用于生产异戊二烯的组合物和方法.pdf

本发明描述了从培养的细胞生产异戊二烯的方法。本发明也提供了包含这些培养的细胞的组合物。

1.重组细菌或真菌细胞，其能够增加异戊二烯生产，所述细胞包含一种或多种核酸，所述核酸编码：(a)异戊二烯合酶多肽，其中该异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码，(b)异戊烯二磷酸δ异构酶(IDI)多肽，和(c)(i)1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽，和/或(ii)甲羟戊酸(MVA)途径多肽，所述甲羟戊酸途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽，其中所述细胞(d)产生大于400纳摩尔/g/hr的异戊二烯；(e)将细胞从细胞培养基中消耗的碳中大于0.002摩尔％的碳转化成异戊二烯；(f)具有大于0.1mg/L/hr的异戊二烯平均体积生产力；或(g)其中细胞产生至少0.0037克异戊二烯/克干细胞质量(g)。 2.权利要求1的细胞，其中所述细胞产生至少500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000或12,500纳摩尔/g/hr的异戊二烯。 3.权利要求1的细胞，其中所述细胞产生400纳摩尔/g/hr到2.0x10纳摩尔/g/hr的异戊二烯。 4.权利要求1的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。 5.权利要求4的细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是杨异戊二烯合酶多肽。 6.权利要求4的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是葛异戊二烯合酶多肽。 7.权利要求1的细胞，其中编码(b)的IDI多肽的核酸是编码IDI多肽的异源核酸。 8.权利要求7的细胞，其中所述IDI多肽是酵母IDI多肽。 9.权利要求1的细胞，其中编码(b)的IDI多肽的核酸是编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。 10.权利要求1的细胞，其中编码(c)的DXS多肽的核酸是编码DXS多肽的异源核酸。 11.权利要求1的细胞，其中编码(c)的DXS多肽的核酸是编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。 12.权利要求1的细胞，其包含编码MVA途径多肽的一种或多种异源核酸，所述MVA途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽。 13.权利要求1的细胞，其中编码(a)、(b)、或(c)任一种的多肽的一种或多种核酸的至少一种过表达。 14.权利要求13的细胞，其中所述过表达的核酸被克隆到多拷贝质粒中。 15.权利要求13的细胞，其中所述过表达的核酸被置于诱导型启动子或组成型启动子下。 16.权利要求1的细胞，其中所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。 17.权利要求1的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌和产碱假单胞菌细胞。 18.权利要求1的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。 19.权利要求18的细胞，其中所述真菌细胞是曲霉属、酵母、木霉属或耶氏酵母属细胞。 20.权利要求19的细胞，其中所述酵母细胞是酵母属、裂殖酵母(Schizosaccharomycessp.)、毕氏酵母(Pichiasp.)或假丝酵母(Candidasp.)细胞。 21.权利要求18的细胞，其中所述真菌细胞选自米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、里氏木霉、特异腐质霉、疏毛腐质霉、灰色腐质霉、C.iucknowense、酱油曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、粉红镰孢、赤禾镰孢、F.cerealis、尖镰孢、F.venenatum、粗糙脉胞菌、米黑毛霉、绿色木霉、尖镰孢和腐皮镰孢细胞。 22.权利要求1的细胞，其中所述编码(a)、(b)、或(c)的多肽的一种或多种核酸的至少一种在载体上。 23.权利要求1的细胞，其中所述编码(a)、(b)、或(c)的多肽的一种或多种核酸的至少一种整合到细胞的染色体中。 24.权利要求1的细胞，其中所述细胞包含一种或多种核酸，所述核酸编码：(c)(i)DXS多肽和(ii)MVA途径多肽，所述MVA途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽。

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年12月13日递交的美国临时专利申请号61/013,574 的优先权。该申请的内容在此通过整体引用作为参考。

发明领域

本发明大体涉及从培养细的胞生产异戊二烯的方法以及包括这些培 养细胞的组合物。

发明背景

异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多种合成聚合物，最典型为合成橡 胶的关键起始材料。异戊二烯是由多种微生物、植物、和动物种类所天然 生产的。特别地，已经鉴定出异戊二烯的两种生物合成途径：甲羟戊酸 (MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径(图19A和19B)。然而，来 自天然发生的生物的异戊二烯产量在商业上并不具吸引力。每年从异戊二 烯的聚合生产约800,000吨的顺式聚异戊二烯；该聚异戊二烯中大多数被 用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也被共聚合以在其他产品如鞋类、机械产 品、医药产品、运动商品和胶乳中用作合成高弹体。

目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自 橡胶树或在非洲雨林中发现的植物的乳汁。合成橡胶主要是基于丁二烯聚 合物。对于这些聚合物，丁二烯作为乙烯和丙烯生产的副产物而获得。

虽然异戊二烯可以通过石油分馏而获得，但是这一物质的纯化是昂贵 且耗时的。对C5烃类流的石油裂化只产生约15％的异戊二烯。因此，需 要生产异戊二烯的更加经济的方法。特别地，期望在速度、滴定度和纯度 方面有足以满足稳健的商业化工艺要求的生产异戊二烯的方法。也期望从 廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。

发明简要说明

一方面，本发明表征了生产异戊二烯的培养细胞。在一些实施方式中， 本发明提供培养细胞，该培养细胞产生基于异戊二烯的细胞湿重/小时(纳 摩尔/gwcm/hr)计，大于约400纳摩尔的异戊二烯/克细胞。在一些实施方 式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动 子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养， 该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三 醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、 磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解 的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来 自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。

在一些实施方式中，本发明提供具有异戊二烯的平均体积生产力大于 约0.1mg/L培养液/hr的培养细胞。在一些实施方式中，本发明提供具有异戊 二烯的峰值体积生产力大于约0.5mg/L培养液/hr的培养细胞。在一些实施方 式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动 子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养， 该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙 三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、 磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解 的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来 自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。

在一些实施方式中，本发明提供将细胞培养基中大于约0.002％的碳转 化成异戊二烯的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊 二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式 中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物 (例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、 油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油 二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微 生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种 或更多种的任一组合。

在一些实施方式中，本发明提供包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核 酸的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多 肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞 在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木 糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物 脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘 油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植 物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种 的任一组合。

在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的 任何细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生 产大于约400纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实 施方式中，该方法也包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式 中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方 法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二 烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中， 该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例 如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、 动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、 甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或 植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多 种的任一组合。

在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的 任何细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在使得异 戊二烯的平均体积生产力大于约0.1mg/L培养液/hr的条件下，培养细胞。在 一些实施方式中，该方法包括在使得异戊二烯的峰值体积生产力大于约0.5 mg/L培养液/hr的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回 收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细 胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在 一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地 连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养 基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)，乙酸 盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪 酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源 (例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母 提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。

在一些实施方式中，该方法包括在足以将细胞培养基中大于约0.002％ 的碳转化成异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也 包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化 由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚 合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii) 有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源 的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、 乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、 脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生 碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、 酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。

在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以大于或约400、500、 600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、 4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、 100,000、125,000、150,000、188,000，或更多纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯 来生产异戊二烯。在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积 生产力为大于或约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、 1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、 2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500，或更多 mg的异戊二烯/L培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细 胞培养基的体积)。在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体 积生产力高于或约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、 1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、 2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、 4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、 6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、 9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多mg的异戊 二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培 养基的体积)。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞将在细胞 培养基中以大于或约0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、 0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、 2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、 14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、 23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、 47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0摩尔％，或 更多的碳转化成异戊二烯。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细 胞以基于细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)计，大于或约1、10、25、50、100、150、 200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、 1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng 的异戊二烯/克细胞来生产异戊二烯。在本发明任何方面的一些实施方式 中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、 500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、 3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000，或更多mg的异戊二烯/L 培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)来生 产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在此公开了其他示例性的异戊二烯生 产速率和异戊二烯生产总量。

在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽的异 源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽 的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包 括编码DXS多肽的异源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞 还包括编码DXS多肽的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实 施方式中，细胞还包括编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在本 发明任何方面的一些实施方式中，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI 多肽和DXS多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，一种载体编码异 戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本发明一些实施方式中，载体 包括选择标记，如抗生素抗性核酸。

在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连 接T7启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的T7启动子。在本发明任何 方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Trc启动子，例 如在中或高拷贝质粒中含有的Trc启动子。在本发明任何方面的一些实施 方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Lac启动子，例如在低拷贝质粒 中含有的Lac启动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二 烯合酶核酸有效连接内源启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。 在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合到不带选择性标记的细胞 的染色体中。

在本发明任何方面的一些实施方式中，至少一部分细胞在连续培养 (如未稀释的连续培养)中维持异源异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、 20、40、50、60、65或更多的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施方 式中，包括异戊二烯合酶、IDI或DXS核酸的核酸也包括选择性标记，例 如抗生素抗性核酸。

在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码MVA途径多 肽(例如来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisi)、马氏甲烷八叠球菌 (Methanosarcinamazei)、或粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的MVA 途径多肽)的异源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包 括编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母、马氏甲烷八叠球菌、或粪肠 球菌的MVA途径多肽)的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一 些实施方式中，细胞包括异戊二烯合酶、DXS和MVA途径核酸。在本发 明任何方面的一些实施方式中，细胞包括异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、 IDI核酸和MVA途径核酸(除了IDI核酸以外)。

在本发明任何方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是天然发 生的多肽，其来自植物如葛属(Pueraria)(例如，葛麻姆(Pueraria montana))、或杨(Populus)(如Populustremuloides，银白杨(P.alba)， 黑杨(Populusnigra)，Populustrichocarpa，或银白杨欧洲山杨的杂交品 种)。

在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，如革兰氏 阳性细菌细胞(例如芽孢杆菌细胞如枯草杆菌(Bacillussubtilis)细胞或 链霉菌(Streptomyces)细胞如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、天 蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、白色链霉菌(Streptomycesalbus)、或灰色链霉菌 (Streptomycesgriseus)细胞)。在本发明任何方面的一些实施方式中， 细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如埃希氏菌(Escherichia)细胞如大肠杆 菌细胞或泛菌(Pantoea)细胞如柠檬泛菌(Pantoeacitrea)细胞)。在一 些实施方式中，大肠杆菌细胞是大肠杆菌FadRatoC突变细胞。在一些实 施方式中，大肠杆菌细胞表达(例如组成型表达)ybhE(也称作pgl)。 在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞如丝状真菌细胞 (例如木霉属(Trichoderma)细胞如里氏木霉(Trichodermareesei)细胞 或曲霉(Aspergillus)细胞如米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉 (Aspergillusniger)或酵母细胞(如耶氏酵母属(Yarrowia)细胞如解脂 耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞)。

在本发明任何方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母 或细菌的一或多种多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，植物多肽 碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、 芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一或多种 多肽。

在一方面，本发明提供包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中， 该聚异戊二烯是由(i)聚合来自在此所述的任一组合物或方法的异戊二烯 或(ii)聚合由在此所述的任一组合物或方法回收的异戊二烯所生产的。 在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1，4-聚异戊二烯。

在一方面，本发明表征了由任何的本发明组合物或方法所生产的产物 (例如轮胎)。

应理解的是，可组合在此所述的多种实施方式的一个、多个或全部特 性以形成本发明的其它实施方式。本发明的这些以及其他方面对于本领域 技术人员是显而易见的。

附图简要说明

图1是用于在大肠杆菌中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因 的核苷酸序列(SEQIDNO：1)。atg起始密码子为斜体，终止密码子为 粗体而添加的PstI位点有下划线。

图2是pTrcKudzu的图谱。

图3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：2)。RBS有下划线， 野葛异戊二烯合酶起始密码子为粗体大写字母而终止密码子为粗体、大 写、斜体字母。载体骨架是pTrcHis2B。

图4是pETNHisKudzu的图谱。

图5是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：5)。

图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。

图7是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：7)。

图8A是示出在没有载体的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。

图8B是示出在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二 烯生产的图。

图8C是示出在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生 产的图。

图8D是示出在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二 烯生产的图。

图9A是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发 酵进程的OD的图。

图9B是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发 酵进程的异戊二烯生产的图。

图10A是示出在柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。对照细胞没有重组 野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。

图10B是示出在表达pCL-lacKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产的 图。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。

图10C是示出在表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。 灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。

图11是示出在表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生产 的图。BG3594comK是没有质粒的枯草杆菌菌株(天然异戊二烯生产)。 CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草杆菌菌株(重组异戊二烯 生产)。y-轴上的IS表示异戊二烯。

图12是pBSKudzu#2的核苷酸序列(SEQIDNO：57)。

图13是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶的 核苷酸序列(SEQIDNO：8)。

图14是包含用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合 酶基因的pTrex3g图谱。

图15是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQIDNO：11)。

图16是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的合成的野葛(葛麻姆) 异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQIDNO：12)。

图17是合成的杂交杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因的核苷 酸序列(SEQIDNO：13)。ATG起始密码子为粗体而终止密码子有下划 线。

图18A示出描绘载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建的示意图。

图18B示出描绘载体pYLA(POP1)的构建的示意图。

图18C示出描绘载体pYLA(KZ1)的构建的示意图。

图18D示出描绘载体pYL1(KZ1)的构建的示意图。

图18E示出描绘载体pYLI(MAP29)的构建的示意图。

图18F示出描绘载体pYLA(MAP29)的构建的示意图。

图19A示出异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier等 人，ProgressinLipidRes.44：357-429，2005)。下面的描述包括对于途径 中每种多肽的替代名称以及公开有用于测量所示多肽活性的检测法的参 考(这些参考各在此通过整体引用作为参考，特别是对于在MVA和DXP 途径中的多肽的多肽活性检测法)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-CoA 乙酰基转移酶，MvaE，EC2.3.1.9.Assay：J.Bacteriol.，184：2116-2122， 2002；HMGS；羟甲基戊二酰基-CoA合成酶，MvaS，EC2.3.3.10.Assay： IBacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA 还原酶，MvaE，EC1.1.1.34.Assay：IBacteriol.，184：2116-2122，2002； MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36.Assay：CurrGenet19：9-14， 1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC2.7.4.2，Assay：MolCellBiol.， 11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，BC 4.1.1.33.Assay：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯二磷酸δ 异构酶，IDI1，EC5.3.3.2.Assay：IBiol.Chem.264：19169-19175，1989。 DXP途径：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，BC2.2.1.7.Assay： PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶， dxr，BC2.2.1.7.Assay：Eur.IBiochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二 磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇合酶，IspD，EC2.7.7.60.Assay：PNAS，97： 6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶，IspE， BC2.7.1.148.Assay：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓 糖醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，BC4.6.1.12.Assay：PNAS，96：11758-11763， 1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶，ispG，EC 1.17.4.3.Assay：IOrg.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基 -2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IspH，BC1.17.1.2.Assay：JACS， 126：12847-12855，2004。

图19B说明了经典的和改良的MVA途径。1，乙酰-CoA乙酰基转移 酶(AACT)；2，HMG-CoA合酶(HMGS)；3，HMG-CoA还原酶(HMGR)； 4，甲羟戊酸激酶(MVK)；5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6，二磷酸 甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7，异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)； 8，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9，异戊烯基磷酸激酶(IPK)。经 典MVA途径从反应1开始，通过反应5和6至反应7来进行，而改良 MVA途径经反应8和9至反应7。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷 酸。这一图取自Koga和Morii，MicrobiologyandMol.BiologyReviews， 71：97-120，2007，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于改良MVA 途径的核酸和多肽。改良MVA途径例如存在于诸如马氏甲烷八叠球菌的 一些古生物中。

图20示出表示由没有(左)或具有(右)野葛异戊二烯合酶基因的重 组解脂耶氏酵母菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析结果的图。箭头表示 真正的异戊二烯标准的洗脱时间。

图21是pTrcKudzuyIDIDXSKan的图谱。

图22是pTrcKudzuyIDIDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO：20)。

图23A是示出在BL21/pTrcKudzukan中从葡萄糖生产异戊二烯的 图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y 轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23B是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIkan中从葡萄糖生产的异戊二 烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间； y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23C是示出在BL21/pTrcKudzuDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二 烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间； y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23D是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIDXSkan中从葡萄糖生产的 异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后 的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生 产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L) 而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23E是示出在BL21/pCLPTrcKudzu中从葡萄糖生产异戊二烯的 图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y 轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23F是示出在BL21/pCLPTrcKudzuyIDI中从葡萄糖生产异戊二 烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间； y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23G是示出在BL21/pCLPTrcKudzuDXS中从葡萄糖生产异戊二 烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间； y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L 顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块 表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图23H是示出在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中从葡萄糖生产的异戊 二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时 间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力 (μg/L顶空/OD)。黑色菱形表示OD600，黑色三角表示总异戊二烯生产 力(μg/L)而白色方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。

图24是pTrcKKDyIkISkan的图谱。

图25是pTrcKKDyIkISkan的核苷酸序列(SEQIDNO：33)。

图26是pCLPtrcUpperPathway的图谱。

图27是pCLPtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQIDNO：46)。

图28示出含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座 位的酵母idi的表达盒的图谱。nprE上游/下游表示来自nprE位点用于整 合的各1kb序列。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基 因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟 戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位点的芽孢杆菌RBS上游的酵母 磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示具有起始位点上游的芽孢杆菌 PBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位点上游 的芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B. amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮 观霉素抗性标记。“用于扩增的nprE上游重复”表示用于扩增的上游区域 的直接重复。

图29是含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座位 的酵母idi的表达盒的核苷酸序列(SEQIDNO：47)。

图30是p9796-poplar的图谱。

图31是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQIDNO：48)。

图32是pTrcPoplar的图谱。

图33是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQIDNO：49)。

图34是pTrcKudzuyIDIKan的图谱。

图35是pTrcKudzuyIDIKan的核苷酸序列(SEQIDNO：50)。

图36是pTrcKudzuDXSKan的图谱。

图37是pTrcKudzuDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO：51)。

图38是pCLPTrcKudzu的图谱。

图39是pCLPTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：52)。

图40是pCLPTrcKudzuA3的图谱。

图41是pCLPTrcKudzuA3的核苷酸序列(SEQIDNO：53)。

图42是pCLPTrcKudzuyIDI的图谱。

图43是pCLPTrcKudzuyIDI的核苷酸序列(SEQIDNO：54)。

图44是pCLPTrcKudzuDXS的图谱。

图45是pCLPTrcKudzuDXS的核苷酸序列(SEQIDNO：55)。

图46示出表示从生物质原料生产异戊二烯的图。小图A示出来自玉 米秸秆的异戊二烯生产，小图B示出来自甘蔗渣的异戊二烯生产，小图C 示出来自软木材木浆的异戊二烯生产，小图D示出来自葡萄糖的异戊二烯 生产，和小图E示出来自没有添加原料的细胞的异戊二烯生产。灰色方块 表示在接种后的指定时间处，对培养物的OD600测量而黑色三角表示在接 种后的指定时间的异戊二烯生产。

图47示出表示在没有添加葡萄糖的培养物中由BL21(λDE3) pTrcKudzuyIDIDXS(kan)生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而 三角表示所生产的异戊二烯(μg/ml)。

图47B示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％ 葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所 生产的异戊二烯(μg/ml)。

图47C示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％ 转化糖原料生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所生产的 异戊二烯(μg/ml)。

图47D示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％ AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示 所生产的异戊二烯(μg/ml)。

图48示出表明酵母提取物对异戊二烯生产的影响的图。小图A示出 在供给不同量的酵母提取物的发酵罐中光密度的时间进程。小图B示出在 供给不同量的酵母提取物的发酵罐中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度 定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C示出酵母提取物对在 生长于补料分批培养物中的大肠杆菌中异戊二烯生产的影响。

图49示出表明在500L生物反应器中含有pTrcKudzu和yIDI和DXS 质粒的大肠杆菌细胞生产异戊二烯的图。小图A示出在供应葡萄糖和酵母 提取物的500-L生物反应器中的光密度的时间进程。小图B示出在小图葡 萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴 定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C示出从供应葡萄 糖和酵母提取物的500-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。

图50是pJMupperpathway2的图谱。

图51是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQIDNO：56)。

图52是pBSKudzu#2的图谱。

图53A是示出在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的 芽孢杆菌发酵时间期间的生长。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天 然异戊二烯生产)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有 pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢杆菌。

图53B是示出在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的 芽孢杆菌发酵时间期间的异戊二烯生产。黑色菱形表示没有重组异戊二烯 合酶(天然异戊二烯生产)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示 具有pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢杆菌。

图54是质粒pET24P.albaHGS的图谱。

图55A和55B是质粒pET24P.albaHGS的核苷酸序列(SEQID NO：87)。

图56是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点 以及在BspHI和NcoI位点之间的相容性粘性末端的示意图。

图57是质粒EWL230的图谱。

图58A和58B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQIDNO：88)。

图59是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点 以及在NsiI和PstI位点之间的相容性粘性末端的示意图。

图60是EWL244的图谱。

图61A和61B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQIDNO：89)。

图62是质粒MCM484-487的图谱。

图63A-63C是质粒MCM484的核苷酸序列(SEQIDNO：90)。

图64A-64C是质粒MCM485的核苷酸序列(SEQIDNO：91)。

图65A-65C是质粒MCM486的核苷酸序列(SEQIDNO：92)。

图66A-66C是质粒MCM487的核苷酸序列(SEQIDNO：93)。

图67A-67D是表达MVA途径的基因并且在以15-L规模的没有酵母 提取物供料的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二 烯生产图。图67A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间 进程。图67B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的 时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图67C示 出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图67D 示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的总二氧化碳进化率(TCER)、 或代谢活性谱。

图68A-68E是表达MVA途径的基因并且在以15-L规模的具有酵母 提取物供料的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二 烯生产图。图68A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间 进程。图68B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的 时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图68C示 出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图68D 示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的体积生产力。在40小时期间 (23-63小时)维持平均值为1.1g/L/hr的酵母提取物加料。图68E示出在 供料葡萄糖的15-L生物反应器中的二氧化碳进化率(TCER)、或代谢活 性谱。

图69A-69D示出从不同碳源通过MVA(途径)的异戊二烯生产。图 69A示出含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256在葡萄糖、 生物量水解物、丙三醇或乙酸盐/酯作为唯一碳源上的生长。在培养基中添 加不同碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。以600nM处的 光密度测量生长。图69B示出含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌 EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或乙酸盐/酯作为唯一碳源上生 长时的异戊二烯比生产力。在培养基中添加不同碳源至浓度为1％。包括 没有添加碳源的阴性对照。接种后190分钟、255分钟和317分钟取样并 使用GC-MS测量细菌生产的异戊二烯。图69C示出大肠杆菌EWL256在 葡萄糖或木糖作为唯一碳源上的生长。在培养基中添加不同碳源至浓度为 1％。包括没有添加碳源的阴性对照。生长测量为600nM下的光密度。图 69D示出大肠杆菌EWL256在葡萄糖或木糖作为唯一碳源上生长的比生产 力。在培养基中添加碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。 接种后260分钟、322分钟和383分钟取样并使用GC-MS测量细菌生产 的异戊二烯。

图70A和70B示出由大肠杆菌菌株分别从葡萄糖和脂肪酸的异戊二烯 生产。对于图70A，挑取11个来自用具有下游甲羟戊酸途径的质粒 pMCM118转化WW4的菌落来验证下游途径的存在。在含有0.1％酵母提 取物和2％葡萄糖的TM3培养基中培养来自这些菌落的细胞。在诱导4小 时后检测等份诱导培养物的异戊二烯生产。所有菌落都示出了异戊二烯生 产。诱导物IPTG具有强的生长抑制作用，这可见于由50至900uM浓度 的诱导物得到3至4.6倍降低的细胞密度(数据未示出)。该图示出较高 诱导，导致较高的异戊二烯比滴定度。对于图70B，生产培养物是由以1 至10倍稀释的冲洗后的过夜培养物接种。培养物生长若干小时并用50uM IPTG诱导。左栏示出诱导4小时后紧接着1小时异戊二烯累积检测的异 戊二烯检测结果。中栏示出对于相同培养物用相同诱导时间，但分析12 小时异戊二烯积累检测的1小时归一化数值。右栏示出诱导1小时的培养 物的1小时异戊二烯累积检测的数值。

图71是用于从野葛克隆异戊二烯合酶的大肠杆菌-链霉菌 (Streptomyces)穿梭载体pUWL201PW(6400bp)的图谱。Tsr，硫链 丝菌肽抗性基因。图片取自Doumith等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485， 2000。

图72示出由白色链霉菌(Streptomycesalbus)野生型菌株(“wt”)和 带有质粒pUWL201PW(阴性对照)或pUWL201_iso(编码来自野葛的 异戊二烯合酶)的菌株的异戊二烯形成。

图73A是马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerPathway操纵子的图谱。

图73B和73C是马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerPathway操纵子 的核苷酸序列(SEQIDNO：113)。

图74A是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerinpET200D的 MCM376-MVK图谱。

图74B和74C是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerinpET200D 的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQIDNO：114)。

图75A-75D示出相比于RM11608-2，EWL256的异戊二烯生产的生 长和比生产力。白色菱形表示生长(OD550)；实心条表示异戊二烯的比 生产力。x-轴是以200(图75A和75B)或400(图75C和75D)uMIPTG 诱导后的时间(小时)。Y-1轴是异戊二烯的生产力(ug/L/OD/hr)而Y-2 是波长为550处的光密度的任意单位。对于OD550的这些数值必须乘以6.66 以获得培养物的实际OD。

