病症和/或疾病状态；
2)评估受试者的病症和/或疾病状态的分期；
3)评估受试者的病症和/或疾病状态的分级；
4)评估受试者的病症和/或疾病状态的性质；
5)评估受试者发生病症和/或疾病状态的可能性；
6)评估与受试者的病症和/或疾病状态相关的细胞的组织学类型；
7)制备可用于治疗受试者的病症和/或疾病状态的抗体、抗体片段或抗体衍生物；
8)评估病症和/或疾病状态在受试者的细胞中的存在；
9)评估一种或多种测试化合物抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；1
10)评估疗法抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
11)监控受试者的病症和/或疾病状态的进展；
12)选择抑制受试者的病症和/或疾病状态的组合物或疗法；
13)治疗患有病症和/或疾病状态的受试者；
14)抑制受试者的病症和/或疾病状态；
15)评估测试化合物的有害潜能；和
16)预防处于发生病症和/或疾病状态的风险中的受试者的病症和/或疾病状态的发作。
筛选方法
可产生动物模型以使能够筛选可用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。因此，该方法可用于鉴定用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。该方法包括对由本文所述的方法产生的动物模型施用候选试剂，评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中的至少一种应答。如果至少一种应答在症状上减轻或在发作上延迟，则候选试剂是用于治疗或预防疾病的试剂。
候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologic agent)或可以是之前未知具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中，候选试剂是具有大于50且小于大约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例：生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要解卷积(deconvolution)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。
在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。
用于鉴定治疗受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound)/试剂。
候选试剂可以是上调或下调受试者中一个或多个病症和/或疾病状态应答途径的试剂。在某些实施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。
用于治疗病症和/或疾病状态的方法
本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转病症和/或疾病状态应答的方法。在本文所述的方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的受试者和已具有至少一种这样的应答的受试者。
在前一种情况下，这样的治疗用于预防此类应答的发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下，这样的治疗用于减轻此类应答发生的程度，阻止它们进一步发展或逆转所述应答。
在某些实施方案中，干扰应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。
生物标志物的表达
可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例：可对疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理疾病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对受试者提供如此鉴定的化合物以抑制受试者的疾病细胞。
任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，疾病细胞中该标志物的表达水平与正常结肠系统细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于评估标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至少大于评估方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍或更大的差异。
已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人受试者收集。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。
为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，评估蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。
应理解，含有此类细胞的受试者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中，标志物的表达水平可通过评估样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来评估。当然，可在评估样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
还应理解，可使标志物流出细胞进入例如呼吸系统、消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查痰、BAL、血清、血浆、尿、粪便等来检测流出的标志物。
组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体)，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。
标志物的表达可通过多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来评估。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。
在特定的实施方案中，标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来评估。
在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来评估：从受试者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参照多核苷酸或其片段杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA；优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以评估标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测受试者中标志物的存在。
在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时，期望在严格杂交条件下进行杂交。
在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(biomarker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗受试者的病症和/或疾病状态的试剂的方法可包括一个或多个下列步骤：
a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品；
b)从此类细胞制备提取物；
c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，
d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shift assay)。
在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中，SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的105至10-6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。
因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测，因此期望标志物的表达水平显著大于用于评估至少一种正常细胞和受结肠癌影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。
应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的受试者样品进行常规筛选，将了解某些标志物在不同类型的细胞，包括受试者的特定病症和/或疾病状态细胞中过表达。
此外，通过就标志物的表达评估更大数量的受试者样品，并且使从其获得样品的个体受试者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与受试者的病症和/或疾病状态强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。