图76是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。

图77A和77B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(SEQID NO：122)。

图78A-78F是由表达甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合 酶和pgl(RHM111608-2)并且在15L规模的补料分批培养中生长的大肠 杆菌菌株的异戊二烯生产的图。图78A示出在供料葡萄糖的15-L生物反 应器中光密度的时间进程。图78B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器 中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液生产的异戊 二烯的量。计算异戊二烯的方法：59hr中的累积异戊二烯生产，在59hr 时的g/发酵罐体积，L[＝]g/L培养液。图78C也示出在供料葡萄糖的15-L 生物反应器中的异戊二烯滴定度的时间进程。计算异戊二烯的方法：∫(瞬 时异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt，t＝0至59小时[＝]g/L培养液。图78D 示出由供料葡萄糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。图 78E示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器内的体积生产力。图78F示出 在供料葡萄糖的15-L生物反应器内的二氧化碳进化率(CER)，或代谢 活性谱。

图79A是质粒pJ201：19813的图谱。

图79B和79C是pJ201：19813的核苷酸序列(SEQIDNO：123)。

发明详细说明

本发明表征了生产增加量的异戊二烯的组合物和方法。特别地，这些 组合物和方法增加异戊二烯生产力并且增加生产的异戊二烯的总量。例 如，制造了产生4.8x104纳摩尔/gwem/hr的异戊二烯的细胞培养体系(表1)。 这些体系的效率被细胞从细胞培养基所消耗的～23.6摩尔％产率(10.7重 量％产率)的碳转化成异戊二烯(％碳产率)所阐明。如实施例和表2所 示，产生了每升培养液约60.5g异戊二烯。以1.88x105nmol/OD/hr(1.88 x105纳摩尔/gwcm/hr)的峰值比速率生产异戊二烯。如果需要，可以使用 其他条件，如在此所述的那些，获得更大量的异戊二烯。在一些实施方式 中，将可再生的碳源用于异戊二烯的生产。本发明的组合物和方法是想要 的，因为它们允许每细胞的高异戊二烯产率，允许高碳产率、高异戊二烯 纯度、高生产力、低能量利用、低生产成本和投资、以及最小的副反应。 这一用于异戊二烯生产的有效、大规模、生物合成工艺为合成异戊二烯类 橡胶提供了异戊二烯来源，并且为使用天然橡胶提供了期望的低成本替 代。

如下面进一步讨论，可以通过向细胞导入编码异戊二烯合酶多肽(例 如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸来显著增加由该细胞生产的异戊二 烯量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊 二烯。如在实施例中所示，在诸如大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、解脂 耶氏酵母菌和里氏木霉的多种宿主细胞中表达异源葛麻姆(Pueraria Montana)(野葛)或银白杨(杨)异戊二烯合酶多肽。如也在实施例中 所示，在诸如大肠杆菌的宿主细胞中表达异源马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸 激酶(MVK)来增加异戊二烯生产。所有这些细胞比没有异源异戊二烯合 酶多肽的相应细胞生产出更多的异戊二烯。如表1和2所示，使用在此所 述的方法生产了大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯 草杆菌细胞在14升发酵罐中比没有异源核酸的相应对照枯草杆菌细胞生 产出高约10倍的异戊二烯(表2)。在发酵罐中由大肠杆菌生产出每升培 养液(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积) 60.5g异戊二烯而由枯草杆菌生产的是30mg/L，这表明可以产生相当量的 异戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大规模生产异戊二烯或者可以使 用在此所述的其他条件来进一步增加异戊二烯的量。在下面以及在实施例 部分中进一步详述表1和2所列出的载体以及实验条件。

表1：使用本发明的细胞培养物和方法，从摇瓶生产异戊二烯的示例 性产率。用于测量异戊二烯生产的检测法描述于实施例I，第II部分。对 于这一检测法，在一或多个时间点从摇瓶取出样品并培养30分钟。然后测 量这一样品中生产的异戊二烯量。表1中列出了异戊二烯生产的顶空浓度 和比速率，并且在此进一步描述。

＊标准化为1OD600的1mL，在密封顶空瓶中培养1小时，其中液体 与顶空体积比为1∶19。

表2：使用本发明的细胞培养物和方法，在发酵罐中的示例性异戊二 烯产率。用于测量异戊二烯生产的检测法描述于实施例I，第II部分。对 于这一检测法，取发酵罐的废气样品，并分析异戊二烯的量。表2中列出 了峰值顶空浓度(它是发酵期间的最高顶空浓度)、滴定度(它是每升培 养液所生产的异戊二烯的累积总量)以及异戊二烯生产的峰值比速率(它 是发酵期间的最高比速率)，并且在此进一步描述。

＊＊标准化为1vvm的废气流速(每1L培养液每分钟1体积废气)。

此外，通过含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产可以经 增加由该细胞所表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)多肽和/或 异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)多肽的量所增强。例如，可以将DXS核酸 和/或IDI核酸导入细胞中。DXS核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。 类似地，IDI核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。在一些实施方式中， 通过用产生DXS和/或IDI核酸更大转录的其他启动子和/或调控区代替内 源DXS和/或IDI启动子和/或调控区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在 一些实施方式中，细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合 酶核酸)的异源核酸以及编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。

编码的DXS和IDI多肽是用于生物合成异戊二烯的DXP途径的一部 分(图19A)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸转变成1-脱氧-D-木 酮糖-5-磷酸。虽然不想受任何特定理论所限，但相信增加DXS多肽量会 增加通过DXP途径的碳流动，导致更大的异戊二烯生产。IDI多肽催化异 戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化。虽然 不想受任何特定理论所限，但相信增加细胞中的IDI多肽量会增加IPP的 量，IPP被转化成DMAPP，其又被转化成异戊二烯。

例如，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS 的大肠杆菌细胞发酵生产异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从 50至300μg/L变化(实施例7，第VII部分)。作为另一实例，使用具有 马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、上游 MVA途径和整合的下游MVA途径的大肠杆菌发酵生产异戊二烯。异戊 二烯的水平在67小时的时间段从32至36.5g/L变化(实施例10，第III 部分)。

在又一实施例中，使用具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、 银白杨异戊二烯合酶、pgl过表达(RHM111608-2)、上游MVA途径和 整合下游MVA途径的大肠杆菌细胞发酵生产异戊二烯。异戊二烯的水平 在40小时的时间段从33.2g/L至40.0g/L变化或在59小时的时间段从48.6 g/L至60.5g/L变化(实施例13，第(ii)部分)。

在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、IDI和DXS核 酸的存在使得细胞相比于只具有这些异源或额外的内源核酸中一种或两 种的相应细胞更加可繁殖地生长或者存活更长。例如，含有异源异戊二烯 合酶、IDI和DXS核酸的细胞比只有异源异戊二烯合酶和DXS核酸或者 只有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。而且，已将异源异戊二烯 合酶、IDI和DXS核酸成功地有效连接至在大肠杆菌细胞中维持的高拷贝 质粒上的强启动子，这表明大量的这些多肽可以在细胞中表达而不会对细 胞造成过量的毒性。虽然不想受特定理论所限，但是相信异源或额外的内 源异戊二烯合酶和IDI核酸的存在可降低一种或多种潜在的毒性中间产物 的量，该中间产物本来是在细胞中存在仅仅一种异源或额外的内源DXS 核酸时积累的。

在一些实施方式中，通过增加细胞表达的MVA多肽的量，由含有异 源异戊二烯合酶核酸的细胞生产的异戊二烯增加(图19A和19B)。示例 性MVA途径多肽包括任何下述多肽：乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫 解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、 3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊 酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊 酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷 酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的 多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一或多个MVA途径核酸导入细胞 中。在一些实施方式中，细胞含有上游MVA途径，其该上游MVA途径 包括AACoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶核酸。在一些 实施方式中，细胞含有下游MVA途径，该下游MVA途径包括MVK、 PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞含有整个MVA途径， 该整个MVA途径包括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还 原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞含有包 括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMDC、 IPK和IDI核酸的整个MVA途径。MVA途径核酸可为异源核酸或者内 源核酸的拷贝。在一些实施方式中，通过用导致MVA途径核酸更大转录 的其他启动子和/或调控区来替代MVA途径核酸的内源启动子和/或调控 区而增加该一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，细胞含 有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(例如植物异戊二烯合酶核酸)和编 码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。

例如，含有编码野葛异戊二烯合酶多肽的核酸以及编码酿酒酵母 MVK、PMK、MVD和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67x104nmol/L 培养液/OD600/hr的比率产生异戊二烯(参见实施例8)。此外，14升具有编 码粪肠球菌(Enterococcusfaecaiis)AA-Co硫解酶、HMG-CoA合酶和 HMG-CoA还原酶的核酸的大肠杆菌发酵物产生22克甲羟戊酸(MVA途 径的中间产物)。这些细胞的摇瓶产生每升2-4克的甲羟戊酸。这些结果 表明异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。含有上游MVA途径 和下游MVA途径以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株 MCM127)相比于具有只用于下游MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸 的大肠杆菌细胞(菌株MCM131)产生显著更多的异戊二烯(874μg/L培养液/hr/OD)(参见表3和实施例8，第VIII部分)。

作为另一实例，含有编码银白杨异戊二烯合酶多肽的核酸以及编码马 氏甲烷八叠球菌MVK多肽的核酸的大肠杆菌细胞，在没有酵母提取物加 料下，在67小时发酵期间产生320.6g(峰值比速率为9.54x104nmol/L培养液/OD600/hr(即9.5x104nmol/L培养液/OD600/hr))的异戊二烯，或在存在 酵母提取物加料下，在68小时发酵期间产生395.5g(峰值比速率为8.66x 104nmol/L培养液/OD600/hr)的异戊二烯(参见实施例10)。

在一些实施方式中，在连续培养物(例如没有稀释的连续培养物)中， 至少一部分的细胞维持异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径 核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300或更多的细胞分裂。在本 发明任何方面的一些实施方式中，包含异源或内源异戊二烯合酶拷贝、 DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的核酸也包含选择标记，如卡那霉素、 氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新 霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。

如实施例7，第VI部分所示，可以通过将酵母提取物加入细胞培养基 中，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大 肠杆菌细胞来生产异戊二烯而进一步增加所生产的异戊二烯的量。特别 地，所生产的异戊二烯的量与用于浓度检测的细胞培养基中的酵母提取物 的量为线性比例的(图48C)。此外，从具有酵母提取物和葡萄糖的细胞 培养基生产了约每升培养液0.11克异戊二烯(实施例7，第VIII部分)。 相比于在酵母提取物存在下增加葡萄糖的量，在葡萄糖存在下增加酵母提 取物的量导致生产更多的异戊二烯。而且，增加酵母提取物的量允许细胞 在更长的时间里生产高水平的异戊二烯并且提高细胞的健康水平。

也使用三种类型的水解生物量(甘蔗渣，玉米秸秆和软木材木浆)作 为碳源来阐述了异戊二烯的生产(图46A-C和图69A和69B)。具有野葛 异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些 水解的生物量碳源比从等量葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)生产出更多 的异戊二烯。表达银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞从氨 纤维膨胀(AFEX)预处理的玉米秸秆比从等量葡萄糖以更高的初始生长 率生产异戊二烯(图69A和69B)。如果需要，本发明的组合物和方法中 可以使用任何其他生物量碳源。生物量碳源是想要的，因为它们比许多常 规细胞培养基更便宜，从而促进经济地生产异戊二烯。

此外，转化糖显示出起用于生产异戊二烯的碳源的作用(图47D)。

此外，木糖、乙酸盐/酯、以及丙三醇也显示出起生产异戊二烯的碳源 的作用(图69A-69D)。例如，在乙酸盐/酯作为唯一碳源上生长的具有银 白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞的异戊二烯的比生产力是 在葡糖糖上生长期间约两倍高(实施例10，第IV部分；图69A和69B)。

在一些实施方式中，细胞培养基中包括油。例如，含有野葛异戊二烯 合酶核酸的枯草杆菌细胞在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，产 生异戊二烯(实施例4，第III部分)。作为另一实例，含有上游和下游 MVA途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadRatoC突变细胞在含有棕 榈油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，产生异戊二烯(实施例12，第II 部分)。在一些实施方式中，细胞培养基中包括一种以上的油(例如2、3、 4、5或更多种油)。虽然不想受任何特定理论所限，但相信(i)油可增 加在细胞中可用于向异戊二烯转变的碳量，(ii)油可增加在细胞中的乙 酰-CoA的量，从而增加通过MVA途径的碳流动，和/或(ii)油可向细胞 提供额外的营养，这是想要的，因为细胞中的许多碳转变成异戊二烯而不 是其他产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天 然使用MVA途径来生产异戊二烯或者通常被修饰以含有用于整个MVA 途径的核酸。在一些实施方式中，油在加入细胞培养基中之前部分或全部 水解以促进宿主细胞对油的使用。

示例性多肽和核酸

多种异戊二烯合酶，DXS，IDI，和/或MVA途径多肽和核酸可以用 于本发明的组合物和方法。

如在此使用，“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽， 该融合多肽包括第一多肽(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径 多肽)的部分或全部以及第二多肽(例如方便融合多肽纯化及检测的肽， 如His-标签)的部分或全部。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更 多种MVA途径多肽(例如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶多肽)的 活性。在一些实施方式中，多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽活性 的天然发生的多肽(例如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。

在多种实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、 300、350、400或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段含有来自 全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300或更多个连续氨基 酸并且它具有相应全长多肽活性的至少或约5％、10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在具体实施方式中，多 肽包括任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的整 个氨基酸序列或序列区段。在一些实施方式中，多肽相比于野生型(即天 然发生的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽序列具有一 或多个突变。

在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。如在此所用，“分离的多肽” 不是多肽文库，例如2、5、10、20、50或更多种不同多肽的文库的一部分， 并且与至少一种与其一起天然发生的组分分离。分离的多肽可以例如通过 表达编码该多肽的重组核酸而获得。

在一些实施方式中，多肽是异源多肽。对于“异源多肽”，指氨基酸序 列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。

如在此使用，“核酸”指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核酸 和/或核糖核酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”，指 不含一种或多种核酸(例如基因)的目的核酸，该一种或多种核酸在该目 的核酸所源自的生物的天然发生的基因组中，以该目的核酸为侧翼。该术 语因此包括，例如整合到载体、整合到自主复制的质粒或病毒，或整合到 原核或真核生物的基因组DNA，或者以独立于其他序列而作为分离分子 (如cDNA、基因组DNA片段、或由PCR或限制性内切酶酶切所产生的 cDNA片段)存在的重组DNA。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、 IDI或MVA途径核酸有效连接到编码全部或部分的另一多肽的另一核酸 以便该重组核酸编码包括异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽以 及全部或部分另一多肽(例如，促进融合多肽纯化或检测的肽，例如His- 标签)的融合多肽。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合 成的。

在一些实施方式中，核酸是异源核酸。对于“异源核酸”，指核酸序列 与在相同宿主细胞中天然发现的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。

在具体实施方式中，核酸包括任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、 IDI或MVA途径核酸的整个核酸序列或其区段。在一些实施方式中，核 酸包括来自天然发生的异戊二烯合酶核酸、DXS、IDI或MVA途径核酸 的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多 连续核苷酸。在一些实施方式中，核酸相比于野生型(即天然发生的序列) 异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的序列具有一个或多个突变。 在一些实施方式中，核酸具有增加异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途 径核酸转录或翻译的一或多个突变(例如，沉默突变)。在一些实施方式 中，核酸是任何编码异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的核酸 的简并变体。

“密码子简并性”指遗传密码的发散，这允许核苷酸序列的变化而不会 影响编码多肽的氨基酸序列。熟练技术人员会充分意识到在使用核苷酸密 码子来说明给定氨基酸时，由特定宿主细胞所展现的“密码子偏好”。因此， 当合成核酸以改善在宿主细胞中的表达时，想要在一些实施方式中设计核 酸，使得其密码子使用频率接近宿主细胞的偏好密码子使用频率。

示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的登录号 列于附录1(附录1的登录号和它们相应的序列在此通过整体引用作为参 考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨 基酸和核酸序列)。Kegg数据库也含有许多示例性异戊二烯合酶、DXS、 IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，网址为 “genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”的互联网和其中的序列， 其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或 MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，一种 或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和/或核酸具有与2007 年12月12日或2008年12月11日公开可获得的序列(例如对应于附录1 中任何登录号的任何序列或者Kegg数据库中存在的任何序列)相同的序 列。进一步在下面描述其他的示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA 途径多肽和核酸。

示例性异戊二烯合酶多肽和核酸

如上面所指出，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP) 转变成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括多肽、多肽片段、肽和 具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法可以通过测 量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转变成异戊二烯的能 力而用来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的检测法 中，通过按实施例1所述以摇瓶法生长菌株(例如在此所述的E. coli/pTrcKudzu菌株)来制备细胞提取物。在完成诱导后，将约10mL的 细胞在7000xg离心10分钟沉淀并在5ml没有甘油的PEB中重悬浮。 使用标准方法，用弗氏压碎器裂解细胞。或者，在-80℃冻融后，用溶菌酶 (Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。

例如，可以按照Silver等人，JBiol.Chem.270：13010-13016，1995以 及其中参考文献所述来测量细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性，它们 在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶多肽活性的检测 法。在氮蒸汽下蒸发DMAPP(Sigma)至干燥并且在pH8.2的100mM 磷酸钾缓冲液中再水化至100mM浓度并储存于-20℃。为了进行检测法， 在具有金属螺帽和涂覆特氟龙的硅隔板(AgilentTechnologies)的20ml顶 空样品瓶(AgilentTechnologies)中，将5μl的1MMgCl2、1mM(250μg/ml) DMAPP、65μl的PlantExtractBuffer(PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0， 20mMMgCl2，5％丙三醇，和2mMDTT)加入25μl的细胞提取物中并 在37℃振荡培养15分钟。通过加入200μl的250mMEDTA淬灭反应并 通过GC/MS来量化，如在实施例1，第II部分所述。

示例性异戊二烯合酶核酸包括编码多肽、多肽片段、肽或具有异戊二 烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多 肽和核酸包括来自任何在此所述的来源生物的天然发生的多肽和核酸以 及源自在此所述任何来源生物的突变多肽和核酸。

在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自豆科(Fabaceae)， 例如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或 核酸是来自葛麻姆(Puerariamontana)(野葛)(Sharkey等人，Plant Physiology137：700-712，2005)，野葛(Puerarialobata)，杨(如银白杨、 黑杨、Populustrichocarpa、银白杨xtremula(CAC35696)或银白杨) (Sasaki等人，FEBSLetters579(11)：2514-2518，2005；Miller等人， Planta213：483-487，2001)、白杨(如Populustremuloides)(Silver等人， JBC270(22)：13010-1316，1995)或英国栎(夏栎(Quercusrobur)) (Zimmer等人，WO98/02550)的多肽或核酸，其各在此通过整体引用 作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达。适 合的异戊二烯合酶包括但不限于，Genbank登录号AY341431、AY3 16691、AY279379、AJ457070和AY182241所鉴定的那些，其各在此通 过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列。在一 些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自夏栎的天然发生的多肽 或者核酸(即异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然发生的多肽 或者核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二 烯合酶核酸或多肽是来自杨的天然发生的多肽或核酸。在一些实施方式 中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨的天然发生的多肽或核酸。

示例性DXS多肽和核酸

如上所指出，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和 D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包括多 肽、多肽片段、肽和具有DXS多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法 (如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体 内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力而用 来测定该多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS核酸包括编码具有 DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例 性DXS多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和 核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。

示例性IDI多肽和核酸

异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯二磷酸δ异构酶或IDI)催化异戊 烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转变(例如将 IPP转变成DMAPP和/或将DMAPP转变成IPP)。示例性IDI多肽包括 具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方 法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在 体内对IPP和DMAPP相互转变的能力而用来测定该多肽是否具有IDI多 肽活性。示例性IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、 多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括来自在此所 述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生 物的突变多肽和核酸。

示例性MVA途径多肽和核酸

示例性MVA途径多肽包括乙酰基-CoA乙酰转移酶(AACoA硫解酶) 多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基 -3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶 (MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧 酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶 (IPK)多肽、IDI多肽、和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽 (例如融合多肽)。特别地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的 至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸 包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融 合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自在此所述的任何源 生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多 肽和核酸。

特别地，乙酰基-CoA乙酰转移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT) 将两分子的乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA。标准方法(如在此所述 的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将两分子乙 酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有 AA-CoA硫解酶多肽活性。

3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽 将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA。标准方法(如在 此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将乙 酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的能力而用来测定该多 肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性。

3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR) 多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸。标准方法(如在此 所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将3-羟 基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸的能力而用来测定该多肽是否具 有HMG-CoA还原酶多肽活性。

甲羟戊酸激酶(MVK)多肽使甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷 酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提 取物中或在体内将甲羟戊酸转变成甲羟戊酸-5-磷酸的能力而用来测定该 多肽是否具有MVK多肽活性。

磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽使甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟 戊酸-5-二磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、 在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成甲羟戊酸-5-二磷酸的 能力而用来测定该多肽是否具有PMK多肽活性。

二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷 酸转变成异戊烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通 过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成 IPP的能力而用来测定该多肽是否具有MVD多肽活性。

磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转变成异戊烯 磷酸(IP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、 在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成IP的能力而用来测定 该多肽是否具有PMDC多肽活性。

异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽使异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊 烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在 体外、在细胞提取物中或在体内将IP转变成IPP的能力而用来测定该多 肽是否具有IPK多肽活性。

示例性IDI多肽和核酸如上所述。

分离核酸的示例性方法

可以使用标准方法来分离异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径 核酸。从目的源生物(例如细菌基因组)获得想要的核酸的方法是常规的 并且是分子生物学领域公知的(参见，例如WO2004/033646及其中引用 的文献，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于目的核酸的分离)。 例如，如果核酸序列是已知的(例如任何在此所述的已知核酸)，那么可 通过限制性内切核酸酶消化来产生适当的基因组文库并且可用与想要的 核酸序列互补的探针筛选该文库。一旦分离了序列，可使用标准引物导向 扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)来扩增DNA(美国专利号4,683,202， 其在此通过整体引用作为参考，特别是对于PCR方法)来获得适于使用 适当的载体来转化的DNA量。

或者，可以使用标准方法来化学合成异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或 MVA途径核酸，例如具有已知核酸序列的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI 和/或MVA途径核酸。

可以使用标准方法来鉴定可适合用于在此所述组合物和方法的其他 异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径的多肽。例如，可以在诸如大肠 杆菌的生物中构建已知天然产生异戊二烯的生物的染色体DNA的黏粒文 库，然后筛选异戊二烯生产。特别地，可产生黏粒文库，在该文库中，基 因组DNA的大区段(35-45kb)包装到载体并用于转化适当的宿主。黏粒 载体是独特的，因为能接纳大量DNA。通常，黏粒载体具有封装以及随后 环化异源DNA所需的至少一个拷贝的cosDNA序列。除了cos序列，这 些载体也含有诸如ColEI的复制起点以及药物抗性标记如对于氨苄青霉素 或新霉素有抗性的核酸。使用黏粒载体来转化适当的细菌宿主的方法充分 描述于Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二 版，ColdSpringHarbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对 于转化方法。

通常对于克隆黏粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA并 使用适当的连接酶将与其邻近黏粒载体的cos区连接。然后将含有线性异 源DNA的黏粒载体与DNA包装载体如噬菌体反应。在包装过程期间，切 割cos位点并将异源DNA包装到细菌病毒颗粒的头部。然后使用这些颗粒 来转染适当的宿主细胞如大肠杆菌。一旦注入细胞，异源DNA在cos粘末 端的影响下环化。以这一方式，可以将大区段异源DNA导入宿主细胞并 表达。

其他获得异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的方法包括 通过检测法(例如在此所述的顶空检测法)或通过使用针对于编码一段保 守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物进行PCR来筛 选宏基因组文库。可以通过比对已知异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA 途径多肽的氨基酸序列来鉴定保守氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶 多肽的比对序列鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以对发现能天然 生产异戊二烯的生物进行标准蛋白纯化方法(这是本领域公知的)并且可 以使用标准方法对得到的纯化多肽测序。文献中记载了其他方法(参见， 例如Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007； Withers等人，ApplEnvironMicrobiol.73(l9)：6277-83，2007，其各在此 通过整体引用作为参考，特别是对于参与异戊二烯合成的核酸鉴定)。

此外，可以使用标准序列比对和/或结构预测程序来根据其他DXS、IDI 或MVA途径多肽和核酸的一级和/或预测的多肽二级结构与已知DXS、 IDI或MVA途径多肽和核酸的结构的相似性而鉴定它们。也可以使用标 准数据库如swissprot-trembl数据库(网址在“expasy.org”，SwissInstitute ofBioinformaticsSwiss-ProtgroupCMU-1rueMichelServetCH-1211 Geneva4，Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多 肽和核酸。可以使用标准结构预测程序(例如PredictProtein(630West，168 Street，BB217，NewYork，N.Y.10032，USA))的默认设置来预测异戊二 烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的二级和/或三级结构。或者，可以 使用标准方法来测定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的实际 二级和/或三级结构。也可以通过与从已知异戊二烯合酶、DXS、IDI或 MVA途径核酸产生的探针杂交来鉴定其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或 MVA途径核酸。

示例性启动子和载体

任何在此所述的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸可以包 括在一或多个载体中。因此，本发明也表征了具有编码在此所述的任何异 戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的一种以上的核酸的载体。如 在此使用，“载体”指能够递送，并期望地在宿主细胞中表达一种或多种目 的核酸的构建体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、DNA或RNA 表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体含有受表达控制 序列所控的核酸。

如在此使用，“表达控制序列”指指导目的核酸转录的核酸序列。表达 控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。“诱导型启 动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。表达控制序列有效地连接待 转录的核酸区段。

在一些实施方式中，载体含有选择标记。术语“选择标记”指能够在宿 主细胞中表达的核酸，该选择标记允许轻易选择那些含有导入的核酸或载 体的宿主细胞。选择标记的实例包括但不限于抗生素抗性核酸(例如卡那 霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉 素、新霉素或氯霉素、)和/或赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的核酸。 示例性营养选择标记包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pyr4。 可用于转化木霉的载体系统中的标记是本领域已知的(参见例如 Finkelstein，BiotechnologyoffilamentousFungi，第6章，Finkelstein等人 编，Butterworth-Heinemann，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等 人，AppliedMolecularGeneticsoffilamentousFungi，BlackieAcademic andProfessional，ChapmanandHall，London，1992，其各在此通过整体引 用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，选择标记是amdS 核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构 巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择标记的使用描述于Kelley等人， EMBOJ.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene61：155-164，1987(其各 在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中， 异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸整合到没有选择标记的细胞 的染色体中。

适当的载体是与所用宿主细胞兼容的那些。适当的载体可以源自，例 如细菌、病毒(如噬菌体T7或源自M13的噬菌体)、黏粒、酵母或植物。 获得和使用此种载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如 Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，Cold SpringHarbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体的 使用)。

启动子是本领域公知的。任何在宿主细胞中起作用的启动子可以用于 在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。用于在 多种宿主细胞中驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸表达的 起始控制区或启动子很多并且是本领域技术人员所熟知的(参见，例如 WO2004/033646及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参 考，特别是对于表达目的核酸的载体)。事实上，任何能够驱动这些核酸 的启动子都适于本发明，这些启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、 GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、 ENO和TPI(用于在酵母菌中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母(Pichia) 中表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表 达)。

在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利 号7,132,527及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特 别是对于用于表达目的多肽的启动子和质粒系统)。可以使用报道的葡萄 糖异构酶启动子突变体来改变由有效连接葡萄糖异构酶启动子的核酸所 编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多种实施方式中，葡 萄糖异构酶启动子含于低、中或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。

在多种实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸 含于低拷贝质粒中(例如维持在每个细胞约1至约4拷贝的质粒)、中度 拷贝质粒(例如维持在每个细胞约10至约15拷贝的质粒)或高拷贝质粒 (例如维持在每个细胞约50或更高拷贝的质粒)。在一些实施方式中，异 源或额外内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接T7启 动子。在一些实施方式中，有效连接T7启动子的异源或额外的内源异戊 二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些 实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径 核酸有效连接Trc启动子。在一些实施方式中，有效连接Trc启动子的异 源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高 拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、 IDI或MVA途径核酸有效连接Lac启动子。在一些实施方式中，有效连 接Lac启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途 径核酸含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二 烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接内源启动子，如内源埃希 氏菌、泛菌、芽孢杆菌、耶氏酵母、链霉菌、或木霉菌启动子或内源碱性 丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径启动子。在一些 实施方式中，有效连接内源启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、 DXS、IDI或MVA途径核酸含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载 体是不整合到细胞染色体的复制质粒。在一些实施方式中，载体部分或全 部整合到细胞染色体中。

在一些实施方式中，载体是任何在引入到真菌宿主细胞时，整合到该 宿主细胞基因组中并复制的载体。载体列表参考FungalGeneticsStock CenterCatalogueofStrains(FGSC，网址为“fgsc.net”及其引用的文献， 其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体)。其他适合的表 达和/或整合载体的实例提供于Sambrook等人，MolecularCloning：A LaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989，CurrentProtocols inMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，1987，Supplement30，section 7.7.18)；vandenHondel等人，BennettandLasure(编)MoreGene ManipulationsinFungi，AcademicPresspp.396-428，1991；以及美国专利 号5,874,276，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体。特 别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。

在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有 效连接在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适当的启动子。启动子可源自 一种或多种编码宿主内源或异源的多肽的核酸。在一些实施方式中，启动 子可用于木霉宿主。启动子的适当的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、 egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1，和amy。在一些实施方式中，启动子是宿 主细胞天然的启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时， 启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉 cbhl，它是诱导型启动子并且以登录号D86235保藏于GenBank，其在此 通过整体引用作为参考，特别是对于启动子。在一些实施方式中，启动子 是真菌宿主细胞异源的启动子。有用的启动子的其他实例包括来自泡盛曲 霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)基因的启动子 (Nunberg等人，MotCellBiol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBOJ. 3：1581-1585，1984，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于启 动子)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏 木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP137280，其在此通过整体引 用作为参考，特别是对于启动子)。

在一些实施方式中，表达载体也包括终止序列。终止控制区也可源自 宿主细胞天然的多种基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源 自相同来源。在另一实施方式中，终止序列是宿主细胞内源的。特别适合 的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1.其他有用的真菌 终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等 人，MotCellBiol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBOJ3：1581-1585， 1984；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌终止子)。 任选地，可包括终止位点。对于多肽的有效表达，编码该多肽的DNA通 过起始密码子而有效连接至选择的表达控制区以便表达导致适当信使 RNA的形成。

在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子都源自待表达的异戊二 烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合 酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的编码区插入通用表达载体以便其处在 表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因 或其部分插入到强cbh1启动子的下游。

可以使用标准技术(Sambrook等人，MolecularCloning：A LaboratoryManual，ColdSpringHarbor，1982，其在此通过整体引用作为 参考，特别是对于适当DNA序列的筛选和载体的构建)将异戊二烯合酶、 DXS、IDI或MVA途径核酸插入载体，如表达载体。用于连接包含目的 核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸)、启动子、终 止子或其他序列的DNA构建体以及将它们插入适当载体的方法是本领域 公知的。例如，可以使用限制性酶来切割异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA 途径核酸和载体。然后，可以将切割下的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA 途径核酸的相容末端和切割下的载体相连。连接通常是在常规限制性位点 处连接来完成。如果不存在此种位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸 接头(参见，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual， 第二版，ColdSpringHarbor，1989以及Bennett和Lasure，MoreGene ManipulationsinFungi，AcademicPress，SanDiego，pp70-76，1991，其在 此通过整体引用作为参考，特别是对于寡核苷酸接头)。此外，可以使用 已知的重组技术(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology) 来构建载体。

在一些实施方式中，可能想要以远高于目前在天然发生的细胞中发现 的水平来过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。这一结果 可通过将编码那些多肽的核酸选择性地克隆到多拷贝质粒或将那些核酸 放在强诱导型或组成型启动子下而实现。过表达想要的多肽的方法是常见 的并且是分子生物学领域公知的，并且实例可见于Sambrook等人， MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor， 1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于克隆技术)。

下面的来源包括根据本发明有用的其他通用方法学的描述：Kreigler， GeneTransferandExpression；ALaboratoryManual，1990和Ausubel等 人编，CurrentProtocolsinMolecularBiology，1994，其每篇都在此通过整 体引用作为参考，特别是对于分子生物学和克隆技术)。

示例性源生物

异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸(以及它们的编码多肽) 可以获自任何天然含有异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的 生物。如上所指出，通过多种生物，如细菌、酵母、植物和动物而天然形 成异戊二烯。生物含有用于生产异戊二烯的MVA途径、DXP途径或MVA 和DXP途径两者(图19)。因此，DXS核酸可以获自，例如任何含有 DXP途径或含有MVA和DXP途径两者的生物。IDI和异戊二烯合酶核酸 可以获自，例如任何含有MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两 者的生物。MVA途径核酸可以获自，例如任何含有MVA途径或MVA和 DXP途径两者的生物。

在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的 核酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的核酸序列相同。在一些实施 方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的氨基酸序列与由 自然界中任何下述生物所产生的多肽序列相同。在一些实施方式中，异戊 二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸或多肽是源自在此所述的任何生 物的突变核酸或多肽。如在此使用，“源自”指被导入一或多个突变的核酸 或多肽来源。例如，“源自植物多肽”的多肽指通过向野生型植物多肽的序 列(即，天然发生的序列)导入一或多个突变所产生的目的多肽。

在一些实施方式中，源生物是真菌，其实例是曲霉种如米曲霉和黑曲 霉，酵母种如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)种如粟酒裂殖 酵母(S.pombe)，和木霉种如里氏木霉。在一些实施方式中，源生物是 丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见， Alexopoulos，C.I.(1962)，IntroductoryMycology，Wiley，NewYork)。 这些真菌特征为营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其他复杂多糖 所构成。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母不同。丝状真菌的营养生 长是菌丝延伸并且碳代谢是专性有氧的。丝状真菌的亲本细胞可为下述物 种的细胞：木霉(如里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性 形态，以前归类为T.longibrachiatum、绿色木霉(Trichodermaviride)、 康氏木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)) (Sheir-Neirs等人，Appi.Microbiol.Biotechnol20：46-53，1984；ATCC No.56765和ATCCNo.26921)；青霉属(Peniciliiumsp.)，腐质霉属 (Humicolasp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、疏毛腐质霉(H.lanuginose) 或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢霉属(Chrysosporiumsp.)(如C. iucknowense)、Gliociadiumsp、曲霉属(如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉 (A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛 曲霉(A.awamori))(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743、 1993和Goedegebuur等人，Genet41：89-98、2002)、镰孢(Fusariumsp)、 (如粉红镰孢(F.roseum)、赤禾镰孢(F.graminum)、F.cerealis、 尖镰孢(F.oxysporuim)或F.venenatum)、脉孢菌(Neurosporasp.)、 (如粗糙脉胞菌(N.crassa))、肉座菌(Hypocreasp.)、毛霉菌(Mucor sp.)、(如米黑毛霉(M.miehei))、根霉菌(Rhizopussp.)和Emericella sp.(也参见Innis等人，Sci.228：21-26，1985)，但不限于此。术语 “Trichoderma”或“Trichodermasp.”或“Trichodermaspp.”指任何以前或目 前被归类为木霉属的真菌属。

在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉 (A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢或腐 皮镰孢(F.solani)。曲霉菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol. Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，CurrGene41：89-98， 2002，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌。在具体实 施方式中，真菌是木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株 是已知的并且非限制性实例包括ATCCNo.13631，ATCCNo.26921， ATCCNo.56764，ATCCNo.56765，ATCCNo.56767和NRRL15709，其 每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。在一些实 施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等 人，Appl.Microbiol.Biotechnology20：46-53，1984，其在此通过整体引用 作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。

在一些实施方式中，源生物是酵母，例如酿酒酵母，裂殖酵母 (Schizosaccharomycessp.)，毕氏酵母(Pichiasp.)或假丝酵母(Candida sp.)。

在一些实施方式中，源生物是细菌，例如芽孢杆菌菌株，如地衣芽孢 杆菌或枯草杆菌，泛菌(Pantoea)菌株如柠檬泛菌(P.citrea)，假单胞 菌(Pseudomonas)菌株如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，链霉菌 (Streptomyces)菌株如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans) 或锈赤链霉菌(S.rubiginosus)，或埃希氏菌菌株如大肠杆菌。

如在此所述，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌” 属中的所有种，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B. lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆 菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆 菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝固芽孢杆菌(B. coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus) 和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经意识到该芽孢杆菌属持续经 历分类学重组。因此，该属意在包括已经被重分类的种，包括但不限于如 嗜热脂肪芽孢杆菌(现称作嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))的生物。认为在氧气存在下，抗性内孢子的生产是 芽孢杆菌属的限定特征，但是这一特征也用于近来命名的脂环酸杆菌属 (Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌 属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌 (Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐 芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆 菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属 (Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

在一些实施方式中，源生物是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链 霉菌(如，白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或 灰色链霉菌(S.griseus)和芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，源生物是 革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌或假单胞菌。

在一些实施方式中，源生物是植物，如来自豆科(Fabaceae)的植物， 如蝶形花亚科。在一些实施方式中，源生物是野葛，杨(如银白杨xtremula CAC35696或银白杨)(Sasaki等人，FEBSLetters579(11)：2514-2518， 2005)，白杨(如Populustremuloides)，或夏栎(Quercusrobur)。

在一些实施方式中，源生物是藻类，如绿藻、红藻、灰绿藻 (glaucophyte)、chlorarachniophyte、眼虫、chromista或沟鞭藻。

在一些实施方式中，源生物是蓝藻，如根据形态学而被分类为下述组 的蓝藻：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻 目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。

示例性宿主细胞

可以使用多种宿主细胞来表达异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA 途径多肽并按所要求保护的发明的方法来生产异戊二烯。示例性的宿主细 胞包括来自在前面标题为“示例性源生物”部分所列出的任何生物的细胞。 宿主细胞可为天然产生异戊二烯的细胞或不天然产生异戊二烯的细胞。在 一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二烯，并且加入 异戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸以增强使用这一途径的异戊二烯生产。 在一些实施方式中，宿主细胞天然使用MVA途径生产异戊二烯，并且加 入异戊二烯合酶和/或一或多种MVA途径核酸以增强使用这一途径的异戊 二烯生产。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二 烯，并且加入一或多种MVA途径核酸来使用DXP途径以及MVA途径的 部分或者全部来生产异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用 DXP和MVA两种途径生产异戊二烯，并且加入一或多种异戊二烯合酶、 DXS、IDI或MVA途径核酸以增强使用这些途径中一种或两种的异戊二 烯生产。

示例性转化方法

可以使用用于表达编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径 多肽的标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸或含有 它们的载体插入宿主细胞(例如，在此所述的植物细胞、真菌细胞、酵母 细胞或细菌细胞)。可以使用诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染 (如，脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒 的转染)、磷酸钙DNA沉淀孵育、DNA包被微粒的高速轰击以及原生质 体融合这些技术进行DNA构建体或载体向宿主细胞的导入。通用的转化 技术是本领域已知的(参见例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology (F.M.Ausubel等人编，Chapter9，1987；Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989；和 Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其各在此通过整体引用作为 参考，特别是对于转化方法)。异源多肽在木霉菌中的表达描述于美国专 利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO 2005/001036；Harkki等人，EnzymeMicrob.Technol.13：227-233，1991； Harkki等人，BioTechnol.7：596-603，1989；EP244,234；EP215,594；和 Nevalainen等人，TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplication totheExpressionofBothHomologousandheterologousGenes，在 MolecularIndustrialMycology，Leong和Berka编，MarcelDekkerInc.， NYpp.129-148，1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化 和表达方法)。对于曲霉菌株的转化也参考Cao等人，Sci.9：991-1001，2000； EP238023；和Yelton等人，Proceedings.Nail.Acad.Sci.USA8 1：1470-1474，1984(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方 法)。所导入的核酸可整合到染色体DNA或者作为染色体外复制序列维 持。

任何本领域已知的方法可用于筛选转化体。在一个非限制性实例中， 包括amdS标记的稳定转化体与不稳定转化体的区别在于它们更快的生长 速率以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成平滑而非齿状轮廓的圆形菌 落。此外，在通过于固体非选择性培养基(例如缺乏乙酰胺的培养基)上 生长转化体来进行稳定性的进一步检测的情形下，从这一培养基收获孢 子，并测定随后在含有乙酰胺的选择培养基上萌发并生长的这些孢子的百 分数。

在一些实施方式中，通过如下方法来转化真菌细胞，该方法涉及原生 质体形成以及原生质体转化以及以已知方式再生细胞壁。在一个具体实施 方式中，制备木霉菌用来转化包括从真菌菌丝体制备原生质体(参见， Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其在此通过整体引用作为参 考，特别是对于转化方法)。在一些实施方式中，菌丝体获自萌发的营养 孢子。用消化细胞壁的酶来处理菌丝体，得到原生质体。然后通过在悬浮 培养基中渗透压稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、 甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M 之间变化。希望使用在悬浮培养基中约1.2M的山梨醇溶液。

DNA向宿主木霉菌菌株的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液 中使用约10mMCaCl2到50mMCaCl2。除了摄取溶液中的钙离子，通常 包括的其他化合物是缓冲系统，如TE缓冲液(10mMTris，pH7.4；1mM EDTA)或10mMMOPS，pH6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。 尽管不希望受任何具体理论所限，但相信聚乙二醇用于融合细胞膜，从而 允许培养基中的内容物被送到木霉菌菌株的细胞质中并且质粒DNA被转 入核中。这一融合经常留下多拷贝的整合到宿主染色体的质粒DNA。

通常，在转化中使用含有木霉菌原生质体或细胞的悬浮液，这些原生 质体或细胞以105至107/mL(如2x106/mL)的密度进行了通透性处理。 在适当溶液(如1.2M山梨醇和50mMCaCl2)中100μL体积的这些原生 质体或细胞与想要的DNA混合。通常，向摄取溶液中加入高浓度PEG。 可将0.1至1体积的25％的PEG4000加入原生质体悬浮液中。在一些实 施方式中，约0.25体积加入原生质体悬浮液。也可将诸如二甲亚砜、肝素、 亚精胺、氯化钾等添加剂加入摄取溶液，帮助转化。对于其他真菌宿主细 胞可以用类似的方法(参见例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其 每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。

通常，然后在约0℃培养混合物10至30分钟的时间。然后向混合物 加入另外的PEG以进一步增强想要的核酸序列的摄取。通常以转化混合 物体积的5至15倍体积来添加25％的PEG4000；然而，更大或更小的体 积也可为适合的。希望25％的PEG4000是转化混合物体积的约10倍。 在加入PEG后，在室温或在冰上培养该转化混合物，然后加入山梨醇和 CaCl2溶液。然后向熔化的生长培养基等份进一步加入原生质体悬浮液。 当生长培养基包括生长选择(如乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体生 长。

可根据常规方法进行细菌细胞的转化，如Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，1982所述，其在此通 过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。

示例性细胞培养基

本发明也包括产生异戊二烯的培养细胞或细胞群。“培养细胞”指在允 许细胞经历一或多次细胞分裂的溶液(如细胞培养基)中的两种或更多种 细胞。“培养细胞”不包括这样的植物细胞，其是含有已经分化成植物组织 的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多种实施方式中，细胞培养物包括 至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多的细 胞。

任何碳源可以用于培养宿主细胞。术语“碳源”指能够被宿主细胞或生 物所代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养 基可包括任何适于维持宿主细胞存活或生长的碳源。

在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多 糖)、转化糖(例如，酶促处理的蔗糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生物 柴油或制造肥皂工艺的甘油副产物)、二羟丙酮、单碳源、油(例如，植 物油如玉米、棕榈或大豆油)、乙酸盐/酯、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例 如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂类、磷脂、甘 油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白 或肽)、可再生碳源(例如，生物量碳源，如水解的生物量碳源)、酵母 提取物、来自酵母提取物的组分，聚合物，酸，醇，醛，酮，氨基酸，琥 珀酸，乳酸，乙酸，乙醇、或者前述两种或更多种的任意组合。在一些实 施方式中，碳源是光合合成的产物，包括但不限于葡萄糖。在一些实施方 式中，碳水化合物是木糖或葡萄糖。

示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，而示例 性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露 糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式 中，细胞培养基包括碳水化合物以及碳水化合物之外的碳源(例如丙三醇、 甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、 甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或酵母提取物的 组分)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及多肽(例如 微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或 细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻 风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄 榄、红花、芝麻、或亚麻籽的多肽。

在一些实施方式中，碳水化合物的浓度为至少或约每升培养液5克 (g/L，其中，培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如 至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400 或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度在约50和约400g/L 之间，例如约100和约360g/L之间，约120和约360g/L之间，或约200 和约300g/L之间。在一些实施方式中，碳水化合物的这一浓度包括在宿 主细胞培养之前和/或培养期间，加入的碳水化合物的总量。

示例性脂类是任何含有一种或多种脂肪酸的物质，所述脂肪酸是饱 和、不饱和或分支的C4以及以上的脂肪酸。

示例性油是室温为液态的脂类。在一些实施方式中，脂类含有一种或 多种C4或更高的脂肪酸(例如，含有具有四个或更多个碳的一种或多种 饱和、不饱和或分支脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、 油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕 榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻籽、产油微生物细胞、乌桕、或者是前述 两种或更多种的任一组合。

示例性脂肪酸包括通式为RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性 不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性不饱 和脂肪酸包括但不限于油酸、11-十八碳烯酸、亚油酸、棕榈油酸以及花 生四烯酸。示例性多不饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”包括多个碳-碳双 键。示例性饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”是饱和脂族基团。在一些实 施方式中，碳源包括一或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中， 碳源是脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸) 的衍生物、或者脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)衍生物的盐。适当的盐包括 但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是丙三醇的脂肪酸酯。

在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯 或甘油三酯的浓度是至少或约每升培养液1克(g/L，其中培养液的体积包 括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、 40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式 中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是 约10和约400g/L之间，例如约25和约300g/L之间，约60和约180g/L 之间，或约75约150g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主 细胞之前和/或期间添加的脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯 或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(i)脂类、油、脂肪、 脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯和(ii)碳水化合物，如葡萄糖。 在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘 油三酯与碳水化合物基于碳的比率是约1∶1(即每个碳水化合物碳对应脂 类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。 在具体实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘 油三酯的量为约60和约180g/L之间，而碳水化合物的量为约120和约360 g/L之间。

示例性微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。示例性 植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日 葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽 的一或多种多肽。

示例性的可再生碳源包括奶酪乳清渗透物(cheesewheypermeate)、 玉米浆、甜菜糖浆、大麦芽、和来自任何前述物质的组分。示例性可再生 碳源也包括存在于生物量中的乙酸盐/酯、葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，生 物量如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵工艺的细胞废物，以及来自大豆、玉米、 或小麦碾磨的蛋白副产物。在一些实施方式中，生物量碳源是木质纤维素、 半纤维素或纤维素物质，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、 软木材木浆、玉米、玉米穗轴或外壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米 秸秆、柳枝稷、稻壳产品、或来自谷物(如玉米、高粱、黑麦、小黑麦 (triticate)、大麦、小麦和/或酒糟)的湿或干碾磨的副产物。示例性纤 维素物质包括木、纸和纸浆废物、草本植物和果浆。在一些实施方式中， 碳源包括任何植物部分，例如茎、谷物、根或块茎。在一些实施方式中， 将任何下述植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、小黑 麦、水稻、粟、大麦、木薯、豆类例如豆和豌豆、马铃薯、甜薯、香蕉、 甘蔗、和/或树薯粉。在一些实施方式中，碳源是生物量水解物，如包括木 糖和葡萄糖或包括蔗糖和葡萄糖的生物量水解物。

在一些实施方式中，可再生碳源(例如生物量)在添加到细胞培养基 之前被预处理。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、 或酶和化学预处理两者的组合(参见，例如Farzaneh等人，Bioresource Technology96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利 号6,106,888；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于可再生碳 源的预处理)。在一些实施方式中，可再生碳源在添加到细胞培养基之前 被部分或完全水解。

在一些实施方式中，可再生碳源(例如玉米秸秆)在添加到细胞培养 基之前经历氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见例如，Farzaneh等人， BioresourceTechnology96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理期 间，可再生碳源在中等温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250 至约300psi)下受无水液态氨处理约5分钟。然后快速释放压力。在这一 过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素解晶作用的组合的化学和物 理效应，以及增加的表面积使得纤维素和半纤维素几乎完全酶促转化成可 发酵糖。AFEX预处理具有可以回收几乎全部的氨并再利用，同时将剩余 物用作下游过程中的微生物的氮源的优点。此外，AFEX预处理不需要冲 洗流。因此，在AFEX处理后的干物质回收基本上为100％。AFEX基本 上是干-干工艺。经处理的可再生碳源是长期稳定的并且可以在酶促水解或 发酵工艺中以极高固体负载来供料。纤维素和半纤维素在AFEX工艺中得 到很好地保留，只有很少或没有降解。不需要在经历AFEX预处理的可再 生碳源酶促水解之前进行中和。AFEX处理的碳源的酶促水解产生清洁的 糖流用于随后的发酵。

在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于至少或约 0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、或50％的葡萄糖 (w/v)。可以使用标准HPLC方法，用葡萄糖作为参考来测量由碳源产 生的葡萄糖的量，从而确定葡萄糖的当量。在一些实施方式中，碳源(例 如可再生碳源)的浓度相当于约0.1和约20％之间的葡萄糖，例如约0.1 和约10％之间的葡萄糖，约0.5和约10％之间的葡萄糖，约1和约10％之 间的葡萄糖，约1和约5％之间的葡萄糖，或约1和约2％之间的葡萄糖。

在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或者酵母提取物的一种或多 种组分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度为至少每升培养液1克酵 母提取物(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)， 例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300 或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是约1和约300g/L之 间，例如约1和约200g/L之间，约5和约200g/L之间，约5和约100g/L 之间，或约5和约60g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主 细胞之前和/或期间添加的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包 括酵母提取物(或其一或多种组分)和另一碳源如葡萄糖。在一些实施方 式中，酵母提取物和另一碳源的比率为约1∶5，约1∶10，或约1∶20(w/w)。