当组合物、试剂盒和方法用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20％，在某些实施方案中，至少大约40％、60％或80％和基本上所有受试者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的病症和/或疾病状态)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10％的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80％的测定特异性)。
当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对各个标志物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中，将受试者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非病症和/或非疾病样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，样品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示受试者患有病症和/或疾病状态。当使用多个标志物时，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望使用更少的标志物。
为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于受试者样品中系统来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非系统组织中表达)的标志物。
应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生受试者的病症和/或疾病状态的风险的受试者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生病症和/或疾病的风险的受试者包括例如具有此类病症或疾病的家族史的受试者。
可以以多种方法评估正常人系统组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正常表达水平通过下述来评估：评估一部分表现正常的系统细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的系统细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正常表达的群体平均值。在其他实施方案中，标志物的″正常″表达水平可通过评估标志物在从未受影响的受试者获得的受试者样品、在怀疑病症和/或疾病状态在受试者中发作之前从受试者获得的受试者样品、编档保存的受试者样品等中的表达来进行测定。
本文中还提供了用于评估病症和/或疾病状态细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从受试者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了受试者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在用于评估样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。
试剂盒和试剂
试剂盒可用于评估疾病细胞的存在(例如在样品例如受试者样品中)。试剂盒包括多种试剂，其各自能够特异性结合标志物核酸或蛋白质。用于与标志物蛋白结合的合适的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于与标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记的或未标记的)、不与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常结肠系统细胞样品、结肠癌相关疾病细胞样品等。
产生抗体的方法
本文中还提供了制备产生用于评估受试者是否患有病症和/或疾病状态的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。
评估功效的方法
本文还提供了评估测试化合物抑制疾病细胞的功效的方法。如上所述，标志物的表达水平的差异与受试者的细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的变化可能由此类细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此，抑制受试者的病症和/或疾病状态的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常细胞中的表达水平)的水平。
因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二结肠细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下，标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制相关疾病。细胞样品可以例如是获自受试者的正常细胞的单个样品的等分、获自受试者的正常细胞的混合样品、正常细胞系的细胞、获自受试者的相关疾病细胞的单个样品的等分、获自受试者的相关疾病细胞的混合样品、相关疾病细胞系的细胞等。
在一个实施方案中，样品是获自受试者的癌症相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物，以鉴定可能最佳地抑制受试者的癌症相关疾病的化合物。
同样可将该方法用于评估疗法抑制受试者的相关疾病的有效性。在该方法中，评估一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法，另一个不经历疗法)中的表达水平。与评估测试化合物的有效性的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对于抑制癌症相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的受试者的样品用于本方法，那么可在体外评估备选疗法以选择对于抑制受试者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。
如本文中所描述的，人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的标志物的数目，或通过比较两者来评估。在下列部分更详细地描述了各个方面。
分离的蛋白质和抗体
一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以产生抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不合细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。
当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其也优选基本上不含培养基，即，培养基占据低于大约20％、10％或5％的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30％、20％、10％、5％(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。
标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40％，在某些实施方案中，50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。
预测医学
本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生特定病症和/或疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。
在另一个方面，方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。
另一方面涉及监控被施用以抑制病症和/或疾病或治疗或预防任何其他病症的试剂(例如，药物或其他化合物)在临床试验中对标志物的表达或活性的影响(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用)。
药物组合物
化合物可进行配制以用于在合适的药物载体中局部(topically)、局域(locally)或全身性施用。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，E.W.Martin(Mark Publishing Company，1975)，公开了常用载体和制备方法。化合物还可以封装在用于靶向细胞的合适的生物相容性微胶囊、微粒或微球体(由生物可降解或非生物可降解聚合物或蛋白质或脂质体形成)。此类系统对于本领域技术人员来说是熟知的并且可进行最优化以与合适的核酸一起使用。
在例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；和Ausubel等人，1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York中描述了用于核酸递送的各种方法。此类核酸递送系统包括期望的核酸，例如但不限于，其以“裸露的”形式作为“裸露的”核酸，或配制于适合于递送的媒介物中例如与阳离子分子或形成脂质体的脂质的复合物中，或作为载体的成分或药物组合物的成分。可将核酸递送系统直接(例如通过将其与细胞接触)或间接(例如通过任何生物过程的作用)提供给细胞。