此外，碳源也可为单碳底物，如二氧化碳或甲醇。来自单碳源(例如 甲醇、甲醛或甲酸酯)的丙三醇生产已经报道于甲基营养酵母中(Yamada 等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其在此通过整体引用作为 参考，特别是对于碳源)和细菌中(Hunter等人，Biochemistry，24， 4148-4155，1985，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。这 些生物可以同化单碳化合物，氧化态从甲烷到甲酸酯改变，并产生丙三醇。 碳同化的途径可以通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸或通过木酮糖单磷酸 (Gottschalk，BacterialMetabolism，第二版，Springer-Verlag：NewYork， 1986，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。核酮糖单磷酸 途径包括甲酸酯与核酮糖-5-磷酸缩合以形成六碳糖，该六碳糖变成果糖并 最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样地，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶 酸将单碳化合物同化到糖酵解途径。

除了一碳和二碳底物，也已知甲基营养生物利用许多含有其他含碳的 化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基 营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb. GrowthClCompd.，[mt.Symp.]，第7版，415-32.编者：Murrell等人，出 版：Intercept，Andover，UK，1993，其在此通过整体引用作为参考，特别是 对于碳源)。类似地，众多假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Sulter 等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其在此通过整体引用作为参 考，特别是对于碳源)。

在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞 (见例如，Pourquie，J.等人，BiochemistryandGeneticsofCellulose Degradation，Aubert等人编，AcademicPress，pp.71-86，1988和Ilmen 等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其在此通过整体引用 作为参考，特别是对于细胞培养基)。示例性的生长培养基是常规商业制 备的培养基如LuriaBertani(LB)培养液，SabouraudDextrose(SD)培 养液，或酵母培养基(YM)培养液。也可使用其他限定的或合成的生长 培养基，并且用于特定宿主细胞生长的适当培养基是微生物或发酵科学领 域技术人员已知的。

除了适当的碳源，希望细胞培养基含有适当的矿物、盐、辅因子、缓 冲液和本领域技术人员已知的适于培养物生长或增强异戊二烯生产的其 他组分(参见例如，WO2004/033646以及其中引用的文献和WO96/35796 以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于 各自细胞培养基和细胞培养条件)。在异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或 MVA途径核酸处于诱导型启动子控制下的一些实施方式中，希望诱导剂 (例如糖、金属盐或抗微生物剂)以对于诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI 和/或MVA途径多肽表达有效的浓度添加到培养基中。在一些实施方式中， 细胞培养基具有抗生素(例如卡那霉素)，其对应于具有一或多种DXS、 IDI和/或MVA途径核酸的载体上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性 核酸)。

示例性细胞培养条件

适于维持并生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的。示例性的 技术可见于ManualofMethodsforGeneralBacteriologyGerhardt等人 编，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.(1994)或Brock inBiotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989) SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，其各在此通过整体引用作为参 考，特别是对于细胞培养技术。在一些实施方式中，在允许表达由插入到 宿主细胞的核酸所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽 中一种或多种的条件下，在培养基中培养细胞。

可以使用标准细胞培养条件来培养细胞(参见例如WO2004/033646 以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于 细胞培养和发酵条件)。细胞在适当温度、气体混合物和pH(例如约20 至约37℃，约6％至约84％CO2，以及约5至约9的pH)下生长并维持。 在一些实施方式中，细胞在35℃下于适当的细胞培养基中生长。在一些实 施方式中，例如，培养物在接近28℃下于适当培养基中在摇动培养或发酵 罐中培养直到达到想要量的异戊二烯生产。在一些实施方式中，用于发酵 的pH范围为约pH5.0至约pH9.0之间(例如约pH6.0至约pH8.0之间 或pH6.5至约pH7.0之间)。根据宿主细胞的要求，反应可在需氧、缺 氧或厌氧的条件下进行。对于给定丝状真菌的示例性培养条件是本领域已 知的并且可见于科学文献和/或来自真菌源如美国典型培养物保藏中心和 真菌遗传种源中心(FungalGeneticsStockCenter)。

在多种实施方式中，使用任何已知的发酵模式，如分批、补料分批或 连续发酵方法来培养细胞。在一些实施方式中，使用发酵的分批方法。经 典的分批发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成并且该组 成在发酵期间不进行人工改变。因此，在发酵开始时，用想要的宿主细胞 接种细胞培养基并且允许发酵而不向系统添加任何物质。然而，通常，“分 批”发酵是对于添加碳源而言的分批并且经常尝试控制诸如pH和氧浓度 的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组成持续改变直到发酵停 止时。在分批培养物中，细胞稳定地经过静态停滞期到高生长对数期并最 终至生长率减小或停止的稳定期。在一些实施方式中，对数期的细胞负责 大部分的异戊二烯生产。在一些实施方式中，稳定期的细胞生产异戊二烯。

在一些实施方式中，使用标准分批系统的变型，例如补料分批 (Fed-Batch)系统。补料分批发酵方法包括典型的分批系统，只是随着发 酵进展而以增量添加碳源。当分解代谢产物阻遏倾向于抑制细胞代谢，以 及想要细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以 有限量或过量的碳源(例如葡萄糖)来进行补料分批发酵。对补料分批系 统中实际碳源浓度的测量很难，并且因此基于可测因子如pH、溶氧和废 气(如CO2)分压的改变来进行估算。分批以及补料分批发酵是本领域普 遍且公知的，并且实例可见于Brock，Biotechnology：ATextbookof IndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，其在 此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。

在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放系统，其中 向生物反应器中连续添加限定的发酵培养基并且同时除去等量的条件培 养基用于处理。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，而细胞主要 处于对数期生长。

连续发酵允许调控影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任何 数量的因素。例如，一种方法将限制营养物如碳源或氮水平维持在固定比 率并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，可以连续改变影响生长的 许多因素同时保持细胞浓度(如培养基浑浊度所测量的浓度)恒定。连续 系统致力于维持稳态生长条件。因此由于被丢掉的培养基，在发酵中，细 胞损失相对于细胞生长速率保持平衡。调控用于连续发酵工艺的营养物和 生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域领 域公知的并且多种方法详述于Brock，Biotechnology：ATextbookof IndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，其在 此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。

在一些实施方式中，细胞固定在基质上作为完整细胞催化剂并经历用 于异戊二烯生产的发酵条件。

在一些实施方式中，将多瓶液体培养物放置在摇床上以便将氧气引入 液体并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用培养箱来控制培养 物生长的温度、湿度、摇速和/或其他条件。最简单的培养箱是具有可调加 热器的保温箱，其通常高达～65℃。更精细的培养箱也可以包括降低温度 的能力(通过冷冻)，或控制湿度或CO2水平的能力。大多数培养箱包括 计时器；一些也可以编程以通过不同的温度、湿度水平等来循环。培养箱 可以从桌面的尺寸到小房间的尺寸来变化。

如果需要，可以改变一部分或者所有细胞培养基以补充营养物和/或避 免积累潜在的有害代谢副产物和死亡细胞。在悬浮培养的情形下，可以利 用离心或过滤该悬浮培养物而从培养基分离细胞并且然后在新鲜培养基 中重悬细胞。在贴壁培养的情形下，可以通过吸取和替代而直接除去培养 基。在一些实施方式中，细胞培养基允许在连续培养(例如没有稀释的连 续培养)中至少一部分细胞分开用于至少或约5、10、20、40、50、60、 65或更多细胞分裂。

在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)， 并且不添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、 DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。在一些实施方案中，添加化合物(如 IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途 径核酸的表达。

示例性异戊二烯生产

在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下，于细胞培养 基中培养细胞。“峰值绝对生产力”指在培养细胞特定时间段内(例如在特 定发酵期间的细胞培养)，在废气中异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生 产力时间点”指细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培 养)，当废气中的异戊二烯的绝对量为最大值时的时间点。在一些实施方 式中，异戊二烯量在峰值绝对生产力时间点处测量。在一些实施方式中， 细胞的峰值绝对生产力约为任何在此所公开的任一异戊二烯量。

“峰值比生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间 的细胞培养)，每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产力时间点” 指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当每 细胞生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比生产力通过用总生 产力除以细胞量来测定，如由在600nm处的光密度(OD600)来测定。在 一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比生产力时间点处测量。在一些实施 方式中，细胞的峰值比生产力约为任何在此所公开的每细胞的异戊二烯 量。

“峰值体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵 期间的细胞培养)，每体积培养液生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积 生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细 胞培养)，当每体积培养液生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰 值比体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和时间量来测定。在一些 实施方式中，异戊二烯量在峰值比体积生产力时间点处测量。在一些实施 方式中，细胞的峰值比体积生产力约为任何在此所公开的每体积每时间异 戊二烯量。

“峰值浓度”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细 胞培养)，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”指在细胞培养的 特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞所生产的 异戊二烯的量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰 值浓度时间点处进行测量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度约为任何 在此所公开的异戊二烯量。

“平均体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期 间的细胞培养)，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产 的异戊二烯的平均量。平均体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和 时间量来测定。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产力约为任何在 此所公开的每体积每时间异戊二烯量。

“累积总生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间 的细胞培养)，生产的异戊二烯的累积总量。在一些实施方式中，测量异 戊二烯的累计总量。在一些实施方式中，细胞的累计总生产力约为任何在 此所公开的异戊二烯量。

在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、 200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、 1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、 40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000、或更多纳 摩尔的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(纳摩尔/gwcm/hr)生产异戊二 烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约200,000纳摩尔/gwcm/hr 之间，例如在约2至约100纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约500纳摩尔 /gwcm/hr、约150至约500纳摩尔/gwcm/hr、约500至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、 约1,000至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、 约5,000至约10,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、 约50,000至约100,000纳摩尔/gwcm/hr、约100,000至约150,000纳摩尔 /gwcm/hr、或约150,000至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间。在一些实施方式 中，异戊二烯的量在约20至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约 5,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约1,000 纳摩尔/gwcm/hr、约300至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约400至约1,000纳摩 尔/gwcm/hr、约1,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约20,000纳摩 尔/gwcm/hr、约5,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约100,000 纳摩尔/gwcm/hr、约20,000至约150,000纳摩尔/gwcm/hr、或约20,000至约 200,000纳摩尔/gwcm/hr。

以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯的量可以按照美国专利号 5,849,970所公开来测量，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊 二烯生产的测量。例如，使用标准气相色谱系统来分析2ml顶空(例如， 来自培养物的顶空，该培养物如在32℃，在密封瓶中以200rpm摇动约3 小时培养的2mL培养物)的异戊二烯，该系统为例如以正-辛烷/多孔硅胶 C柱(AlitechAssociates，Inc.，Deerfield，Ill.)等温操作并且连接RGD2氧 化汞还原气体检测器的系统(TraceAnalytical，MenloPark，CA)(参见 例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等 人，PlantPhysiol.97：1588-1591，1991，其各在此通过整体引用作为参考， 特别是对于异戊二烯生产的测量)。气相色谱面积单位通过标准异戊二烯 浓度校准曲线而转换成nmol异戊二烯。在一些实施方式中，以细胞湿重 计，细胞克数值通过获得细胞培养物的样品的A600值，然后根据具有已知 A600值的细胞培养物的湿重的校准曲线将A600值转换成细胞克数来计算。 在一些实施方式中，通过假定1升具有A600值为1的培养液(包括细胞培 养基和细胞)具有1克湿重细胞来估计细胞克数。该值也除以该培养物被 孵育的小时数，如3小时。

在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、 200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、 1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng 的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在一些实 施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如约2至约 100ng/gwcm/h之间，约100至约500ng/gwcm/h、约500至约1,000ng/gwcm/h、 约1,000至约2,000ng/gwcm/h、或约2,000至约5,000ng/gwcm/h。在一些实 施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000ng/gwcm/h、约100至约5,000 ng/gwcm/h、约200至约2,000ng/gwcm/h、约200至约1,000ng/gwcm/h、约300 至约1,000ng/gwcm/h、或约400至约1,000ng/gwcm/h。以ng/gwcm/h计的异 戊二烯的量可以通过将在上面讨论的以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯 生产的值乘以68.1来计算(如下面等式5所述)。

在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、 200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、 1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或 更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的量包括细胞和细 胞培养基的体积)来生产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在一些实施方 式中，异戊二烯的量在约2至约5,000mg/L培养液之间，例如约2至约100 mg/L培养液之间、约100至约500mg/L培养液、约500至约1,000mg/L培养液、 约1,000至约2,000mg/L培养液、或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实 施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000mg/L培养液之间、约100至约5,000 mg/L培养液、约200至约2,000mg/L培养液、约200至约1,000mg/L培养液、约 300至约1,000mg/L培养液、或约400至约1,000mg/L培养液。

来自摇瓶顶空或类似培养物的以mg异戊二烯/L计的异戊二烯的比生 产力可以这样测量：在OD600值为约1.0下，从细胞培养物取1ml样品， 将其至于20mL瓶中，孵育30分钟，然后测量顶空中异戊二烯的量(如 例如，实施例I，第II部分所述)。如果OD600值不是1.0，那么可以通过 除以OD600值而将测量归一为OD600值。mg异戊二烯/L顶空的值可以通过 乘以因数38而转换成培养液的mg/L培养液/hr/OD600。以mg/L培养液/hr/OD600为单位的值可以乘以小时数以及OD600值以获得以mg异戊二烯/L培养液 为单位的累积滴定度。

在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积生产力为高于 或约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、 700、800、900、1,000、1100、1,200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、 1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、 2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更高mg异 戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞 培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约0.1 至约3,500mg/L培养液/hr之间，例如在约0.1至约100mg/L培养液/hr之间、 约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、约1,000至 约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000至约2,500 mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、或约3,000至约3,500mg/L 培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约10至约3,500 mg/L培养液/hr之间、约100至约3,500mg/L培养液/hr、约200至约1,000mg/L 培养液/hr、约200至约1,500mg/L培养液/hr、约1,000至约3,000mg/L培养液/hr、 或约1,500至约3,000mg/L培养液/hr。

在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体积生产力高于或 约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、 700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、 1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、 2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、 4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、 6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、 9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多mg异戊二烯/L的 培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体 积)。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产力在约0.5至约15,000 mg/L培养液/hr之间，例如约0.5至约10mg/L培养液/hr之间、约1.0至约100 mg/L培养液/hr、约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、 约1,000至约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000 至约2,500mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、约3,000至约 3,500mg/L培养液/hr、约3,500至约5,000mg/L培养液/hr、约5,000至约7,500 mg/L培养液/hr、约7,500至约10,000mg/L培养液/hr、约10,000至约12,500mg/L 培养液/h、或约12,500至约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二 烯的峰值体积生产力在约10至约15,000mg/L培养液/hr之间、约100至约 2,500mg/L培养液/hr、约1,000至约5,000mg/L培养液/hr、约2,500至约7,500 mg/L培养液/hr、约5,000至约10,000mg/L培养液/hr、约7,500至约12,500mg/L 培养液/hr、或约10,000至约15,000mg/L培养液/hr。

可以通过对发酵罐废气取样品，按所述，如在实施例I，第II部分所 述分析它的异戊二烯量(以例如mg异戊二烯/L气体为单位)并将这一值乘 以废气流经每升培养液的速率(例如，以1vvm(空气体积/培养液体积/ 分钟)来测量发酵罐中以mg/L培养液/hr计的瞬间异戊二烯生产。因此，1mg/L 气体的废气水平对应于在空气流速为1vvm时，60mg/L培养液/hr的瞬间生 产力。如果需要，可以将以mg/L培养液/hr为单位的值除以OD600值以获得 以mg/L培养液/hr/OD为单位的比速率。mg异戊二烯/L气体的平均值可以通过 将这一平均废气异戊二烯浓度乘以发酵期间每升发酵培养液冒出的废气 的总量而转换成总产物生产力(每升发酵培养液的异戊二烯克数，mg/L培养液)。因此，在1vvm时10小时内0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯 浓度对应于300mg异戊二烯/L培养液的总产物浓度。

在一些实施方式中，培养细胞将细胞培养基中的大于或约0.0015、 0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、 18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、 30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、 65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、或90.0摩尔％的碳转化成异戊二烯。在一 些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约90.0摩尔％之 间，例如约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、 约0.05至约0.15％，0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、 约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％、约1.0至约1.6％、约1.6至约3.0％、 约3.0至约5.0％、约5.0至约8.0％、约8.0至约10.0％、约10.0至约15.0％、 约15.0至约20.0％、约20.0至约25.0％、约25.0％至30.0％、约30.0％至 35.0％、约35.0％至40.0％、约45.0％至50.0％、约50.0％至55.0％、约 55.0％至60.0％、约60.0％至65.0％、约65.0％至70.0％、约75.0％至80.0％、 约80.0％至85.0％、或约85.0％至90.0％。在一些实施方式中，碳转化成 异戊二烯的百分数在约0.002至约0.4摩尔％，0.002至约0.16摩尔％，0.04 至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％、约 0.05至约0.3摩尔％、约0.1至0.3摩尔％、约0.3至约1.0摩尔％、约1.0 至约5.0摩尔％、约2至约5.0摩尔％、约5.0至约10.0摩尔％、约7至约 10.0摩尔％、约10.0至约20.0摩尔％、约12至约20.0摩尔％、约16至 约20.0摩尔％、约18至约20.0摩尔％、约18至23.2摩尔％、约18至23.6 摩尔％、约18至约23.8摩尔％、约18至约24.0摩尔％、约18至约25.0 摩尔％、约20至约30.0摩尔％、约30至约40.0摩尔％、约30至约50.0 摩尔％、约30至约60.0摩尔％、约30至约70.0摩尔％、约30至约80.0 摩尔％、或约30至约90.0摩尔％。

碳转化成异戊二烯的百分数(也称作％碳产量)可以通过将所生产的 异戊二烯的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如在分批和补料葡萄糖和酵母 提取物中的摩尔碳)而测量。这一数字乘以100％得到百分数值(如等式1 所示)。

等式1

％碳产量＝(生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)＊100

对于这一计算，可以假定酵母提取物含有50％w/w碳。作为实例，对 于实施例7，第III部分所述的500升，碳转化成异戊二烯的百分数可以按 等式2所示来计算。

等式2

％碳产量＝(39.1g异戊二烯＊1/68.1mol/g＊5C/mol)/[(181221g葡萄糖 ＊1/180mol/g＊6C/mol)+(17780g酵母提取物＊0.5＊1/12mol/g)]＊100＝ 0.042％

对于在此所述的两个500升发酵(实施例7，第VII和VIII部分)， 碳转化成异戊二烯的百分数在0.04-0.06％之间。使用在此所述的14升系 统实现了0.11-0.16％碳产量。

本领域熟练技术人员可以容易地将异戊二烯生产率或生产的异戊二 烯的量转化成任何其它单位。示例性的等式列于下面用于在单位间的相互 转换。

异戊二烯生产率(总的和比生产率)的单位

等式3

1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积率)

等式4

1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(这一转 换假定具有OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重量)

等式5

1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(鉴于异戊二烯的 分子量)

等式6

1mnol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(以O2流速 为90L/hr每升培养液)

等式7

1ug异戊二烯/L气体废气中的异戊二烯＝60ug异戊二烯/L培养液/hr，流 速为每L培养液60L气体(1vvm)

滴定度(总和比)单位

等式8

1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(这 一转换假定具有OD600值为1的一升培养液具有约150mg的总细胞蛋白) (比生产力)

等式9

1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总滴定度)

如果需要，可以使用等式10将包括细胞湿重的任何单位转换成包括细 胞干重的相应单位。

等式10

细胞干重＝细胞湿重/3.3

在本发明所包含的一些实施方式中，包括编码异戊二烯合酶多肽的异 源核酸的细胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有编码异戊二 烯合酶多肽的异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或 约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400 倍或更高。

在本发明所包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异 源核酸以及编码DXS、IDI和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细 胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有异源核酸时所生长的相 应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50 倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。

示例性异戊二烯纯化方法

在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如， 可以使用标准技术来回收使用本发明组合物和方法所生产的异戊二烯。例 如气提、分馏、吸附/解吸附、全蒸发、从固相热或真空解吸异戊二烯、或 用溶剂提取固定化或吸附在固相上的异戊二烯(参见例如，美国专利号 4,703,007和4,570,029，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊 二烯回收和纯化方法)。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及以液体 形式分离异戊二烯(例如异戊二烯纯溶液或溶剂中的异戊二烯溶液)。气 提涉及以连续方式从发酵废气流除去异戊二烯蒸汽。此种去除可以以多种 不同方式实现，包括但不限于吸附至固相，分配到液相，或直接冷凝。在 一些实施方式中，在蒸发露点以上，稀释异戊二烯蒸汽流的膜富集导致液 体异戊二烯的冷凝。

异戊二烯的回收可包括一步或多步。在一些实施方式中，从发酵废气 除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是同时进行的。例如，异戊 二烯可以直接从废气流冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气 除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是顺序进行的。例如，可将 异戊二烯吸附至固相然后用溶剂从固相提取。

在一些实施方式中，在此所述的任何方法进一步包括纯化异戊二烯。 例如，可以使用标准技术来纯化使用本发明组合物和方法所生产的异戊二 烯。纯化指一种方法，通过该方法将异戊二烯与在生产异戊二烯时存在的 一种或多种组分分离。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体 来获得。纯化方法的实例包括(i)以液体提取物从溶液蒸馏和(ii)色谱。 如在此使用，“纯化的异戊二烯”指已经与在生产异戊二烯时存在的一种或 多种组分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是按重量计，至 少约20％不含有在生产异戊二烯时存在的其它组分。在多种实施方式中， 异戊二烯是按重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、 80％、90％、95％、或99％纯的。纯度可以通过任何适当的方法来检测， 例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析。

在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括使异戊二烯聚合。例 如，可以使用标准方法来聚合纯化的异戊二烯以形成顺式聚异戊二烯或使 用标准方法形成其他下游产物。

其它方法和组合物描述于2008年9月15日递交的美国临时专利申请 号61/097,186，2008年9月15日递交的美国临时专利申请号61/097,189， 2008年9月15日递交的美国临时专利申请号61/097,163，它们全部在此 通过整体引用作为参考，特别是对于生产异戊二烯的组合物和方法。

实施例

实施例也描述和详解了上面讨论的本发明的方面和实施方式，但是实 施例旨在仅仅是本发明的示例并且因此不应以任何方式被认为是限定本 发明。除非另有指明，否则温度是摄氏度而压力为大气压或近大气压。前 面的实例和详细说明以说明的方式提供而非限制。所有在这一说明书中引 用的出版物、专利申请和专利都在此通过引用作为参考，就如同每一出版 物、专利申请或专利都具体且单独地引入本文作为参考。特别地，在此引 用的所有出版物出于描述和公开可用于本发明的组合物和方法的目的而 明确地通过引用作为参考。尽管出于清楚理解的目的，较详细地以说明方 式描述了前面的发明，但是对于本领域熟练技术人员来讲显而易见的是， 根据本发明的教导，可以进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精 神或范围。

实施例1、在表达重组野葛异戊二烯合成酶的大肠杆菌中的异戊二烯 生产

I.在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体构建

野葛(葛麻姆(Puerariamontana)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白 序列获自GenBank(AAQ84170)。对于大肠杆菌密码子使用进行优化的 野葛异戊二烯合酶基因购自DNA2.0(SEQIDNO：1)。通过用 BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合 酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrdHis2B (Invitrogen)。设计构建体以便异戊二烯合酶基因终止密码子在PstI位 点的5’。结果是，当表达构建体时，His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白。 对得到的质粒pTrcKudzu通过测序验证(图2和3)。

也将异戊二烯合酶基因克隆到pET16b(Novagen)。这种情形下，异 戊二烯合酶基因插入pET16b以便重组异戊二烯合酶蛋白含有N端His 标签。通过PCR使用引物对pET-His-Kudzu-2F： 5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQID NO：3)和pET-HisKudzu-R： 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ IDNO：4)从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。这些引物分别在基因5’ 端添加NdeI位点和在3’端添加BamH1位点。上述质粒pTrcKudzu用作 模板DNA，根据生产商的指示，使用Herculase聚合酶(Stratagene)， 并且以10pMol的浓度添加引物。在25μl的总体积下进行PCR。PCR产 物用NdeI/BamH1消化并且克隆到用相同酶消化的pET16b中。将连接混 合物转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)并通过测序筛选正确克隆。将 得到的质粒(其中从T7启动子表达野葛异戊二烯合酶基因)命名为 pETNHisKudzu(图4和5)。

也将野葛异戊二烯合酶基因克隆到低拷贝数质粒pCL1920中。使用引 物来从上述pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因。正向引物向5’端添 加HindIII位点和大肠杆菌共有序列RBS。PstI克隆位点已经存在于 pTrcKudzu中，就在终止密码子3’，因此构建反向引物以便最终PCR产 物包括PstI位点。引物序列为：HindIII-rbs-KudzuF： 5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQIDNO：6)和BamH1-KudzuR：

5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQIDNO：4)。使用Herculase聚合酶，以10pmol引物浓度引物和 1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增方案包括30个循环的 (95℃持续1分钟，60℃持续1分钟，72℃持续2分钟)。产物用HindIII 和PstI消化并连接到也用HindIII和PstI消化的pCL1920。连接混合物 转化大肠杆菌Top10。通过测序检测若干转化体。得到的质粒命名为 pCL-lac-Kudzu(图6和7)。

II.异戊二烯生产的测定

对于摇瓶培养，将来自摇瓶的1ml培养物转入20mlCTC顶空瓶 (Agilent瓶目录#51882753；盖目录/I51882759)。拧紧盖并在相同温度 下孵育瓶，以250rpm振荡。30分钟后，从培养箱中取出瓶并按下述分析 (对于这一检测法的一些实验数值参见表1)。

在测量了发酵罐中的异戊二烯生产的情形下，从发酵罐的废气取样并 按下述直接进行分析(对于这一检测法的一些实验数值参见表2)。

使用与CTCAnalytics(Switzerland)CombiPAL自动进样器接口的 Agilent6890GC/MS系统，在顶空模式下进行分析。使用AgilentHP-5M5 GC/MS柱(30mx0.25mm；0.25pm膜厚)分离分析物。设定取样器以 注射500μL顶空气体。GC/MS法利用氦气作为载气，流速为1ml/分钟。 注射口保持在250℃，分流比为50∶1。在分析期间，烘箱温度保持在37℃ 持续2分钟。Agilent5793N质量选择检测器在m/z67，以单离子监测(SIM) 模式允许。从1.4至1.7分钟，关掉监测器以允许洗脱永久气体。在这些条 件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在1.78分钟洗脱。使用校准 表来量化异戊二烯绝对量并且发现在1μg/L至200μg/L为线性的。预计使 用这一方法的检测极限为50至100ng/L。

III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中的异戊二 烯生产

将上述载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以生产菌株 BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。在LA (Luria琼脂)和羧苄青霉素(50μg/ml)上涂布菌株用于分离并且在37℃ 过夜培养。将单菌落接种到含有20mlLuriaBertani培养基(LB)和羧苄 青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中。培养物在20℃以200rpm 振荡过夜生长。测量过夜培养物的OD600并将培养物稀释到含有30ml MagicMedia(Invitrogen)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的 摇瓶中至OD600～0.5。在30℃以200rpm振荡培养培养物。当OD600～0.5-0.8 时，加入400μMIPTG并将细胞在30℃以200rpm振荡再培养6小时。在 用IPTG诱导后0、2、4和6小时后，收集1ml培养物等分试样，测定 OD600并且按上述测量生产的异戊二烯的量。结果如图8所示。

IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯

从补料分批培养测定由含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌 大规模生产异戊二烯。每升发酵培养基的发酵培养基(TM2)的配方如下： K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g， 柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良的微量 金属溶液(ModifiedTraceMetalSolution)1ml。所有组分一起添加并溶 解在diH2O中。用氢氧化钾(KOH)调节pH至6.8并定容至体积。终产 物用0.22μ过滤器过滤灭菌(只此，不高压灭菌)。1000X改良的微量金 属溶液的配方如下：柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g， FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100 mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一 种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积 并用0.22μ过滤器过滤灭菌。

这一实验在14L生物反应器中进行以监控在想要的发酵、pH6.7和温 度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基 中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。当接种物 生长至OD550＝0.6后，将2个600ml烧瓶离心并将内容物在70ml上清液中 重悬浮以将细胞沉淀(70ml的OD3.1材料)转入生物反应器。接种后不 同时间下，取出样品并按上述测定所生产的异戊二烯的量。结果如图9所 示。

实施例2、在表达重组杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中的异戊二烯生产

杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(Schnitzler，J-P 等人，(2005)Flanta222：777-786)获自GenBank(CAC35696)。对于大 肠杆菌进行密码子优化的基因购自DNA2.0(p9796-杨，图30和31)。通过 用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯 合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrcHis2B (Invitrogen)。克隆构建体以便插入片段中的终止密码子在PstI位点之 前，这得到His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白的构建体。对得到的质粒 pTrcPoplar(图32和33)进行测序验证。

实施例3、在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中的异戊二烯生 产

将在实施例1所述的pTrcKudzu和pCL-lacKudzu质粒电穿孔到柠 檬泛菌(美国专利号7,241,587)。在分别含有羧苄青霉素(200μg/ml) 或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。按实施例1对于表达重组 野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株所述进行从摇瓶生产异戊二烯并测定 所生产的异戊二烯的量。结果如图10所示。

实施例4、在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生 产

I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌复制质粒的构建

使用在aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性表达盒的 pBS19)，在枯草杆菌aprEnprEPxylcomK菌株(BG3594comK)中表达 野葛异戊二烯合酶基因。使用PCR分别扩增异戊二烯合酶基因、aprE启 动子和转录终止子并融合。然后将构建体克隆到pBS19中并转化到枯草杆 菌。

a)aprE启动子的扩增

使用下面的引物，从枯草杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子：

CF797(+)起始aprE启动子MfeI

5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：58)

CF07-43(-)与野葛ispS融合的aprE启动子

5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQIDNO：59)

b)异戊二烯合酶基因的扩增

从质粒pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因(SEQIDNO：2)。该 基因对于大肠杆菌进行了密码子优化并通过DNA2.0合成。使用下面的引 物：

CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密 码子)融合

5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：60)

CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶基因的3’端与终止子融合

5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)

c)转录终止子的扩增

使用下面的引物，从以前测序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆 菌(Bacillusamyliquefaciens)的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：

CF07-44(+)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合

5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQIDNO：62)

CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)

5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)

使用下述引物进行PCR将野葛片段与终止子片段融合：

CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因融合(GTG起 始密码子)

5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：61)

CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)

5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)

使用下述引物进行PCR将野葛终止子片段与启动子片段融合：

CF797(+)起始aprE启动子MfeI

5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：64)

CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)

5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)

使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并用限制性酶MfeI和BamHI 消化。这一消化的DNA片段用Qiagen试剂盒进行凝胶纯化并连接至称作 pBS19的载体，该载体已经用EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。

将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞，并且在LA和50羧苄青 霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50羧苄青霉素中过夜生 长，然后用Qiagen试剂盒分离质粒。质粒用EcoRI和BamHI消化以检测 插入片段并且将3个正确的质粒送去以下面的引物进行测序：

CF149(+)aprE启动子的EcoRI起点

5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：65)

CF847(+)pXX049的序列(aprE启动子末端)

5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQIDNO：66)

CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合

5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)

CF07-48(+)野葛异戊二烯合酶的测序引物

5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQIDNO：67)

CF07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序

5’-GGCGAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQIDNO：68)

通过测序发现名为pBSKudzu#2的质粒是正确的(图52和12)并且 将它转化到枯草杆菌宿主菌株BG3594comK。在LA和5个氯霉素板上 进行筛选。选择转化体并且在LA和5个氯霉素上挑选单菌落，然后在LB 和5氯霉素中生长至其达到OD600为1.5。在甘油存在下，将其冻存在-80℃ 的瓶中。得到的菌株命名为CF443。

II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌细胞的摇瓶中的异戊二 烯生产

用来自LA和氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF443单菌落接种过夜培养 物。培养物在37℃下在LB和Cm中以200rpm摇动生长。使用这些过夜 培养物(1ml)接种含有25mlGrantsII培养基和终浓度为25μg/ml的氯 霉素的250ml带挡板的摇瓶。GrantsII培养基配方为10g大豆胨，3ml1M K2HPO4，75g葡萄糖，3.6g尿素，100ml的10xMOPS，用H2O定容至 1L，pH7.2；10XMOPS配方为83.72gMOPS，7.17gtricine，12gKOH 颗粒，10ml0.276MK2SO4溶液，10ml0.528MMgCl2溶液，29.22gNaCl， 100ml的100x微量营养物，用H2O定容至1L；以及100X微量营养物 的配方为1.47gCaCl2＊2H2O，0.4gFeSO4＊7H2O，0.1gMnSO4＊H2O，0.1 gZnSO4＊H2O，0.05gCuCl2＊2H2O，0.1gCoCl2＊6H2O，0.1g Na2MoO4＊2H2O，用H2O定容至1L。在37℃孵育摇瓶并在18、24和44 小时取样。在18小时时，对CF443和对照菌株顶空取样。这表示18小 时异戊二烯累积。异戊二烯的量通过如实施例1所述的气相色谱来测定。 通过表达重组异戊二烯合酶，异戊二烯的生产显著增强(图11)。

III.在14L发酵中由CF443生产异戊二烯

由补料-分批培养测定由在复制质粒上含有重组野葛异戊二烯合酶基 因的枯草杆菌进行的大规模异戊二烯生产。通过常规补料-分批发酵在含有 大豆粉(Cargill)、磷酸钠和磷酸钾、硫酸镁和柠檬酸、氯化铁和氯化镁 溶液的营养培养基中培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用包括 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物将培养基浸软90分钟(参见 W095/04134)。向14-L分批发酵罐加料60％wt/wt葡萄糖(CargillDE99 葡萄糖，ADMVersadexgreens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油 (WesternFamily豆油，其中99％wt/wt是它加入细胞培养基之前的油浓 度)。当检测不到批次中的葡萄糖时，开始补料。补料速率在几小时内增 加并且被调整以在相等的碳基础上添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH 控制在6.8-7.4。在起泡情形下，向培养基中加入消泡剂。将发酵温度控制 在37℃并且以750rpm搅拌发酵培养物。贯穿整个过程，对诸如pH、DO％、 气流和压力的多种其它参数进行监控。DO％保持高于20。在36小时的时 间进程中取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯生产。这些实验的结果 如图53A和53B所示。

IV.在枯草杆菌中野葛异戊二烯合酶(ispS)的整合

将野葛异戊二烯合酶基因克隆到在aprE启动子控制下的整合质粒 (pJH101-cmpR)中。在检测条件下，未检测到异戊二烯。

实施例5、在木霉中的异戊二烯生产

I.在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建

通过DNA2.0合成解脂耶氏酵母菌密码子优化的野葛IS基因(SEQID NO：8)(图13)。这一质粒用作下面PCR扩增反应的模板：1μl质粒模 板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10uM) 5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQIDNO：9)，1μl引物EL-965(10uM) 5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQIDNO：10)，1 μldNTP(10mM)，5μl10xPfuUltraII融合HSDNA聚合酶缓冲液，1 μlPfuUltraII融合HSDNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向 引物在5’端含有额外的4个核苷酸，这4个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码 子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但为克隆到pENTR/D-TOPO载体 所需的。反向引物在5’端含有额外的21个核苷酸，这21个核苷酸不与解 脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但被插入以克隆到 其它载体骨架。使用MJResearchPTC-200热循环仪，按下面进行PCR 反应：95℃持续2分钟(仅仅是首个循环)，95℃持续30秒，55℃持续 30秒，72℃持续30秒(重复27个循环)，最后一个循环后于72℃持续1 分钟。在1.2％E-gel上分析PCR产物以确认解脂耶氏酵母密码子优化的 野葛异戊二烯合酶基因的成功扩增。

然后使用TOPOpENTR/D-TOPO克隆试剂盒，按照生产商说明克隆 PCR产物：1μlPCR反应物，1μl盐溶液，1μlTOPOpENTR/D-TOPO 载体和3μl水，总反应体积为6μl。在室温孵育反应物5分钟。将1微升 TOPO反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml 卡那霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB 和50μg/ml卡那霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使用 QIAprepSpinMiniprepKit，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。 对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。

编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单个 pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆到定制的pTrex3g载体。pTrex3g 的构建描述于WO2005/001036A2。按照制造商对于GatewayLRClonase IIEnzymeMixKit(Invitrogen)的说明进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码 子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μlpTrex3g 目的载体，6μlTE缓冲液，pH8.0，总反应体积为8μl。反应物在室温孵 育1小时然后加入1μl蛋白酶K溶液并继续在37℃孵育10分钟。然后将 1μl反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml羧 苄青霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB 和50μg/ml羧苄青霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使 用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen，Inc.)，按照生产商说明从过夜培 养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。

使用BiolisticPDS-1000/HEParticleDeliverySystem进行解脂耶氏酵 母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向四缺失的里氏 木霉的生物射弹转化(参见WO2005/001036A2)。使用专利公开WO 2005/001036A2的实施例11所列方法进行稳定转化体的分离和摇瓶评估。

II.在里氏木霉重组菌株中的异戊二烯生产

将1ml上述异戊二烯合酶转化体的15和36小时龄培养物转入顶空 瓶。密封瓶并在30℃孵育5小时。测量顶空气体并且通过实施例1所述的 方法鉴定异戊二烯。两个转化体显示出痕量异戊二烯。异戊二烯的量可通 过14小时的孵育而增加。两个阳性样品在14小时的孵育后显示出异戊二 烯水平为约0.5μg/L。未转化的对照没显示出可检测的异戊二烯水平。这 一实验表明当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异 戊二烯。

实施例6、在耶氏酵母中的异戊二烯生产

I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建

用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体构建的起 点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。这一载体的完整序列(SEQIDNo：11) 如图15所示。

使用解脂耶氏酵母菌株GICC120285的染色体DNA作为模板，通过 PCR扩增下面的片段：无启动子形式的URA3基因，18S核糖体RNA基 因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及含有XPR2和ICL 1基因的启动子的两种DNA片段。使用下面的PCR引物：

ICL13

5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQ IDNO：69)

ICL15

5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQIDNO：70)

XPR3

5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQIDNO：71)

XPR5

5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQIDNO：72)

XPRT3

5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQIDNO：73)

XPRT5

5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQIDNO：74)

Y18S3

5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQIDNO：75)

Y18S5

5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQIDNO：76)

YURA3

5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQIDNO：77)

YURA50

5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQIDNO：78)

YURA51

5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQIDNO：79)

对于PCR扩增，按照生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶 (Stratagene)，生产商提供的缓冲液和dNTPs，2.5μM引物和所示的模 板DNA。使用下面的循环进行扩增：95℃持续1min；34x(95℃持续30sec； 55℃持续30sec；72℃持续3min)和72℃持续10min，随后4℃孵育。

对于在耶氏酵母中表达进行密码子优化的编码野葛异戊二烯合酶基 因的合成DNA分子得自DNA2.0(图16；SEQIDNO：12)。图18显示 了携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基 因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的构建方案的全部细节。也构建 了对照质粒，其中插入交配因子基因(MAP29)代替异戊二烯合酶基因(图 18E和18F)。

类似的克隆方法可以用于表达杨(PopulusalbaxPopulustremula)异 戊二烯合酶基因。杨异戊二烯的序列描述于MillerB.等人，(2001)Planta 213，483-487并且示出于图17(SEQIDNO：13)。图18A和B显示了产 生携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的杨异戊二烯合酶基因 的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建方案。

II.由解脂耶氏酵母重组菌株生产异戊二烯

载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)用 SacII消化并通过标准醋酸锂/聚乙二醇方法转化菌株解脂耶氏酵母 CLIB122以得到尿苷原养型。简言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取 物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中过夜生长，通过离心(4000rpm，10mm) 收集，用无菌水冲洗并悬浮在0.1M醋酸锂，pH6.0中。将200μl等份细 胞悬浮液与线性化质粒DNA溶液(10-20μg)混合，室温孵育10分钟并 与1ml在相同缓冲液中的50％的PEG4000混合。进一步在室温孵育悬浮 液1小时，随后在42℃热激2分钟。然后将细胞接种在SChisleu平板 (0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，各100mg/L亮氨酸和组氨酸)上。在30℃ 孵育3-4天后出现转化体。

将三个来自pYLA(KZ1)转化的分离菌，三个来自pYLI(KZ1)转化的 分离菌，两个来自pYLA(MAP29)转化的分离菌以及两个来自 pYLI(MAP29)转化的分离菌在30℃于YEP7培养基(1％酵母提取物，2％ 蛋白胨，pH7.0)中振荡生长24小时。通过离心收集来自10ml培养物的 细胞，在3ml新鲜YEP7中重悬浮并放入15ml螺口盖瓶。将瓶在室温温 和(60rpm)振荡过夜培养。通过气相色谱使用如实施例1所述的质谱检 测器分析这些瓶的顶空中异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获 得的所有转化体产生可容易检测量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。 在携带植酸酶基因而不是异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中没有检 测到异戊二烯。

实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大 肠杆菌中生产异戊二烯

I.构建编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs用于在大 肠杆菌中生产异戊二烯的载体

i)构建pTrcKudzuKan

用赋予卡那霉素抗性的基因代替pTrcKudzu(实施例1所述)的bla 基因。为了除去bla基因，pTrcKudzu用BspHI消化，用虾碱性磷酸酶(SAP) 处理，在65℃热处死，然后用Klenow片段和dNTPs末端填平。从琼脂糖 凝胶纯化5kbp大片段并将它连接到kanr基因，其已经使用引物MCM22 5’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQIDNO：14)和 MCM235’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ IDNO：15)从pCR-Blunt-II-TOPO进行PCR扩增，用HindIII和PvuI 消化并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选携带有赋予 卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。

ii)构建pTrcKudzuyIDIKan

pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。 其通过合成RBS连接到编码来自酿酒酵母的idi的PCR产物。PCR的引 物为NsiI-YIDI1F 5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ IDNO：16)和PstIYIDI1R5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQIDNO：17)；以及模板是酿酒酵母基因组DNA。PCR产物用NsiI 和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。连接混合物转化到化学感受态TOP 10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序， 将得到的质粒称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35)。

iii)构建pTrcKudzuDXSKan

质粒pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶 纯化。其通过合成RBS连接到编码来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。PCR 的引物为MCM13 5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTG ATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO：18)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO：19)； 以及模板是大肠杆菌基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接 前进行凝胶纯化。将所得的转化反应物转化到TOP10细胞并在含有50 μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称 作pTrcKudzuDXS(kan)(图36和37)。

iv)构建pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)

pTrcKudzu-yIDI(kan)用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝 胶纯化。其通过合成的RBS连接到编码大肠杆菌dxs的PCR产物(引物 MCM13

5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTG ATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO：18)和MCM14

5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO：19)， 模板TOP10细胞)，该产物以及用NsiI和PstI消化并凝胶纯化。最终 质粒称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。

v)构建pCLPtrcKudzu

使用SspI从pTrcKudzu消化来自上述实施例1的含有启动子、结构 基因和终止子的DNA片段并凝胶纯化。其连接至已经用PvuII消化，用 SAP处理以及热处死的pCL1920。得到的连接混合物转化TOP10细胞并 在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，选择两个 克隆。pCLPtrcKudzu和pCLPtrcKudzu(A3)具有相反方向的插入片段

(图38-41)。

vi)pCLPtrcKudzuyIDI的构建

来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的IDIPCR扩增子连接 到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu。连接混 合物转化到TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离 若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuyIDI(图42和43)。

vii)pCLPtrcKudzuDXS的构建

来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的DXSPCR扩增子连 接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu(A3)。 连接混合物转化得TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。 分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuDXS(图44和45)。

II.在来自以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶，idi，和/或dxs的培 养物的顶空中的异戊二烯测量

在LB卡那霉素50μg/mL上生长之前转化有质粒pTrcKudzu(kan) (A)、pTrcKudzu-yIDIkan(B)、pTrcKudzu-DXSkan(C)、 pTrcKudzu-yIDIDXSkan(D)的大肠杆菌BL21(λDE3)培养物。在LB壮观 霉素50μg/mL上生长pCLPtrcKudzu(E)、pCLPtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)的培养物。培养物在时间0 用400μMIPTG诱导(OD600接近0.5)并且取样用于异戊二烯顶空测量 (参见实施例1)。结果如图23A-23G所示。

将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)通过转化导入大肠杆菌菌株BL21。 得到的菌株BL21/pTrcKudzuIDIDXS在20℃下于含有卡那霉素(50 μg/ml)的LB中过夜生长并用于接种含1％葡萄糖的TM3(13.6gK2PO4， 13.6gKH2PO4，2.0gMgSO4＊7H2O，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁 铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml1000x改良的微量金属溶 液(ModifedTraceMetalSolution)，调节至pH6.8并用H2O定容，并灭菌 过滤)培养瓶。培养瓶在30℃孵育直到OD600达到0.8，然后用400μMIPTG 诱导。在诱导后多个时间取样并按实施例1所述测量顶空中的异戊二烯的 量。结果如图23H所示。

III.在大肠杆菌/pTrcKudzuyIDIDXS中从生物量生产异戊二烯

检测菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物量：甘蔗渣、 玉米秸秆和软材木浆产生异戊二烯的能力，以葡萄糖为对照。生物量的水 解物由酶促水解来制备(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准检测法 Lap-009“EnzymaticSaccharificationofLignocellulosicBiomass”)并且根 据葡萄糖当量以稀释液使用。这一实例中，葡萄糖当量等于1％葡萄糖。 使用来自新鲜的转化细胞BL21(DE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的平板 的单菌落来接种5ml的LB加卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵 育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料 中稀释至OD600为0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣或软材木浆。葡萄糖用 作阳性对照而没有葡萄糖用作阴性对照。在30℃以180rpm振荡孵育培养 物。监测培养物的OD600并且当它达到OD600为～0.8时，在1和3小时按 实施例1所述分析培养物的异戊二烯生产。培养物未被诱导。所有含有添 加的原料的培养物产生的异戊二烯与由葡萄糖阳性对照所产生的异戊二 烯相等。实验以一式两份进行并且示出于图46。

IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯

使用来自新鲜的转化细胞BL21(λDE3)/pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的 平板的单菌落来接种5ml的LB和卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振 荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％ 原料中稀释至OD600为0.05。原料是葡萄糖、转化葡萄糖或玉米秸秆。转 化糖原料(DaniscoInvertSugar)通过酶处理蔗糖糖浆来制备。AFEX玉 米秸秆按下述(第V部分)制备。细胞在30℃生长并且当培养物达到OD600为～0.8-1.0(0小时)时，测量第一个样品。按由OD600所测来分析培养物 的生长以及按照实施例1，在0、1和3小时分析异戊二烯生产。结果如图 47所示。

V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物

AFEX预处理的玉米秸秆获自MichiganBiotechnologyInstitute。预处 理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX 预处理的玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理的玉米秸秆中 的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。糖化工艺 如下：将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液， pH4.8，2.25ml的Accellerase1000，0.1ml的GrindamylH121(来自用 于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)，以及72.65ml的DI 水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。从 摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l的葡萄糖，21.8g/l 的木糖，和10.3g/l的葡萄糖和/或木糖寡聚物。

VI.酵母提取物对在补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯生产 的影响

以14-L规模按前面所述，用含有上述pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大 肠杆菌细胞进行发酵。以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer， Montreal，Quebec，Canada)。在40小时发酵期间，送至发酵罐中的酵母 提取物的总量在70-830之间变化。在550nm波长测量发酵液的光密度。 发酵罐中的最终光密度与所添加的酵母提取物的量成比例(图48A)。按 前述测定发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随发酵进程增 加(图48B)。所生产的异戊二烯的量与喂饲的酵母提取物的量成线性比 例(图48C)。

VII.在pTrcKudzuDXSyIDI的500-L发酵中生产异戊二烯

使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI以及大肠杆菌DXS核酸(大 肠杆菌BL21(λDE3)pTrcKudzudxsyidi)的大肠杆菌细胞的500升发酵 来生产异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变 化。在平均异戊二烯浓度的基础上，通过装置的平均流量以及异戊二烯漏 出的程度，收集的异戊二烯的量被计算为接近17g。

VIII.在补料分批培养中生长的大肠杆菌的500L发酵中的异戊二烯 生产

培养基配方(每升发酵培养基)：

K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3 g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添 加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氨气(NH3)调节pH至 7.0并定容至体积。灭菌以及调节pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl 0.1g以及抗生素。

1000X改良的微量金属溶液：

柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g， CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100 mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DIH2O中溶解一种组分来溶解每 一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过 滤器过滤灭菌。

在500-L生物反应器中，用含有pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大肠杆 菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃ 下从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖 培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物。当接种物生长至在 550nm处测量的OD为0.15后，使用20ml接种含有2.5-L大豆胨-酵母提 取物-葡萄糖培养基的生物反应器。该2.5-L生物反应器在30℃下生长至 OD1.0并将2.0-L转入500-L生物反应器。

以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer，Montreal，Quebec， Canada)和葡萄糖。在50小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖和酵 母提取物的总量分别为181.2kg和17.6kg。图49A显示了生物反应器中 随着时间的光密度。按前述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异 戊二烯滴定度随着发酵进程而增加(图49B)。在50小时发酵期间产生的 异戊二烯总量为55.1g并且生产的时间进程如图49C所示。

实施例8、在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠 杆菌中生产异戊二烯

I.下游MVA途径的克隆

克隆下游甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体 DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的四种基因；甲羟戊酸激酶(MVK)， 磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯 二磷酸异构酶基因并且分别克隆到pCRBluntIITOPO质粒(Invitrogen)。 在一些情形下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。设计引物使得在5’ 端起始密码子上游8bp处插入大肠杆菌共有序列RBS(AGGAGGT(SEQ IDNO：80)或AAGGAGG(SEQIDNO：81))以及在3’端添加PstI位点。 然后一个接一个地将这些基因克隆到pTrcHis2B载体直到组装了整个途 径。

酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC204508D)。使 用PfuTurbo按照生产商的说明书，用引物MVKF (5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC， SEQIDNO：21)和MVK-Pstl-R (5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGG TAAATTCGTG，SEQIDNO：22)从酿酒酵母染色体扩增MVK基因。通 过1.2％E-gel(Invitrogen)电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)并 将其克隆pZeroBLUNTTOPO。将得到的质粒称作pMVK1。用SacI和 Taq1限制性内切核酸酶消化质粒pMVK1并对片段凝胶纯化并连接到用 SacI和BsIBI消化的pTrcHis2B。将得到的质粒命名为pTrcMVK1。