用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。需要时可使用常规药物载体(水性的、粉状的或基于油的)或增稠剂。
适合用于胃肠外施用例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液、溶液或乳剂，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的制剂可以以单位剂型、与加入的防腐剂一起存在，例如存在于安瓿中或存在于多剂量容器中。本领域技术人员可容易地确定制备和配制组合物的各种参数而无需过度的实验。可单独地或与其他合适的成分组合来使用化合物。
一般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本领域内是熟知的。特别地，已用于核酸治疗剂的施用途径，和目前使用的制剂一起，为选择的核酸提供了优选的施用和配制途径，当然这将取决于因素例如特定的制剂、待治疗的受试者的状态的严重度和治疗功效所需的剂量。如本文中通常使用的，“有效量”是指在对其施用了制剂的受试者(与未接受所述化合物的匹配的受试者相比较)中能够治疗病症的一个或多个症状，逆转病症的一个或多个症状的进展，终止病症的一个或多个症状的进展或预防病症的一个或多个症状的发生的量。化合物的实际有效量可根据待使用的特定化合物或其组合、配制的特定组合物、施用模式，和个体的年龄、体重、状况，和待治疗的症状或病况的严重度而变化。
本领域技术人员已知的任何可接受的方法可用于给受试者施用制剂。取决于待治疗的病况，施用可以是局部的(即，至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。
药物基因组学
标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物”是其表达水平与受试者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的受试者应答和更特别地受试者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过评估受试者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可选择最适合于受试者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。
监控临床试验
监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受结肠癌相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的有效性。
在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，该方法包括步骤：
i)在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；
ii)检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平；
iii)从受试者获得一个或多个施用后的样品；
iv)检测标志物在施用后的样品中的表达水平；
v)将施用前的样品中标志物的表达水平与施用后的样品中标志物的表达水平相比较；和
vi)相应地改变试剂至受试者的施用。
例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗，从而不需要改变剂量。
电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。
如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。
许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。
因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性，和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况(pre-cancer-related disease condition)的特定治疗。
本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有特定病症和/或疾病或具有对此类病症和/或疾病的易感性，和/或推荐用于此类疾病或疾病和/或这样的癌症相关疾病前状况的特定治疗。该方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。
本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对与标志物相关的病症和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还包括推荐用于病症和/或疾病或对其的易感性的特定治疗的步骤。
本文中还提供了用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性的商业方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还可包括推荐用于其的特定治疗的步骤。
本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。
除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此，可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。
在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如病症和/或疾病的发生，其进展)和过程(例如与其相关的细胞转化)中。
阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。
阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。
替代标志物(Surrogate Marker)
标志物可用作一种或多种病症或疾病状态或导致其的状况的替代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或病症的不存在或存在，或与疾病或病症的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或病症中是否有效。当疾病状态或病症的存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病进展时，替代标志物是特别有用的。
标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或病症无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。
药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外，药效标志物的使用可提供由于药物治疗超出可直接观察的范围而产生的风险的基于机制的预测。
用于检测的方案
检测病症和/或疾病的方法可包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试者的生物学样品中的表达水平和将该水平与对照生物学样品中标志物基因的水平相比较。
当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有病症和/或疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时，受试者不可能患有所述病症和/或疾病。
可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施方案中，容许的范围基于标准值采用±2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者的生物学样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。
标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此，基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较，进行检测病症和/或疾病的一个方法。
可根据各种基因分析方法在病症和/或疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。
可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。
此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与结肠癌相关疾病相关的、具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。
同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。
含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40％，在某些情况下50％，在某些情况下60％，在某些情况下70％，至少80％、90％和95％或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至100bp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3′区域必须与标志物基因互补，而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。