使用引物PstI-PMK1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC， SEQIDNO：23)和BsiHXAI-PMK1F (5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG， SEQIDNO：24)，通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二种基因 PMK。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)按照生产商的说明书进行PCR 反应。将正确大小的产物(1387bp)用PstI和BsiHKI消化并连接到用 PstI消化了的pTrcMVK1中。将得到的质粒命名为pTrcKK。以相同方式 克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD1R (5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQIDNO：25)和 NsiI-MVD1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG， SEQIDNO：26)进行PCR以扩增MVD基因，并且使用引物对PstI-YIDI 1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQIDNO：27)和 NsiI-YIDI1F (5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQ IDNO：28)扩增yIDI基因。在一些情形下，使用来自大肠杆菌的IPP异 构酶基因，idi。为了扩增来自大肠杆菌染色体DNA的idi，使用下面的引 物对：PstI-CIDI1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQ IDNO：29)和NsiI-CIDI1F (5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQID NO：30)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA (WO96/35796和WO2004/033646，其各在此通过整体引用作为参考， 特别是对于核酸的分离)。最终的质粒命名为pKKDIy用于编码酵母idi 基因的构建体或者命名为pKKDIc用于编码大肠杆菌idi基因的构建体。 将质粒转化到大肠杆菌宿主BL21用于随后分析。在一些情形下，将来自 野葛的异戊二烯合酶克隆到pKKDIy，产生质粒pKKDIyIS。

也将下游MVA途径克隆到含有卡那霉素抗生素抗性标记的pTrc。用 限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％琼脂糖E-gel 上分离5930bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照制造商的 说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化在实施例7中描 述的质粒pTrcKudzuKan，使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E- 凝胶纯化3338bp含有载体的片段。使用RocheQuickLigation试剂盒连 接该3338bp载体片段和5930bp下游MVA途径片段。将连接混合物转 化到大肠杆菌TOP10细胞并将转化体在37℃下过夜生长，用含有卡那霉 素(50μg/ml)的LA筛选。转化体通过限制性酶消化验证并将1个冷冻作 为原种。质粒命名为pTrcKanKKDIy。

II.野葛异戊二烯合酶基因在pTrcKanKKDIy中的克隆 使用引物MCM50 5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCG ACCTCTTCTCAATTTACT(SEQIDNO：31)和MCM53 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ IDNO：32)，通过PCR从实施例1所述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯 合酶基因。将得到的PCR片段克隆到pCR2.1中并转化大肠杆菌TOP10。 这一片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列以及含有大肠杆菌RBS的上 游区。转化体在37℃下过夜孵育，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上 筛选。通过测序验证正确的片段插入并将这一菌株命名为MCM93。

用限制性内切核酸酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒以释 放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp插入片段。在1.2％琼脂糖E-gel 上分离该1724bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照生产商的 说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy， 在37℃用SAP处理30分钟并使用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化。使 用RocheQuickLigation试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA 片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP10细胞并且将转化体在37℃下 过夜生长，在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。通过限制性酶切验证 正确的转化体并且将质粒命名为pTrcKKDyIkISKan(图24和25)。将 这一质粒转化得BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。

III.在表达重组下游甲羟戊酸途径以及来自野葛的异戊二烯合酶的大 肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯

在MOPS培养基中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan(Neidhardt 等人，(1974)J.Bacteriology119：736-747)，调节至pH7.1并补充0.5％葡 萄糖和0.5％甲羟戊酸。使用相同的条件只是不添加0.5％甲羟戊酸来建立 对照培养。培养从用1％接种物的过夜种子培养物开始并且当培养物达到 OD600为0.3至0.5时用500μMIPTG诱导。在30℃以250rpm振荡生长 培养物。在使用实施例1所述的顶空测定法诱导3小时后分析异戊二烯生 产。异戊二烯的最大产量为6.67x104nmol/L培养液/OD600/hr，其中L培养液是 培养液的体积并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。没有补充甲羟戊 酸的对照培养物没有产生可测量的异戊二烯。

IV.上游MVA途径的克隆

从粪肠球菌克隆包括两个编码三种酶促活性的基因的上游甲羟戊酸 生物合成途径。mvaE基因编码一种蛋白质，该蛋白质具有在该途径中的 第一和第三蛋白质乙酰-CoA乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA (HMG-CoA)还原酶的酶促活性，并且mvaS基因编码该途径中第二种 酶HMG-CoA合酶。使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)扩增mvaE基因，该基因前面为大肠杆菌核糖体结合位点和间 隔区。

CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI起点

5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ IDNO：34)

CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS

5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQIDNO：35)

使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增 mvaS基因，该基因前面为大肠杆菌RBS和间隔区：

CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS

5’- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQIDNO：36)C

F07-102(-)mvaS基因BglII末端

5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)。

使用下面的引物，用PCR将PCR片段融合在一起：

CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI的起点

5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ IDNO：34)

CF07-102(-)mvaS基因BggII末端

5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)

融合PCR片段用Qiagen试剂盒纯化并用限制性内切酶SacI和BglII 消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并将它连接 到可商购的载体pTrcHis2A，该载体已经用SacI和BglII消化以及凝胶纯 化。

将连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞并且在LA和50μg/ml羧苄 青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50μg/ml羧苄青霉素 中过夜生长并使用Qiagen试剂盒分离质粒。用SacI和BglII消化质粒以 检验插入片段并且用下面的引物对一个正确的质粒进行测序：

CF07-58(+)mvaE基因的起点

5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)

CF07-59(-)mvaE基因的末端

5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)

CF07-82(+)mvaS基因起点

5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)

CF07-83(-)mvaS基因末端

5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)

CF07-86(+)mvaE中的序列

5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)

CF07-87(+)mvaE中的序列

5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)

CF07-88(+)mvaE中的序列

5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)

CF07-89(+)序列mvaS

5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)

通过测序确认命名为pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的并 将其转化到可商购的大肠杆菌菌株BL21中。在LA和50μg/ml羧苄青霉 素上进行筛选。选择两个转化体并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中生长至 它们达到OD600为1.5。在甘油存在下，将两个菌株在-80℃下在瓶中冷冻。 对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#l，分离菌#1，将菌株命名为CF 449，对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#1，分离菌#2，命名为CF 450。发现两个克隆在分析时表现相同。

V.UpperMVA途径在pCL1920中的克隆

用限制性内切核酸酶SspI消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放 含有pTrc-mvaE-mvaS-(His-标签)-终止子的片段。在这一片段中，his-标签 并未被翻译。使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化这一 平末端4.5kbp片段。通过用限制性内切核酸酶PvuII消化载体，用SAP 处理并使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化而从pCL 1920制备去磷酸化的平末端4.2kbp片段。使用RocheQuickLigationKit 连接两个片段并将它转化到TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50 μg/ml)的LA上筛选转化体。通过利用PCR筛选插入片段的存在来鉴定 正确菌落。将质粒命名为pCLPtrcUpperPathway(图26和27)。

VI.表达组合的上和下游甲羟戊酸途径的菌株

为了获得具有完整的甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的菌株，将质 粒pTrcKXDylkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化到BL21(λDE3) 感受态细胞(Invitrogen)中并且在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素 (50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过质粒制备来检查转化体以确保两 种质粒都保留在宿主中。菌株命名为MCM127。

VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸

将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/ppTrcHis2A-mvaE/mvaS的 单菌落接种到LB和羧苄青霉素(100μg/ml)中并在37℃以200rpm振荡 过夜生长。在250ml带挡板培养瓶中将这些培养物稀释到50ml培养基中 至OD600为0.1。培养基为TM3，1或2％葡萄糖，羧苄青霉素(100ug/ml) 或者TM3，1％葡萄糖，水解豆油，和羧苄青霉素(100ug/ml)或者TM3 和生物量(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm 振荡生长约2-3小时至达到OD600为0.4。在该点，通过添加IPTG(400μM) 来诱导从mvaEmvaS构建体的表达。进一步培育培养物20或40小时，以 2小时间隔取样至诱导后6小时，然后按需要在24、36和48小时取样。 通过取出1ml培养物完成取样，测量OD600，在微量离心机中沉淀细胞， 除去上清液并分析它的甲羟戊酸。

用TM3培养基和2％葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌 AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠 杆菌细胞的14升发酵产生22克甲羟戊酸。用LB培养基和1％葡萄糖作 为细胞培养基，这些细胞的摇瓶产生2-4克甲羟戊酸/升。这些菌株中的甲 羟戊酸生产表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。

VIII.从含有上和下游MVA途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌 BL21生产异戊二烯

通过将含有上和下游MVA途径以及上述野葛异戊二烯合酶基因的质 粒与含有实施例7所述的idi、dxs、和dxr以及异戊二烯合酶基因的质粒 的多种组合来转化而产生下面的菌株。所用宿主细胞为化学感受态BL21 (λDE3)并且通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那 霉素加壮观霉素(浓度均为50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。在37℃培 养平板。得到的菌株按下面命名：

在卡那霉素加壮观霉素(各50μg/ml)上生长

MCM127-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcKKDyIkIS (kan)

MCM131-BL21(λDE3)中的pCL1920和pTrcKKDyIkIS(kan)

MCM125-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcHis2B(kan)

在卡那霉素(50μg/ml)上生长

MCM64-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXS(kan)

MCM50-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu(kan)

MCM123-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXSDXR(kan)

上述菌株从冷冻母液在LA和适当抗生素上划线并在37℃过夜生长得 到。每个板的单菌落用来接种摇瓶(25mlLB和适当抗生素)。将培养瓶 在22℃以200rpm振荡过夜孵育。第二天早晨，将培养瓶转入37℃培养 箱并以200rpm再振荡生长4.5小时。将25ml培养物离心以沉淀细胞并 在5mlLB和适当抗生素中重悬细胞。将培养物稀释到25mlLB，％葡萄 糖和适当抗生素中至OD600为0.1。每个菌株建立两个培养瓶，一套用IPTG (800μM)诱导，另一套不诱导。在37℃以250rpm振荡孵育培养物。 一套培养物在1.50小时后诱导(紧接着取样时间点1)。在每个取样时间 点，测量OD600并按实施例1所述测定异戊二烯的量。结果如表3所示。 所生成的异戊二烯的量以特定菌株的峰值生产量来表示。

表3.在大肠杆菌菌株中的异戊二烯生产

ND：未检测到

痕量：存在峰值但不可积分。

IX.甲羟戊酸的分析

甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich (WI，USA)提供，其溶解在水(7.7mL)中作为浆液并用氢氧化钾(7.7mmol) 处理以产生甲羟戊酸的钾盐。向甲羟戊酸的转化通过1HNMR分析来确 认。通过在14,000rpm下离心5分钟除去细胞，随后向900μl的H2O中 添加300μl等份上清液来制备用于HPLC分析的样品。然后添加高氯酸(36 μl的70％溶液)，接着混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000 rpm，5分钟)并将上清液转入HPLC。以相同方式制备甲羟戊酸标准品 (20，10，5，1和0.5g/L)。使用BioRadAminex87-H+柱(300mm×7.0mm) 通过HPLC进行甲羟戊酸(20uL注射体积)的分析，该柱用5mM硫酸 以0.6mL/min洗脱，以折射率(RI)检测。在这些条件下，在18.5分钟 时，甲羟戊酸以内酯形式洗脱。

实施例9、用于整合到枯草杆菌中的上和下游MVA途径的构建

I.在枯草杆菌中上游MVA途径的构建

来自粪肠球菌的上游途径整合到枯草杆菌中处于aprE启动子控制下。 上游途径由两种基因组成：编码AACT和HMGR的mvaE，以及编码 HMGS的mvaS。这两种基因融合在一起，其间有终止密码子，RBS在 mvaS前，并且在aprE启动子控制下。终止子位于mvaE基因后。在mvaE 基因后克隆氯霉素抗性标记并且使用同源性侧翼区进行双交换而在aprE 基因座处整合该构建体。

通过PCR扩增四个DNA片段以便它们含有使得它们通过PCR反应 融合在一起的突出端序列。使用Herculase聚合酶按照生产商说明书进行 PCR扩增。

1：PaprE

CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点

5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)

CF07-94(-)PaprE与mvaE融合

5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQIDNO：83)

模板：枯草杆菌染色体DNA

2：mvaE

CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)

5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)

CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS

5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQIDNO：35)

模板：粪肠杆菌染色体DNA(来自ATCC)

3.mvaS

CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS

5’- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQIDNO：36)

CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合

5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQID NO：85)

模板：粪肠杆菌染色体DNA

4.解淀粉芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶终止子

CF07-123(+)mvaS末端与终止子融合

5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQID NO：86)

CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI末端

5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)

模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA

PCR融合反应

5.mvaE与mvaS融合

CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)

5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)

CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合

5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQID NO：85)

模板：上述#2和3

6.mvaE-mvaS与aprE启动子融合

CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点

5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)

CF07-124(-)mvaS的末端与终止子融合

5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQID NO：85)

模板：上述#1和#4

7.PaprE-mvaE-mvaS与终止子融合

CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点

5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)

CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端

5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)

模板：#4和#6

产物用限制性内切核酸酶PstI/BamHI消化并连接到用PstI/BamHI消 化的pJM102(Perego，M.1993.Integrationalvectorsforgenetic manipulationinBacillussubtilis，p.615-624.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch， 以及R.Losick(编)，Bacillussubtilisandothergram-positivebacteria： biochemistry，physiology，andmoleculargenetics.AmericanSocietyfor Microbiology，Washington，D.C.)。连接物转化到大肠杆菌TOP10化学 感受态细胞并且在含有羧苄青霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通 过测序鉴定正确质粒并命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。纯化 后的质粒DNA转化到枯草杆菌aprEnprEPxyl-comK并且在含有氯霉素 (50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。选择正确菌落并且在含有氯霉素10、 15和25μg/ml的L琼脂顺序平板接种以扩增含有上游途径的表达盒的拷 贝数。

通过在含有1％葡萄糖的LB中生长来检测得到的菌株的甲羟戊酸生 产。通过GC分析培养物的甲羟戊酸生产。

顺序使用这一菌株作为宿主用于下游甲羟戊酸途径的整合。

使用下面的引物来测序上面的多个构建体。

测序引物：

CF07-134(-)aprE启动子PstI的起点

5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)

CF07-58(-)mvaE基因的起点

5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)

CF07-59(-)mvaE基因的末端

5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)

CF07-82(-)mvaS基因的起点

5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)

CF07-83(-)mvaS基因的末端

5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)

CF07-86(-)mvaE中的序列

5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)

CF07-87(-)mvaE中的序列

5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)

CF07-88(-)mvaE中的序列

5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)

CF07-89(-)序列mvaS

5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)

在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上筛选转化体。通过测序确认 一个菌落具有正确的整合，并将该菌落在若干天内平板接种在含有增加浓 度至最终水平为25μg/ml的氯霉素的LA上。这导致含有目的基因的表达 盒的扩增。得到的菌株命名为CF455：pJMupperpathway#lXBacillus subtilisaprEnprEPxylcomK(扩增以在含有氯霉素25μg/ml的LA上生 长)。

II.下游MVA途径在枯草杆菌中的构建

由基因mvkl、pmk、mpd和idi组成的下游MVA途径组合在表达盒 中，该表达盒由来自枯草杆菌染色体的nprE区域的侧翼DNA区域(整合 位点)、aprE启动子、以及壮观霉素抗性标记组成(参见图28和29)。 通过DNA2.0合成这一表达盒并将它整合到含有在aprE基因座处整合上 游MVA途径的枯草杆菌的染色体中。从实施例4所述的复制质粒表达野 葛异戊二烯合酶基因并将它转化到整合有上和下游途径的菌株中。

实施例10、在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯 合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯

I.编码马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)和银白杨异戊二烯 合酶的载体和菌株的构建

(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建

大肠杆菌BL21(Novagen牌，EMDBiosciences，Inc.)是转导有 MCM331P1裂解物(根据Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecular Biology.JohnWileyandSons，Inc.所述的方法制备的裂解物)的受体菌 株。通过将细胞涂布于LAgar和20μg/μl氯霉素上筛选转导子。将板在30℃ 过夜孵育。对转导子的分析显示对照板(水+细胞对照板用于返回以及水 和P1裂解物对照板用于裂解物污染)上没有菌落。

挑取4个转导子并用于接种5mLLBroth和20μg/μl氯霉素。在30℃ 以200rpm振荡过夜生长培养物。为了得到每个转导子的基因组DNA制备 物用于PCR分析，将1.5mL过夜细胞培养物离心。用400μl重悬浮缓冲 液(ResuspensionBuffer)(20mMTris，1mMEDTA，50mMNaCl，pH7.5) 重悬细胞沉淀并加入4μlRNase，无DNase(Roche)。试管在37℃孵育 30分钟，随后加入4μl10％SDS和4μl的10mg/mlProteinaseK母液 (Sigma-Aldrich)。试管在37℃孵育1小时。将细胞裂解物转入2mlPhase LockLightGel管(Eppendorf)并且加入各200μl饱和苯酚pH7.9(Ambion Inc.)和氯仿。充分混合试管并微量离心5分钟。用400μl氯仿进行第二次 萃取并将含水层转入新的离心管中。通过加入1ml的100％乙醇沉淀基因 组DNA并离心5分钟。用1ml70％乙醇冲洗基因组DNA沉淀。除去乙醇 并允许基因组DNA沉淀快速风干。将基因组DNA沉淀用200μlTE重悬 浮。

使用PfuUltraIIDNA聚合酶(Stratagene)以及200ng/μl的基因组 DNA作为模板，按照生产商的方法制备两套不同的PCR反应管。对于第 1套，使用引物MCM130和GBCm-Rev(表4)以保证转导子成功地整 合到attTn7基因座中。第1套的PCR参数为95℃持续2分钟(仅第一个 循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续25秒(重复步骤2-4 持续28个循环)，72℃持续1分钟。对于第2套，使用引物MVDFor和 MVDRev(表4)以确保正确整合gi1.2-KKDyI操纵子。第2套的PCR 参数为95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25 秒，72℃持续10秒(重复步骤2-4持续28个循环)，72℃持续1分钟。 在1.2％E-gel(InvitrogenCorp.)上的PCR扩增子的分析表明所有4个 转导子都是正确的(挑取一个并命名为菌株EWL201)。

ii)菌株EWL204(BL21，环出序列-GI1.2-KKDyI)的构建

使用质粒pCP20按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人， ProcNati.Acad.SciUSA97：6640-6645，2000)所述从菌株环出氯霉素标记。 使用PCR产物在大肠杆菌K-12中进行染色体基因的一步失活(Datsenko 等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在LBroth中生长至对 数中期然后在冰预冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与1μl 的pCP20混合并在2.5伏特和25uFd下使用GenePulserElectroporator (Bio-RadInc.)在2mm杯(InvitrogenCorp.)中对细胞悬浮混合物进行 电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯 管(Sarstedt)。允许在30℃生长细胞1小时来回收它。在LAgar和20μg/μl 氯霉素和50μg/μl羧苄青霉素上筛选转化体并在30℃过夜孵育。第二天， 于30℃下，在10ml的LBroth和50μg/μl羧苄青霉素中生长单个克隆直到 早对数期。然后将生长培养物的温度转至42℃持续2小时。进行一系列稀 释，然后将细胞涂布在LA板(无抗生素筛选)上并在30℃过夜孵育。第 二天，挑取20个菌落并接种到LAgar(无抗生素)以及LA和20μg/μl 氯霉素板上。然后在30℃过夜孵育平板。能够在LA板上生长，但不能在 LA和20μg/μl氯霉素板上生长的细胞被认为环出了氯霉素标记(挑取一个 并命名为菌株EWL204)。

iii)质粒pEWL230(pTrcP.alba)的构建

根据对大肠杆菌表达的密码子优化方法，由DNA2.0Inc.(MenloPark， CA)负责制备编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因。该合 成基因被定制克隆到质粒pET24a(Novagen牌，EMDBiosciences，Inc.) 中并冻干递送(图54、55A和55B)。

按照生产商的方案，使用pET24P.albaHGS作为模板，引物MCM 182和MCM192，以及HerculaseIIFusionDNA聚合酶(Stratagene)， 进行PCR反应来扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)。PCR条件如 下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续20秒， 72℃持续1分钟，重复25个循环，在72℃最终延伸3分钟。

使用QIAquickPCRPurificationKit(QiagenInc.)纯化银白杨异戊二 烯合酶PCR产物

然后在20μl含有1μlBspHI内切核酸酶(NewEnglandBiolabs)以及 2μl10xNEB缓冲液4的反应物中，消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。 反应物在37℃孵育2小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯 化经消化的PCR片段。在20μl含有1μlPstI内切核酸酶(Roche)的反应 物中，用2μl10xBufferH进行第二次限制性消化。反应物在37℃孵育2 小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。 在20μl含有1μlNcoI内切核酸酶(Roche)、1μlPstI内切核酸酶和2μl10x BufferH的反应物中消化质粒pTrcHis2B(InvitrogenCorp.)。反应物在 37℃孵育2小时。使用1.2％E-gel(InvitrogenCorp.)凝胶纯化经消化的 pTrcHis2B载体并使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)提取(图 56)。使用BspHI和NcoI位点的相容性粘性末端，制备含有5μl银白杨 异戊二烯合酶插入片段，2μlpTrc载体，1μlT4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)，2μl10X连接酶缓冲液和10μlddH2O的20μl连接反应物。将 连接混合物在室温孵育40分钟。通过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝 酸纤维素滤膜(Millipore)并在室温下将连接混合物轻轻地放在硝酸纤维 素滤膜上30分钟使连接混合物脱盐。MCM446细胞(参见第II部分)在 LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞 悬浮液与5μl脱盐pTrc银白杨HGS连接混合物混合。使用GenePulser Electroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电 穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管 (Sarstedt)。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LAgar和50μg/μl羧 苄青霉素和10mM甲羟戊酸上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6 个转化体并于30℃下，在5ml的LBroth和50μg/μl羧苄青霉素试管中过 夜生长。使用QIAquickSpinMiniprepKit(Qiagen)对过夜培养物进行 质粒制备。由于使用BL21细胞来繁殖质粒，对生产商标准方法进行用PB Buffer5X和PEBuffer3X冲洗离心柱的修改以实现高质量的质粒DNA。 在20μl反应物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质 粒都是正确的大小并且送至QuintaraBiosciences(Berkeley，CA)，用引 物MCM65、MCM66、EL1000测序(表4)。DNA测序结果显示所有6 个质粒都是正确的。挑取一个并命名质粒为EWL230(图57、58A和58B)。

iv)质粒pEWL244(pTrcP.alba-mMVK)的构建

按照生产商的方法，使用MCM376作为模板(见第v部分)，引物 MCM165和MCM177(见表4)，以及PfuUltraIIFusionDNA聚合酶 (Stratagene)，进行PCR反应来扩增马氏甲烷八叠球菌MVK基因。PCR 条件如下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续 25秒，72℃持续18秒，重复28个循环，在72℃最终延伸1分钟。使用 QIAquickPCRPurificationKit(QiagenInc.，)纯化马氏甲烷八叠球菌 MVKPCR产物。

然后在40μl含有8μl的PCR产物，2μlPmeI内切核酸酶(NewEngland Biolabs)，4μl10xNEB缓冲液4，4μl10xNEBBSA和22μl的ddH2O的 反应物中，消化马氏甲烷八叠球菌MVKPCR产物。反应物在37℃孵育3 小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。 在47μl含有2μlNsiI内切核酸酶(Roche)，4.7μl10x缓冲液H和40μl 的PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的反应物中，进行第二次限 制酶消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消 化的PCR片段并使用QIAquickGelExtractionKit提取。在40μl含有10μl 质粒，2μlPmeI内切核酸酶，4μl10xNEB缓冲液4，4μl10xNEB缓冲液 4，4μl10xNEBBSA和20μl的ddH2O的反应物中，消化质粒EWL230。 反应物在37℃孵育3小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化 经消化的PCR片段。在47μl含有2μlPstI内切核酸酶，4.7μl10x缓冲液 H和40μl的PmeI消化的EWL230线性片段的反应物中，进行第二次限制 性消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消化 的PCR片段并使用QIAquickGelExtractionKit提取(图59)。使用NsiI 和PstI位点的相容性粘性末端，制备含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插 入片段，3μlEWL230质粒，1μlT4DNA连接酶，2μl10X连接缓冲液和6μl ddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在16℃过夜孵育。第二天，通 过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝酸纤维素滤膜并在室温下将连接混 合物轻轻地放在硝酸纤维素滤膜上面30分钟使连接混合物脱盐。MCM446 细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl 细胞悬浮液与5μl脱盐pTrcP.alba-mMVK连接混合物混合。使用Gene PulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物 进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后将细胞转入带金属盖的 14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄 青霉素和5mM甲羟戊酸板上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6 个转化体并于30℃下，在5ml的LB和50μg/μl羧苄青霉素试管中过夜生 长。使用QIAquickSpinMiniprepKit对过夜培养物进行质粒制备。由于 使用BL21细胞来繁殖质粒，向标准生产商方法中加入用PB缓冲液5X和 PE缓冲液3X冲洗旋转柱的修改以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应 物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正 确的大小并且送至QuintaraBiosciences，以用引物MCM65、MCM66、 EL1000、EL1003和EL1006测序(表4)。DNA测序结果表明所有3 个质粒都是正确的。取一个并命名为质粒为EWL244(图60和61A-B)。

v)在pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lower的质粒 MCM376-MVK的构建

使用InvitrogenPlatinumHiFiPCR混合物，用引物MCM161和 MCM162(表4)对来自马氏甲烷八叠球菌古细菌LowerPathway操纵子 的MVKORF(图73A-C)进行PCR扩增。将45uL的PCR混合物与1uL 模板，1uL的10uM各引物，以及2uL水组合。反应循环如下：94℃持 续2:00分钟；94℃持续0:30分钟，55℃持续0:30分钟，和68℃持续1:15 分钟，30个循环；以及随后在72℃持续7:00分钟，并置于4℃至冷却。 按照生产商的方法，将3uL的这一PCR反应物与InvitrogenpET200D质 粒相连。将3uL这一连接物导入InvitrogenTOP10细胞，然后在LA/kan50 上筛选转化体。分离来自转化体的质粒并对插入片段测序，得到MCM376 (图74A-C)。

vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK)的构建

将MCM331细胞(含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸 酶激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体 gi1.2KKDyI)在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。混 合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒EWL244。使用GenePulser Electroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电 穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。 在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和5mM 甲羟戊酸板上筛选转化体并在37℃孵育。选择一个菌落并命名为菌株 EWL251。

vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK，pCLUpperMVA)的构建

将EWL251细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3 次。混合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒MCM82(它是编码粪肠球菌 mvaE和mvaS的pCLPtrcUpperPathway)。使用GenePulser Electroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电 穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。 在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和50μg/μl 壮观霉素板上筛选转化体并在37℃孵育。挑取一个菌落并命名为 EWL256。

表4：引物序列

II.构建具有FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI的MCM442-449：BL21 和BL21(DE3)

I)重组模板的构建

基于FRT-的重组盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗生素 标记环出序列获自GeneBridgesGmbH(Germany)。按照GeneBridges 方法进行使用这些材料的步骤。使用StratageneHerculaseIIFusion试剂 盒，按照生产商方法，使用引物MCM193和MCM195从 FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。50μl反应物循环如下：95℃，2分钟； (95℃，20秒，55℃，20秒，72℃，1分钟)×5，(95℃，20秒，60℃， 20秒，72℃，1分钟)×25；72℃，3分钟，4℃至冷却。通过QiagenPCR 柱，按照制造商方法纯化扩增子并在30uLEB(ElutionBuffer)中洗脱。 在具有1xRocheH缓冲液和0.5uLBSA的20uL反应物中将DNA用 NdeI和PciI消化。在各含有1uL的NdeI，NcoI，和RocheH缓冲液的 10uL反应物中，消化质粒MCM376。在37℃过夜进行反应，然后在Qiagen PCR柱上纯化切下的DNA并在30uL的EB中洗脱。在含有1uL载体， 3uLPCR产物，1uLRocheQuickLigase缓冲液2，5uL缓冲液1以及 1uL连接酶的反应物中，将PCR产物连接到MCM376中。反应在室温进 行3小时然后按照生产商的方法将5uL转化到InvitrogenTOP10细胞。 于37℃在L琼脂(LA)和氯霉素(10ug/mLO)上筛选转化体过夜。

将转化体菌落铺到含氯霉素(30ug/mL)和卡那霉素(50ug/ml)的 LA上用于储存并送至Quintara(Berkeley，CA)测序。发现四个克隆具 有对于插入的启动子的正确序列，该四个克隆中每个在引物MCM195的 “N”处具有四个不同的核苷酸。克隆在5mL含有氯霉素(30ug/mL)和卡 那霉素(50ug/ml)的LB中生长并用于制备质粒DNA。这一质粒再转化 到TOP10细胞并且冷冻菌株：

表5：MCM484-487

MCM484 cmR-gi1.6-MVK(mazei)in pET(克隆A1-3，可变nt A) MCM485 cmR-gi1.0-MVK(mazei)in pET(克隆B4-6，可变nt C) MCM486 cmR-gi1.2-MVK(mazei)in pET(克隆C1-5，可变nt G) MCM487 cmR-gi1.5-MVK(mazei)in pET(克隆C3-3，可变nt T)

ii)重组靶菌株MCM349和MCM441的产生

使用质粒pGB706按照制造商的说明书从菌株MCM331环出氯霉素 抗性(cmR)标记。MCM331细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭 菌水中冲洗3次。将等份的1μlpGB706DNA加入50μl的细胞悬浮物中并 在2.5伏特和25uFd下在2mm杯(InvitrogenCorp.)中对这一混合物进 行电穿孔，随后立即在30℃下在500μl的LB中回收1小时。于30℃下， 在含有四环素(5ug/ml)的LB中筛选转化体。第二天，将一个克隆在30℃ 下在含有四环素(5ug/ml)的LB中生长直到可见的浑浊(OD600～0.5-0.8)。 将这一培养物划线到LB上并在37℃过夜生长。将不能在含有氯霉素(10 ug/mL)的LB或含有四环素(5ug/mL)的LB上生长的克隆冷冻为 MCM348。按上述对质粒MCM356(pRedET羧苄青霉素；GeneBridges) 进行电穿孔并且在30℃下在含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB上筛选转 化体。在30℃下在LB羧苄青霉素(50ug/mL)上生长克隆并冷冻为 MCM349。

通过按上述将质粒MCM356电转化到EWL204中产生菌株 MCM441。

iii)FRT-cmR-FRT-gi1.x-mMVK向MCM349和MCM441中的重组

按照生产商方法，使用质粒MCM484-487作为模板，以引物MCM120 和MCM196和HerculaseIIFusion试剂盒进行PCR扩增。每个模板以0、 1、或3uLDMSO进行三个反应。50μl反应循环如下：95℃，2分钟；(95℃， 20秒，55℃，20秒，72℃，1.5分钟)进行5个循环；(95℃，20秒，60℃， 20秒，72℃，1.5分钟)进行25个循环；72℃，3分钟，4℃过夜。合并来 自给定模板的三个反应物并在QiagenPCR柱上纯化以及在60℃下用30 uL的EB洗脱。在37℃用1uL在1xRocheBufferA中的DpnI消化5uL DNA3小时。然后对过量水微透析这一DNA30分钟。

来自新划线的菌株在5mL含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB中于 30℃生长至OD600为～0.5。加入40mM的L-阿拉伯糖并在37℃孵育培养 物1.5小时。收集细胞并用3uL上述透析的扩增子进行电穿孔，然后在37℃ 下在500uLSOC中回收1.5-3小时。在37℃下，在含有氯霉素(5ug/mL) 的LB板上筛选转化体。

通过PCR筛选卡那霉素抗性克隆的扩增子插入。对来自阳性克隆的 PCR产物测序以验证插入的DNA的序列。扩增子与在MCM441attTn7 处FRT-gi1.2-yKKDyI一致并且348个被FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI 代替(yK和mK指分别来自酿酒酵母和马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激 酶)。

表6A：下列菌株在含氯霉素(5ug/mL)的LB中生长并冷冻

表6B：引物

III.酵母提取物对表达来自甲羟戊酸途径的基因并且以15-L规模在 补料-分批培养中生长的大肠杆菌中异戊二烯生产的影响

培养基配方(每升发酵培养基)：

K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3 g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添 加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH 至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl 0.1g以及抗生素。

1000X改良的微量金属溶液：

柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g， CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100 mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组 分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器 过滤灭菌。

在15-L生物反应器中，用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)和高表达的来自马氏甲 烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二 烯合酶的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望 的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻冷冻瓶的 大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在 550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种15-L生物反应器，使初 始体积达到5-L。

i)在没有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞 (EL256)的异戊二烯生产

以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加 料减少以满足代谢要求。在67小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总 量为3.9kg。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)完成诱导。 当在550nm的光密度(OD550)达到数值9时，IPTG浓度达到102uM。 当OD550达到140时，IPTG浓度升至192uM。图67A显示了生物反应器 中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异 戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为35.6g/L(图 67B)。在67小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为320.6g而生产的 时间进程如图67C所示。如TCER所测量的代谢活性谱如图67D所示。 在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的摩尔产率为17.9％。来自葡萄 糖的异戊二烯的质量百分产率为8.1％。

在具有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞 (EL256)中的异戊二烯生产

以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加 料减少以满足代谢要求。在68小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总 量为7.1kg。发酵期间也加料总计1.06kg的酵母提取物。通过添加IPTG 完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值7时，IPTG浓度达 到208uM。当OD550达到180时，IPTG浓度升至193uM。图68A显示 了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器 的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至最大值 为32.2g/L(图68B)。在68小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为395.5 g而生产的时间进程如图68C所示。图68D示出体积生产率的时间进程并 且示出在23和63小时之间，维持平均速率为1.1g/L/hr。如CER所测量 的代谢活性谱如图68E所示。在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的 摩尔产率为10.3％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产率为5.2％。

IV.在含有甲羟戊酸(MVA)途径和异戊二烯合酶(EWL256)的大 肠杆菌中从不同碳源生产异戊二烯

培养基配方(每升发酵培养基)：

K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2 g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X改良 的微量金属溶液1ml。所有组分顺序溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％) 调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。添加 碳源至终浓度为1％。在灭菌以及调整pH后，添加所需的抗生素。

1000X改良的微量金属溶液：

柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g， CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100 mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种来溶解每一组 分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器 过滤灭菌。

i)AFEX生物量水解物的制备

水解AFEX预处理玉米秸秆来制备含有木糖、葡萄糖和乙酸的生物量 水解物。

使用获自MichiganBiotechnologyInstitute的AFEX预处理玉米秸秆。 预处理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。 AFEX预处理玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理玉米秸秆 中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。所用酶 为Accellerase1000，GrindamylH121(来自用于面包制造工业的黑曲霉 的Danisco木聚糖酶产物)。

对于糖化，将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠 缓冲液，pH4.8，2.25ml的Accellerase1000，0.1ml的GrindamylH121， 以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃ 孵育96小时。

为了分析，从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有37.2g/l 的葡萄糖，24.3g/L的木糖，和7.6g/L葡萄糖和/或木糖的寡聚物。此外， 水解物也含有1.17g/L乙酸盐。

ii)实验方法

含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株EWL256的接种物取 自冷冻瓶并划线到含有壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL) 的LB液体培养基琼脂板上并在30℃过夜培养。将单菌落接种到含有葡萄 糖、木糖、丙三醇、乙酸盐或生物量作为唯一碳源的TM3培养基中并在 30℃过夜生长。在乙酸盐上生长的细胞达到了明显更低的光密度。将在葡 萄糖、丙三醇、生物量水解物或乙酸盐上生长的细胞稀释成20mL含有各 自碳源的TM3培养基以达到在600nM处测量的光密度为0.1之间。从葡 萄糖过夜培养物来制备不含有任何碳源的阴性对照。用葡萄糖和木糖进行 单独的实验，其中培养物都稀释到光密度为0.05。所有培养条件(除了乙 酸盐和丙三醇)都一式两份检测并且呈现的结果是这些培养物之间的平均 值。从实验开始，由200μMIPTG诱导异戊二烯的生产。培养瓶在定轨摇 床(200rpm)中在30℃孵育并生长，随后测量光密度。当葡萄糖供料培 养物达到光密度接近0.4后，对所有检测的碳源每小时分析样品的异戊二 烯生产，持续3小时。将100μL样品一式两份转入2mL玻璃瓶中，密封 并在30℃孵育30min。然后通过在80℃孵育8分钟来热处死细菌。使用 GC-MS测量产生的异戊二烯的量并计算比生产率(μg/L＊hr)。

iii)结果

在所有检测碳源上生长期间，可以阐明显著的异戊二烯生产。这些碳 源是含有5或6个碳单元(C5或C6)的常用醇、有机酸、糖，以及生物 量水解物的实例。

在生物量水解物上的初始生长速率与在葡萄糖上的生长速率是相当 的(图69A)。生物量水解物上生长期间的初始比生产率明显比在葡萄糖 上生长期间的要高。这证明生物量水解物可以用作有效的碳源来生产异戊 二烯。在生长255分钟后，在生物量水解物上的比生产率下降(图69B)。 相比于葡萄糖，以木糖作为唯一碳源的细菌具有较低的生长速率(图69C)， 但是测量到明显的比异戊二烯生产力(图69D)。这表明可以利用C5和 C6糖来通过甲羟戊酸途径生产异戊二烯。

出人意料地，在乙酸盐作为唯一碳源上生长的细菌的异戊二烯比生产 率为在葡萄糖上生长期间的约两倍高(图69A)。当相比于葡萄糖，在乙 酸盐上的细菌生长较慢(图69B)，但是所进行的实验表明乙酸盐也可以 用作碳源来生产异戊二烯。如由HPLC所测量，乙酸盐也存在于生物量水 解物中。

以丙三醇作为唯一碳源的细菌生长良好(图69A)并且示出了显著的 异戊二烯生产(图69B)。这表明常用醇也可用作碳源来通过甲羟戊酸途 径生产异戊二烯。

实施例11、来自植物的异戊二烯合酶在链霉菌属中的表达

异戊二烯合酶Kudzu的基因获自质粒pJ201：19813。质粒pJ201：19813 编码来自葛(Pueraialobata)(葛植物)的异戊二烯合酶并且是对于荧光 假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、金红红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和棒杆菌 (Corynebacterium)进行密码子优化的(图9A-79C(SEQIDNO：123))。 用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI对质粒pJ201：19813的消化释放了基 因iso19813，它连接到链霉菌-大肠杆菌穿梭载体pUWL201PW(Doumith 等，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000；图71)以产生pUWL201_iso。通过 对pUWL201_iso的限制性分析来验证成功的克隆。异戊二烯合酶iso19813 的表达在erm-启动子控制下，该启动子允许在链霉菌种中的组成型表达而 不在大肠杆菌中表达。

通过如Hopwood等人，TheJohninnesfoundation，Norwich，1985所 述的原生质体转化将PUWL201PW(无插入片段)和pUWL201_iso导入 白色链霉菌(Streptomycesalbus)J1074(Sanchez等人，Chem.Biol. 9：519-531，2002)。

用1.9μgpUWL201PW或2.9μgpUWL201_iso转化200μl等份原生 质体悬液。在非选择性R5-琼脂板上于28℃过夜孵育后，通过进一步在含 有硫链丝菌肽(250μg/ml)的覆盖R3的琼脂中孵育4天来筛选阳性转化 体。使用PlasmidMiniKit(Qiagen)通过质粒制备来检验硫链丝菌肽抗性 转化体中pUWL-质粒的存在。将制备的质粒再导入大肠杆菌DH5α以产 生足量待通过限制性分析来分析的质粒DNA。在含有氨苄青霉素的L-琼 脂板上筛选阳性转化体并通过由NdeI和BamHI内切核酸酶消化质粒DNA 来进行插入片段的分析。在阳性pUWL201iso克隆中鉴定的异戊二烯合酶 为1.7kb片段，而在对照菌株(pUWL201PW)中，没有观察到此片段。

分析白色链霉菌野生型菌株和含有对照质粒pUWL201PW或异戊二 烯合酶编码pUWL201_iso的转化体的异戊二烯形成。在硫链丝菌肽(200 μg/ml)存在或不存在下，在固体培养基(胰蛋白胨大豆肉汤琼脂，TSB；2.5 ml)上一式两份培养菌株并在28℃下在密封顶空瓶(总体积20ml)中孵 育4天。通过GC-MS以SIM-模式分析500μl顶空样品(终点测量)并根 据参考保留时间和分子量(67m/z)来鉴定异戊二烯。通过之前产生的校 准曲线来量化存在于顶空样品中的异戊二烯。虽然野生型白色链霉菌和带 有pUWL201PW的对照菌株产生的异戊二烯的浓度略高于检测极限(0.04 -0.07ppm)，但是带有pUWL201_iso的白色链霉菌产生的异戊二烯相比 于对照(0.75ppm；图72)超出至少10倍。结果表明植物来源的异戊二 烯合酶在放线菌组中的原核生物中成功表达。

实施例12、在含有上游或上和下游甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶 的大肠杆菌fadRatoCLS5218中从脂肪酸或棕榈油生产异戊二烯或甲羟 戊酸

大肠杆菌fadRatoC菌株LS5218(#6966)获自ColiGeneticStock Center。FadR编码转录抑制物，该转录抑制物负调控编码脂肪酸降解酶 的基因的表达(Campbell等人，J.Bacteriol.183：5982-5990，2001)。AtoC 是双组分调控系统中的应答调控子，而AtoS调控乙酰乳酸代谢。fadRatoC 菌株允许脂肪酸降解基因的组成型表达并且将长链脂肪酸掺入长链长度 的多羟基链烷酸。当将棕榈油用作碳源来生产甲羟戊酸或异戊二烯时，棕 榈油转化成丙三醇加脂肪酸。用于此的方法是本领域公知的，并且它可以 通过由脂肪酶(例如猪胰脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或其他类似脂肪酶) 孵育来酶促完成或这通过用诸如氢氧化钠的碱来皂化而化学完成。

i)表达上游甲羟戊酸途径的大肠杆菌fadRatoC菌株

使用标准方法(Sambrooke等人，MolecularCloning：ALaboratory Manual，2ed.，ColdSpringHarbor，1989)将pCLPtrcUpperPathway电穿 孔到LS5218来产生菌株WW4。通过在补充有C12脂肪酸(FA)或棕榈 油作为碳源的TM3培养基中培养细胞时甲羟戊酸(MVA)的生产来证明 质粒的掺入。为了证明由WWC从脂肪酸生产MVA，将来自过夜培养物 的细胞在5mL补充有0.25％C12FA(Sigma目录号#L9755)的改良TM3 培养基(没有酵母提取物的TM3)中稀释1至100倍。在30℃过夜孵育 IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(24mg/L)是明显的。 生产在3天的时间内增加，产生的MVA的最终水平为194mg/L。为了证 明WW4从油生产MVA，将来自过夜培养物的细胞在改良TM3培养基中 稀释1至100倍，该TM3培养基每5mL补充有200mg经消化的棕榈油。 在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(50 mg/L)是明显的。生产在3天的时间内增加，生产的MVA的最终水平为 500mg/L。

ii)表达上和下甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC菌株

用pMCM118[pTrcKKDyIkIS]转化大肠杆菌菌株WW4(LS5218 fadRatoCpCLPtrcUpperPathway)以得到WW10。当菌株在TM3和葡 萄糖中培养并用IPTG(100，300或900uM)诱导时产生异戊二烯的证 据证明了质粒的掺入。菌株对于IPTG是相对敏感的并且即使在100uM IPTG时都显示了明显的生长缺陷。这些结果如图70A所示。

为了检测从十二烷酸的异戊二烯生产，于37℃在含有壮观霉素(50 ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的L液体培养基中以200rpm振荡过夜培 养WW10。通过离心用改良的TM3培养基冲洗细胞并用这一培养基以它 们的原始培养体积重悬细胞。将来自这一初始培养物的经冲洗和重悬的细 胞以1∶100和1∶10稀释到5mL含有0.125％C12FA(Sigma目录号# L9755)的改良TM3培养基中。

为了阐明来自棕榈油的甲羟戊酸的生产，将油在37℃和250rpm用脂 肪酶预消化若干天以释放脂肪酸(水解证据由振荡试管时形成的泡沫来判 断)。

此外，通过将冲洗过的细胞在具有棕榈油的检测管中所含的改良TM3 培养基中稀释10倍来建立培养物。通过向冲洗过的细胞的剩余物(2.5mL) 加入0.125％C12FA而不进一步稀释(生物转化)而建立又一个管。在 30℃以250rpm振荡生长3.75小时后，通过添加50uMIPTG来诱导所有 培养物。继续孵育4小时，此后，用改良的顶空检测法(在30℃以500rpm 振荡下的1小时累积)检测200uL每种培养基的异戊二烯累积。在GCMS 分析前，通过12小时孵育测定玻璃组(assayglassblock)来进行其它异 戊二烯检测法。继续对该诱导的培养物的过夜孵育并且于第二天早晨，再 次对200uL等份试样进行异戊二烯生产的测定(1小时，30摄氏度，500 rpmShel-Lab摇床)。这些培养物的分析显示出显著水平的异戊二烯生产。 在过夜起始培养物经孵育并过夜诱导后，将它以1/10稀释接种，在培养物 中观察到最高水平的异戊二烯。这一结果表明这一培养物继续生长并且细 胞密度增加。这些结果示出于图70B。由于脂肪酸悬液具有浑浊的外观， 因而不能直接测量细胞密度。因此通过将等份培养物铺板来测定这一培养 物的细胞密度，并且显示为8x107个菌落形成单位。这几乎对应于OD600为0.1。然而，这一培养物提供了显著的异戊二烯生产；在没有这一实例中 所述途径的类似菌株中没有观察到异戊二烯。

实施例13、通过ybhE在大肠杆菌中的组成型表达改善异戊二烯生产

这一实例示出相比于具有野生型ybhE的对照菌株，在组成型表达 ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯生产。基因ybhE(pgl)编码6-磷酸葡糖 酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白的翻译后葡糖酸化并提高产物可溶性 和产量，同时也提高通过磷酸戊糖途径的生物量产量和流量(Aon等人， AppliedandEnvironmentalMicrobiology，74(4)：950-958，2008)。

用ybhE基因在复制质粒pBBR1MCS5(Gentamycin)(获自Dr.K. Peterson，LouisianaStateUniversity)上的组成型表达来构建产生异戊二烯 的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)。

基于FRT-的重组表达盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗 生素标记环出序列获自GeneBridgesGmbH(Germany)。按照Gene Bridges方法进行使用这些材料的步骤。使用StratageneHerculaseII Fusion试剂盒，按照生产商方法，使用引物Pgl-F和Pg1GI1.5-R从 FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(50uL终体积)包括： 5uL缓冲液，1uL模板DNA(来自GeneBridges的FRT-gb2-Cm-F)， 10pmol每种引物和1.5uL25mMdNTP混合物，以dH2O制成50uL。反 应循环如下：1x2分钟，95℃，然后30个循环(95℃，30秒，63℃，30 秒，72℃，3分钟)。

使用QiaQickPCR纯化试剂盒(Qiagen)对得到的PCR产物进行纯 化并将其如下电穿孔到携带含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态 MG1655细胞。通过在30℃生长于5mL的L液体培养基中至OD600～0.6 而制备细胞。通过向细胞加入4％阿拉伯糖并允许在30℃生长30分钟随后 在37℃生长30分钟来诱导重组酶表达。在冰预冷dH2O中将等份的1.5mL 细胞冲洗3-4次。将最终的细胞沉淀在40uL的冰预冷dH2O中重悬浮并 加入2-5uL的PCR产物。在GenePulserElectroporator(Bio-RadInc.) 中以1.3kV在1-mm通道杯中进行电穿孔。在30℃回收细胞1-2小时并在 含有氯霉素(5ug/mL)的L琼脂上铺板。通过PCR分析5个转化体并使 用整合位点侧翼的引物来测序(2个引物对：pgl和49rev以及3’ EcoRV-pglstop；BottomPgb2和TopGB’sCMP(946))。筛选正确的转 化体并将这一菌株命名为MG1655GI1.5-pgl::CMP。

将MG1655GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板来产生含有 FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下将这一构建体克 隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)中。该片段，在此称作CMPGI1.5-pgl， 是使用5’引物Pglconfirm-F和3’引物3’Ec0RV-pglstop来扩增的。使用 InvitrogenTOPO-Blunt克隆试剂盒，按照生产商的建议，将得到的片段 克隆到质粒载体pCR-BluntII-TOPO。将含有CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI 片段克隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)的PstI位点。制备20μl连接反应 物，其包含5μlCMP-GI1.5-pgl插入片段，2μlpBBR1MCS5(Gentamycin) 载体，1μlT4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)，2μl10x连接酶缓冲 液，和10μlddH2O。室温孵育连接混合物40分钟然后使用上面公开的参 数将2-4uL电穿孔到电感受态Top10细胞(Invitrogen)。在含有10ug/ml 氯霉素和5ug/ml庆大霉素的L琼脂上筛选转化体。使用上述多个引物以 及由Sequetech，CA提供的内部T3和反向引物，测定所筛选克隆的序列。 这一质粒命名为pBBRCMPGI1.5-pgl(图77A-B和SEQIDNO：122)。

按上面在实施例10中所述，将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔到 EWL256并且将转化体在含有氯霉素(10ug/mL)、庆大霉素(5ug/mL)、 壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL)的L琼脂上铺板。筛选 一个转化体并命名为RM11608-2。

引物：

Pgl-F

5’- ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAA GGGCGGCCGC-3’(SEQIDNO：115)

PglGI1.5-R

5’- GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAAC GCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGC GTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQIDNO：116)

3′EcoRV-pglstop：

5’-CTTGATATCTTAGTGTGCGTTAACCACCAC(SEQIDNO：117)

pgl+49rev：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQIDNO：118)

BottomPgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQIDNO：119)

TopGB’sCMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQIDNO：120)

Pglconfirm-F

5’-ACCGCCAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQIDNO：121)

i)小规模分析

培养基配方(每升发酵培养基)：

K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2 g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X微量金 属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％) 调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。在灭 菌以及调整pH后，添加葡萄糖5.0g和抗生素。