“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。
在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测结肠癌相关疾病的方法。在下文中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如，Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。
用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检测标志物蛋白，可适当地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地，此类检测方法可包括ELISA法。
可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
此外，可通过将不仅生物学样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性用作指标来进行结肠癌相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物学活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。
即使在常规检测中受试者未被诊断为患有病症和/或疾病(尽管症状暗示此类疾病)，这样的受试者是否患有病症和/或疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。
更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至少暗示对病症和/或疾病的易感性的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由所述病症和/或疾病引起。
此外，检测可用于确定病症和/或疾病是否在受试者中得到改善。换句话说，本文中描述的方法可用于判断用于所述病症和/或疾病的治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基因之一时，已被诊断为患有所述病症和/或疾病的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。
还可基于表达水平的差异测定病症和/或疾病的严重度和/或对其的易感性。例如，当标志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与病症和/或疾病的存在和/或严重度相关。
动物模型
还可产生病症和/或疾病的动物模型，其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是编码具有与标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本身固有的。
动物模型可用于检测由于病症和/或疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。
动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生动物模型。在另一个实施方案中，方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生动物模型。还应理解，在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中，动物模型可通过导入选自此类基因的基因，或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。在另一个实施方案中，病症和/或疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。蛋白质的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。
动物模型可用于阐明病症和/或疾病背后的机制，还可用于检测通过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型产生特定病症和/或疾病的症状时，或当牵涉某种病症和/或疾病的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。
如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种：人工表达作为外源基因导入的标志物基因；受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强；或作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制。
如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的情况，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的情况。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常情况中的活性相比较来测定。
也在预期的范围内的是：动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而得到增强或抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。
表达的实例
此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到保持即可。
在另一个方面，本文中提供了治疗特定病症和/或疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得结肠癌相关疾病的治疗剂。
应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。
在特定的方面，可在体内或体外进行筛选用于病症和/或疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行：
1)对动物受试者施用候选化合物；
2)测量动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平；或
3)选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。
在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。
本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本发明可进行适当地改变以适合于实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。
某些核碱基(Nucleobase)序列
本文中描述的成熟miRNA和它们的相应的茎-环序列的核碱基序列是见于miRBase(见于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中的序列。miRBase序列数据库中的条目(entry)代表预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)和关于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。数据库中miRNA的茎-环序列严格说来不是前体miRNA(pre-miRNA)，并且在一些情况下可包括pre-miRNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。本文中描述的miRNA核碱基序列包括miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库的Release 10.0中描述的序列和miRBase序列数据库的任何更早的Release中描述的序列。序列数据库释放可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库释放可导致成熟miRNA序列的变化。可包括此类修饰的寡核苷酸的化合物可与本文中描述的miRNA的任何核碱基序列形式互补。
应理解，本文中所示的任何核碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。还应理解，包含U的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘U’的位点上‘U’被‘T’置换的相同核碱基序列。反过来，应理解，包含T的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘T’的位点上‘T’被‘U’置换的相同核碱基序列。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱基序列，这意味着修饰的寡核苷酸的核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域中与miRNA或其前体的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可具有一个或多个错配的碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列具有对miRNA的全长互补性。
miRNA(miR)疗法
在一些实施方案中，本发明提供了抑制受试者的一个或多个基因的表达的微RNA。微RNA表达特征谱可用作新型癌症生物标志物。
本文中包括使用一个或多个MiR抑制基因表达和/或活性的方法。在一些实施方案中，miR抑制蛋白质的表达。在其他实施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，细胞侵袭活性)。
可通过本领域技术人员熟知的许多种技术从细胞或组织分离，重组产生或体外合成miRNA。在一个实施方案中，从细胞或组织分离miRNA。用于从细胞或组织分离miRNA的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可使用来自Ambion，Inc.的mirVana miRNA分离试剂盒从总RNA分离miRNA。另一种技术利用flashIPAGETM Fractionator System(Ambion，Inc.)来进行小核酸的PAGE纯化。
关于miRNA治疗剂的使用，本领域技术人员理解，体内施用的核酸被吸收和分配至细胞和组织。
可以以合适的方式递送核酸，所述方式使得能够组织特异性地吸收试剂和/或核酸递送系统。本文中描述的试剂可通过任何已知的常规疗法来补充治疗状况，所述疗法包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂的施用。可一起或相继使用两个或多个组合的化合物。
本发明的某些实施方案提供了包含(a)一种或多种核酸或小分子化合物以及(b)一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。
另外的有用的定义
“受试者”是指经选择接受治疗或疗法的人或非人动物。“怀疑患有……的受试者”是指展示病症、疾病或病况的一个或多个临床指标的受试者。
“预防”或“防止”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展，持续一段时间，包括数周、数月或数年。“治疗”或“医治”是指一种或多种用于治愈或改善病症和/或疾病的特定方法的应用。在某些实施方案中，特定方法是一种或多种药剂的施用。
“改善”是指减轻病况或疾病的至少一个指标的严重度。在某些实施方案中，改善包括病况或疾病的一个或多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重度可通过对于本领域技术人员来说是已知的主观或客观量度来测定。
“有此需要的受试者”是指确定为需要治疗或疗法的受试者。
“施用”是指给受试者提供药剂或组合物，包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
“胃肠外施用”是指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用和颅内施用。“皮下施用”是指紧在皮肤下方施用。
“改善功能”是指使功能向正常参数改变。在某些实施方案中，通过测量在受试者的体液中发现的分子评估功能。“药物组合物”是指适合于给个体施用的物质的混合物，其包括药剂。例如，药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水性溶液。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。“靶向”是指与靶核酸杂交并且诱导期望的作用的核碱基序列的设计和选择的过程。“被靶向”是指具有核碱基序列，所述序列允许与靶核酸杂交以诱导期望的作用。在某些实施方案中，期望的作用是靶核酸的减少。
“调控”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中，调控是指基因表达的增加。在某些实施方案中，调控是指基因表达的减少。
“表达”是指藉以将基因的编码信息转变成存在于细胞中和在细胞中运转的结构的任何功能和步骤。
“区域”是指核酸内一部分连接的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的区域互补的核碱基序列。例如，在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA茎-环序列的区域互补。在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA序列的区域100％同一。
“区段”是指更小的区域或区域的亚部分。
“核碱基序列”是指以5′至3′方向，不依赖于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”是指核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键非共价配对的能力。“互补”是指第一核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域内与第二核碱基序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中，具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸可以在修饰的寡核苷酸的整个长度上不与miRNA或其前体100％互补。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸之间的核碱基配对能力。“全长互补性”是指第一核酸的各核碱基能够与第二核酸中相应的位点上的各核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中各核碱基与miRNA中的核碱基具有互补性的修饰的寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
“百分比互补性”是指核酸中互补核碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基数目。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基的数目。
“百分比结合的区域”是指与寡核苷酸区域互补的区域的百分比。通过将与寡核苷酸互补的靶区域的核碱基的数目除以靶区域的长度来计算百分比结合的区域。在某些实施方案中，百分比结合的区域是至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％。
“百分比同一性”是指第一核酸中与第二核酸相应的位点上的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。
本文中使用的“大体上同一的”可以指第一与第二核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一。
“杂交”是指通过核碱基的互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”是指不能够与第二核酸的相应的位点上的核碱基配对的第一核酸的核碱基。
“非互补核碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核碱基。
“同一的”是指具有相同核碱基序列。
“miRNA”或“miR”是指长度在18至25个核碱基之间的非编码RNA，其与编码RNA杂交并且调控编码RNA的表达。在某些实施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的产物。miRNA的实例见于称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“Pre-miRNA”或″pre-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，其包含miRNA。在某些实施方案中，pre-miRNA是称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri-miR的产物。
“茎-环序列”是指具有发夹结构并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎-环序列可重叠。茎-环序列的实例可见于称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“miRNA前体”是指源自基因组DNA并且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码性结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体是pri-miRNA。
“反义化合物”是指具有允许与靶核酸杂交的核碱基序列的化合物。在某些实施方案中，反义化合物是具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此独立地被修饰或不被修饰。“天然发生的核苷间连接”是指核苷之间的3′至5′磷酸二酯连接。“天然核碱基”是指相对于其天然发生的形式未被修饰的核碱基。“miR拮抗剂”是指经设计用于干扰或抑制miRNA的活性的试剂。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括干扰或抑制miRNA的活性的小分子等。
本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。
虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。
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