1000X微量金属溶液：

柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g， CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100 mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种组分来溶解每 一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过 滤器过滤灭菌。

a)实验步骤

通过在来自MicroReactorTechnologies，Inc.的CelleratorTM中生长菌 株来分析异戊二烯生产。24孔中每孔的工作体积为4.5mL。温度维持在 30℃，pH设定点为7.0，氧气流设定点为20sccm并且搅拌速率为800rpm。 将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线到LB液体培养基琼脂板上(具 有抗生素)并在30℃培养。将单菌落接种到含有抗生素的培养基并过夜生 长。将细菌稀释到4.5mL的带抗生素的培养基中至达到在550nm处测量 的光密度为0.05。

使用气相色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空检测法进行异戊二 烯的废气分析。如下制备样品：将100μL的整个液体培养基至于密封GC 瓶中并在30℃孵育固定时间30分钟。在由70℃温育5分钟的热处死步骤 后，将样品装载到GC。

在运行期间，使用微板读数器获得在550nm波长下的光密度(OD)。 通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以OD读数和时间(小时)来获得比生产 力。

在200和400uMIPTG诱导水平下评估两菌株EWL256和 RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75和8小时分析样品的异戊二烯生产和 细胞生长(OD550)。样品一式两份进行。

b)结果

实验表明在2种不同IPTG浓度下，表达ybhE(pgl)的菌株相比于对照 菌株的异戊二烯比生产率显著增加了2-3倍。

ii)来自表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶 和pgl过表达(RHM111608-2)并且在15-L规模下于补料分批培养中生 长的大肠杆菌的异戊二烯发酵

培养基配方(每升发酵培养基)：

K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3 g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添 加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH 至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl 0.1g以及抗生素。

1000X改良的微量金属溶液：

柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g， CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100 mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种组分来溶解每 一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过 滤器过滤灭菌。

在15-L生物反应器中用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)，高表达的来自马氏甲 烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二 烯合酶以及高表达pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。 进行这一实验来监测在期望的发酵pH7.0以及温度34℃下从葡萄糖形成 的异戊二烯。解冻冷冻瓶的大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养 基中。在接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500mL接 种15-L生物反应器，使初始体积达到5-L。

以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加 料减少以满足代谢要求。在40小时(59小时)发酵期间，送至生物反应 器的葡萄糖总量为3.1kg(在59小时为4.2kg)。通过添加IPTG完成诱 导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值4时，IPTG浓度达到110uM。 当OD550达到150时，IPTG浓度升至192uM。图78A显示了生物反应器 中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异 戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至在40小时的最大值为 33.2g/L(在59小时为48.6g/L)(图78B)。异戊二烯的滴定度随着发 酵进程增加至在40小时的最大值为40.0g/L(在59小时为60.5g/L)(图 78C)。在40小时(59小时)发酵期间所产生的异戊二烯的总量为281.3g (在59小时为451.0g)，生产的时间进程如图78D所示。体积生产力的 时间进程如图78E所示并且示出在0和40小时之间维持平均速率在1.0 g/L/hr(在19和59小时之间为1.4g/L/hr)。如通过CER所测量的代谢 活性谱如图78F所示。在40小时发酵期间进入到生产异戊二烯的所利用 碳的摩尔产率为19.6％(在59小时为23.6％)。在40小时来自葡萄糖的 异戊二烯的重量百分产率为8.9％(在59小时为10.7％)。

除非另有说明，否则在此使用的所有科技术语的含义是本发明所属领 域的技术人员通常所理解的。Singleton等人，DictionaryofMicrobiology andMolecularBiology，第二版，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)， 以及Hale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology，Harper Perennial，N.Y.(1991)为熟练技术人员提供了在本发明中使用的许多术语 的一般词典。应理解的是，本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂， 因为它们可以改变。本领域熟练技术人员也将理解，也可以将与在此所述 的任何方法和材料相似或等同的那些用于实施或测试本发明。

在此提供的标题不限于本发明多个方面或实施方式，可以通过参考作 为整体的说明书来得到它们。

对于在此所使用，除非另有明确指示，否则术语“一个”或类似术语的 使用指一个或多个。

在此所指的“约”某数值或参数包括(并且描述了)涉及该数值或参数 本身的实施方式。例如，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围 包括定义该范围的数字。

应理解的是，在此所述的本发明的方面和实施方式包括“包括”该方面 和实施方式、“由该方面和实施方式组成”和“基本上由该方面和实施方式组 成”。

附录1

示例性1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽

ATH：AT3G21500(DXPS1)AT4G15560(CLA1)AT5G11380(DXPS3)

OSA：433876843400904342614

CME：CMF089C

PFA：MAL13P1.186

TAN：TA20470

TPV：TP01_0516

ECO：b0420(dxs)

ECJ：JW0410(dxs)

ECE：Z0523(dxs)

ECS：ECs0474

ECC：c0531(dxs)

ECI：UTI89_C0443(dxs)

ECP：ECP_0479

ECV：APECO1_1590(dxs)

ECW：EcE24377A_0451(dxs)

ECX：EcHS_A0491

STY：STY0461(dxs)

STT：t2441(dxs)

SPT：SPA2301(dxs)

SEC：SC0463(dxs)

STM：STM0422(dxs)

YPE：YPO3177(dxs)

YPK：y1008(dxs)

YPM：YP_0754(dxs)

YPA：YPA_2671

YPN：YPN_0911

YPP：YPDSF_2812

YPS：YPTB0939(dxs)

YPI：YpsIP31758_3112(dxs)

SFL：SF0357(dxs)

SFX：S0365(dxs)

SFV：SFV_0385(dxs)

SSN：SSON_0397(dxs)

SBO：SBO_0314(dxs)

SDY：SDY_0310(dxs)

ECA：ECA1131(dxs)

PLU：plu3887(dxs)

BUC：BU464(dxs)

BAS：BUsg448(dxs)

WBR：WGLp144(dxs)

SGL：SG0656

KPN：KPN_00372(dxs)

BFL：Bfl238(dxs)

BPN：BPEN_244(dxs)

HIN：HI1439(dxs)

HIT：NTHI1691(dxs)

HIP：CGSHiEE_04795

HIQ：CGSHiGG_01080

HDU：HD0441(dxs)

HSO：HS_0905(dxs)

PMU：PM0532(dxs)

MSU：MS1059(dxs)

APL：APL_0207(dxs)

XFA：XF2249

XFT：PD1293(dxs)

XCC：XCC2434(dxs)

XCB：XC_1678

XCV：XCV2764(dxs)

XAC：XAC2565(dxs)

XOO：XOO2017(dxs)

XOM：XOO_1900(XOO1900)

VCH：VC0889

VVU：VV1_0315

VVY：VV0868

VPA：VP0686

VFI：VF0711

PPR：PBPRA0805

PAE：PA4044(dxs)

PAU：PA14_11550(dxs)

PAP：PSPA7_1057(dxs)

PPU：PP_0527(dxs)

PST：PSPTO_0698(dxs)

PSB：Psyr_0604

PSP：PSPPH_0599(dxs)

PFL：PFL_5510(dxs)

PFO：Pfl_5007

PEN：PSEEN0600(dxs)

PMY：Pmen_3844

PAR：Psyc_0221(dxs)

PCR：Pcryo_0245

ACI：ACIAD3247(dxs)

SON：SO_1525(dxs)

SDN：Sden_2571

SFR：Sfri_2790

SAZ：Sama_2436

SBL：Sbal_1357

SLO：Shew_2771

SHE：Shewmr4_2731

SHM：Shewmr7_2804

SHN：Shewana3_2901

SHW：Sputw3181_2831

ILO：IL2138(dxs)

CPS：CPS_1088(dxs)

PHA：PSHAa2366(dxs)

PAT：Patl_1319

SDE：Sde_3381

PIN：Ping_2240

MAQ：Maqu_2438

MCA：MCA0817(dxs)

FTU：FTT1018c(dxs)

FTF：FTF1018c(dxs)

FTW：FTW_0925(dxs)

FTL：FTL_1072

FTH：FTH_1047(dxs)

FTA：FTA_1131(dxs)

FTN：FTN_0896(dxs)

NOC：Noc_1743

AEH：Mlg_1381

HCH：HCH_05866(dxs)

CSA：Csal_0099

ABO：ABO_2166(dxs)

AHA：AHA_3321(dxs)

BCI：BCI_0275(dxs)

RMA：Rmag_0386

VOK：COSY_0360(dxs)

NME：NMB1867

NMA：NMA0589(dxs)

NMC：NMC0352(dxs)

NGO：NGO0036

CVI：CV_2692(dxs)

RSO：RSc2221(dxs)

REU：Reut_A0882

REH：H16_A2732(dxs)

RME：Rmet_2615

BMA：BMAA0330(dxs)

BMV：BMASAVP1_1512(dxs)

BML：BMA10299_1706(dxs)

BMN：BMA10247_A0364(dxs)

BXE：Bxe_B2827

BUR：Bcep18194_B2211

BCN：Bcen_4486

BCH：Bcen2424_3879

BAM：Bamb_3250

BPS：BPSS1762(dxs)

BPM：BURPS1710b_A0842(dxs)

BPL：BURPS1106A_A2392(dxs)

BPD：BURPS668_A2534(dxs)

BTE：BTH_II0614(dxs)

BPE：BP2798(dxs)

BPA：BPP2464(dxs)

BBR：BB1912(dxs)

RFR：Rfer_2875

POL：Bpro_1747

PNA：Pnap_1501

AJS：Ajs_1038

MPT：Mpe_A2631

HAR：HEAR0279(dxs)

MMS：mma_0331

NEU：NE1161(dxs)

NET：Neut_1501

NMU：Nmul_A0236

EBA：ebA4439(dxs)

AZO：azo1198(dxs)

DAR：Daro_3061

TBD：Tbd_0879

MFA：Mfla_2133

HPY：HP0354(dxs)

HPJ：jhp0328(dxs)

HPA：HPAG1_0349

HHE：HH0608(dxs)

HAC：Hac_0968(dxs)

WSU：WS1996

TDN：Tmden_0475

CJE：Cj0321(dxs)

CJR：CJE0366(dxs)

CJJ：CJJ81176_0343(dxs)

CJU：C8J_0298(dxs)

CJD：JJD26997_1642(dxs)

CFF：CFF8240_0264(dxs)

CCV：CCV52592_1671(dxs)CCV52592_1722

CHA：CHAB381_1297(dxs)

CCO：CCC13826_1594(dxs)

ABU：Abu_2139(dxs)

NIS：NIS_0391(dxs)

SUN：SUN_2055(dxs)

GSU：GSU0686(dxs-1)GSU1764(dxs-2)

GME：Gmet_1934Gmet_2822

PCA：Pcar_1667

PPD：Ppro_1191Ppro_2403

DVU：DVU1350(dxs)

DVL：Dvul_1718

DDE：Dde_2200

LIP：LI0408(dsx)

DPS：DP2700

ADE：Adeh_1097

MXA：MXAN_4643(dxs)

SAT：SYN_02456

SFU：Sfum_1418

PUB：SAR11_0611(dxs)

MLO：mlr7474

MES：Meso_0735

SME：SMc00972(dxs)

ATU：Atu0745(dxs)

ATC：AGR_C_1351

RET：RHE_CH00913(dxs)

RLE：RL0973(dxs)

BME：BMEI1498

BMF：BAB1_0462(dxs)

BMS：BR0436(dxs)

BMB：BruAb1_0458(dxs)

BOV：BOV_0443(dxs)

BJA：bll2651(dxs)

BRA：BRADO2161(dxs)

BBT：BBta_2479(dxs)

RPA：RPA0952(dxs)

RPB：RPB_4460

RPC：RPC_1149

RPD：RPD_4305

RPE：RPE_1067

NWI：Nwi_0633

NHA：Nham_0778

BHE：BH04350(dxs)

BQU：BQ03540(dxs)

BBK：BARBAKC583_0400(dxs)

CCR：CC_2068

SIL：SPO0247(dxs)

SIT：TM1040_2920

RSP：RSP_0254(dxsA)RSP_1134(dxs)

JAN：Jann_0088Jann_0170

RDE：RD1_0101(dxs)RD1_0548(dxs)

MMR：Mmar10_0849

HNE：HNE_1838(dxs)

ZMO：ZMO1234(dxs)ZMO1598(dxs)

NAR：Saro_0161

SAL：Sala_2354

ELI：ELI_12520

GOX：GOX0252

GBE：GbCGDNIH1_0221GbCGDNIH1_2404

RRU：Rru_A0054Rru_A2619

MAG：amb2904

MGM：Mmc1_1048

SUS：Acid_1783

BSU：BG11715(dxs)

BHA：BH2779

BAN：BA4400(dxs)

BAR：GBAA4400(dxs)

BAA：BA_4853

BAT：BAS4081

BCE：BC4176(dxs)

BCA：BCE_4249(dxs)

BCZ：BCZK3930(dxs)

BTK：BT9727_3919(dxs)

BTL：BALH_3785(dxs)

BLI：BL01523(dxs)

BLD：BLi02598(dxs)

BCL：ABC2462(dxs)

BAY：RBAM_022600

BPU：BPUM_2159

GKA：GK2392

GTN：GTNG_2322

LMO：lmo1365(tktB)

LMF：LMOf2365_1382(dxs)

LIN：lin1402(tktB)

LWE：lwe1380(tktB)

LLA：L108911(dxsA)L123365(dxsB)

LLC：LACR_1572LACR_1843

LLM：llmg_0749(dxsB)

SAK：SAK_0263

LPL：lp_2610(dxs)

LJO：LJ0406

LAC：LBA0356

LSL：LSL_0209(dxs)

LGA：LGAS_0350

STH：STH1842

CAC：CAC2077CA_P0106(dxs)

CPE：CPE1819

CPF：CPF_2073(dxs)

CPR：CPR_1787(dxs)

CTC：CTC01575

CNO：NT01CX_1983

CTH：Cthe_0828

CDF：CD1207(dxs)

CBO：CBO1881(dxs)

CBA：CLB_1818(dxs)

CBH：CLC_1825(dxs)

CBF：CLI_1945(dxs)

CKL：CKL_1231(dxs)

CHY：CHY_1985(dxs)

DSY：DSY2348

DRM：Dred_1078

PTH：PTH_1196(dxs)

SWO：Swol_0582

CSC：Csac_1853

TTE：TTE1298(dxs)

MTA：Moth_1511

MPE：MYPE730

MGA：MGA_1268(dxs)

MTU：Rv2682c(dxs1)Rv3379c(dxs2)

MTC：MT2756(dxs)

MBO：Mb2701c(dxs1)Mb3413c(dxs2)

MLE：ML1038(dxs)

MPA：MAP2803c(dxs)

MAV：MAV_3577(dxs)

MSM：MSMEG_2776(dxs)

MMC：Mmcs_2208

CGL：NCgl1827(cgl1902)

CGB：cg2083(dxs)

CEF：CE1796

CDI：DIP1397(dxs)

CJK：jk1078(dxs)

NFA：nfa37410(dxs)

RHA：RHA1_ro06843

SCO：SCO6013(SC1C3.01)SCO6768(SC6A5.17)

SMA：SAV1646(dxs1)SAV2244(dxs2)

TWH：TWT484

TWS：TW280(Dxs)

LXX：Lxx10450(dxs)

CMI：CMM_1660(dxsA)

AAU：AAur_1790(dxs)

PAC：PPA1062

TFU：Tfu_1917

FRA：Francci3_1326

FAL：FRAAL2088(dxs)

ACE：Acel_1393

SEN：SACE_1815(dxs)SACE_4351

BLO：BL1132(dxs)

BAD：BAD_0513(dxs)

FNU：FN1208FN1464

RBA：RB2143(dxs)

CTR：CT331(dxs)

CTA：CTA_0359(dxs)

CMU：TC0608

CPN：CPn1060(tktB_2)

CPA：CP0790

CPJ：CPj1060(tktB_2)

CPT：CpB1102

CCA：CCA00304(dxs)

CAB：CAB301(dxs)

CFE：CF0699(dxs)

PCU：pc0619(dxs)

TPA：TP0824

TDE：TDE1910(dxs)

LIL：LA3285(dxs)

LIC：LIC10863(dxs)

LBJ：LBJ_0917(dxs)

LBL：LBL_0932(dxs)

SYN：sll1945(dxs)

SYW：SYNW1292(Dxs)

SYC：syc1087_c(dxs)

SYF：Synpcc7942_0430

SYD：Syncc9605_1430

SYE：Syncc9902_1069

SYG：sync_1410(dxs)

SYR：SynRCC307_1390(dxs)

SYX：SynWH7803_1223(dxs)

CYA：CYA_1701(dxs)

CYB：CYB_1983(dxs)

TEL：tll0623

GVI：gll0194

ANA：alr0599

AVA：Ava_4532

PMA：Pro0928(dxs)

PMM：PMM0907(Dxs)

PMT：PMT0685(dxs)

PMN：PMN2A_0300

PMI：PMT9312_0893

PMB：A9601_09541(dxs)

PMC：P9515_09901(dxs)

PMF：P9303_15371(dxs)

PMG：P9301_09521(dxs)

PMH：P9215_09851

PMJ：P9211_08521

PME：NATL1_09721(dxs)

TER：Tery_3042

BTH：BT_1403BT_4099

BFR：BF0873BF4306

BFS：BF0796(dxs)BF4114

PGI：PG2217(dxs)

CHU：CHU_3643(dxs)

GFO：GFO_3470(dxs)

FPS：FP0279(dxs)

CTE：CT0337(dxs)

CPH：Cpha266_0671

PVI：Cvib_0498

PLT：Plut_0450

DET：DET0745(dxs)

DEH：cbdb_A720(dxs)

DRA：DR_1475

DGE：Dgeo_0994

TTH：TTC1614

TTJ：TTHA0006

AAE：aq_881

TMA：TM1770

PMO：Pmob_1001

示例性乙酰-CoA乙酰转移酶核酸和多肽

HSA：38(ACAT1)39(ACAT2)

PTR：451528(ACAT1)

MCC：707653(ACAT1)708750(ACAT2)

MMU：110446(Acat1)110460(Acat2)

RNO：25014(Acat1)

CFA：484063(ACAT2)489421(ACAT1)

GGA：418968(ACAT1)421587(RCJMB04_34i5)

XLA：379569(MGC69098)414622(MGC81403)414639(MGC81256) 444457(MGC83664)

XTR：394562(acat2)

DRE：30643(acat2)

SPU：759502(LOC759502)

DME：Dmel_CG10932Dmel_CG9149

CEL：T02G5.4T02G5.7T02G5.8(kat-1)

ATH：AT5G48230(ACAT2/EMB1276)

OSA：43261364346520

CME：CMA042CCME087C

SCE：YPL028W(ERG10)

AGO：AGOS_ADR165C

PIC：PICST_31707(ERG10)

CAL：CaO19.1591(erg10)

CGR：CAGL0L12364g

SPO：SPBC215.09c

MGR：MGG_01755MGG_13499

ANI：AN1409.2

AFM：AFUA_6G14200AFUA_8G04000

AOR：AO090103000012AO090103000406

CNE：CNC05280

UMA：UM03571.1

DDI：DDB_0231621

PFA：PF14_0484

TET：TTHERM_00091590TTHERM_00277470TTHERM_00926980

TCR：511003.60

ECO：b2224(atoB)

ECJ：JW2218(atoB)JW5453(yqeF)

ECE：Z4164(yqeF)

ECS：ECs3701

ECC：c2767(atoB)c3441(yqeF)

ECI：UTI89_C2506(atoB)UTI89_C3247(yqeF)

ECP：ECP_2268ECP_2857

ECV：APECO1_3662(yqeF)APECO1_4335(atoB)APECO1_43352(atoB)

ECX：EcHS_A2365

STY：STY3164(yqeF)

STT：t2929(yqeF)

SPT：SPA2886(yqeF)

SEC：SC2958(yqeF)

STM：STM3019(yqeF)

SFL：SF2854(yqeF)

SFX：S3052(yqeF)

SFV：SFV_2922(yqeF)

SSN：SSON_2283(atoB)SSON_3004(yqeF)

SBO：SBO_2736(yqeF)

ECA：ECA1282(atoB)

ENT：Ent638_3299

SPE：Spro_0592

HIT：NTHI0932(atoB)

XCC：XCC1297(atoB)

XCB：XC_2943

XCV：XCV1401(thlA)

XAC：XAC1348(atoB)

XOO：XOO1881(atoB)

XOM：XOO_1778(XOO1778)

VCH：VCA0690

VCO：VC0395_0630

VVU：VV2_0494VV2_0741

VVY：VVA1043VVA1210

VPA：VPA0620VPA1123VPA1204

PPR：PBPRB1112PBPRB1840

PAE：PA2001(atoB)PA2553PA3454PA3589PA3925

PAU：PA14_38630(atoB)

PPU：PP_2051(atoB)PP_2215(fadAx)PP_3754PP_4636

PPF：Pput_2009Pput_2403Pput_3523Pput_4498

PST：PSPTO_0957(phbA-1)PSPTO_3164(phbA-2)

PSB：Psyr_0824Psyr_3031

PSP：PSPPH_0850(phbA1)PSPPH_2209(phbA2)

PFL：PFL_1478(atoB-2)PFL_2321PFL_3066PFL_4330(atoB-2) PFL_5283

PFO：Pfl_1269Pfl_1739Pfl_2074Pfl_2868

PEN：PSEEN3197PSEEN3547(fadAx)PSEEN4635(phbA)

PMY：Pmen_1138Pmen_2036Pmen_3597Pmen_3662Pmen_3820

PAR：Psyc_0252Psyc_1169

PCR：Pcryo_0278Pcryo_1236Pcryo_1260

PRW：PsycPRwf_2011

ACI：ACIAD0694ACIAD1612ACIAD2516(atoB)

SON：SO_1677(atoB)

SDN：Sden_1943

SFR：Sfri_1338Sfri_2063

SAZ：Sama_1375

SBL：Sbal_1495

SBM：Shew185_1489

SBN：Sbal195_1525

SLO：Shew_1667Shew_2858

SPC：Sputcn32_1397

SSE：Ssed_1473Ssed_3533

SPL：Spea_2783

SHE：Shewmr4_2597

SHM：Shewmr7_2664

SHN：Shewana3_2771

SHW：Sputw3181_2704

ILO：IL0872

CPS：CPS_1605CPS_2626

PHA：PSHAa0908PSHAa1454(atoB)PSHAa1586(atoB)

PAT：Patl_2923

SDE：Sde_3149

PIN：Ping_0659Ping_2401

MAQ：Maqu_2117Maqu_2489Maqu_2696Maqu_3162

CBU：CBU_0974

LPN：lpg1825(atoB)

LPF：lpl1789

LPP：lpp1788

NOC：Noc_1891

AEH：Mlg_0688Mlg_2706

HHA：Hhal_1685

HCH：HCH_05299

CSA：Csal_0301Csal_3068

ABO：ABO_0648(fadAx)

MMW：Mmwyl1_0073Mmwyl1_3021Mmwyl1_3053Mmwyl1_3097 Mmwyl1_4182

AHA：AHA_2143(atoB)

CVI：CV_2088(atoB)CV_2790(phaA)

RSO：RSc0276(atoB)RSc1632(phbA)RSc1637(bktB)RSc1761(RS02948)

REU：Reut_A0138Reut_A1348Reut_A1353Reut_B4561Reut_B4738 Reut_B5587Reut_C5943Reut_C6062

REH：H16_A0170H16_A0867H16_A0868H16_A0872H16_A1297

H16_A1438(phaA)H16_A1445(bktB)H16_A1528H16_A1713 H16_A1720

H16_A1887H16_A2148H16_B0380H16_B0381H16_B0406 H16_B0662

H16_B0668H16_B0759H16_B1369H16_B1771

RME：Rmet_0106Rmet_1357Rmet_1362Rmet_5156

BMA：BMA1316BMA1321(phbA)BMA1436

BMV：BMASAVP1_A1805(bktB)BMASAVP1_A1810(phbA)

BML：BMA10299_A0086(phbA)BMA10299_A0091

BMN：BMA10247_1076(bktB)BMA10247_1081(phbA)

BXE：Bxe_A2273Bxe_A2335Bxe_A2342Bxe_A4255Bxe_B0377 Bxe_B0739

Bxe_C0332Bxe_C0574Bxe_C0915

BVI：Bcep1808_0519Bcep1808_1717Bcep1808_2877Bcep1808_3594 Bcep1808_4015Bcep1808_5507Bcep1808_5644

BUR：Bcep18194_A3629Bcep18194_A5080Bcep18194_A5091

Bcep18194_A6102Bcep18194_B0263Bcep18194_B1439

Bcep18194_C6652Bcep18194_C6802Bcep18194_C6874

Bcep18194_C7118Bcep18194_C7151Bcep18194_C7332

BCN：Bcen_1553Bcen_1599Bcen_2158Bcen_2563Bcen_2998 Bcen_6289

BCH：Bcen2424_0542Bcen2424_1790Bcen2424_2772Bcen2424_5368 Bcen2424_6232Bcen2424_6276

BAM：Bamb_0447Bamb_1728Bamb_2824Bamb_4717Bamb_5771 Bamb_5969

BPS：BPSL1426BPSL1535(phbA)BPSL1540

BPM：BURPS1710b_2325(bktB)BURPS1710b_2330(phbA) BURPS1710b_2453(atoB-2)

BPL：BURPS1106A_2197(bktB)BURPS1106A_2202(phbA)

BPD：BURPS668_2160(bktB)BURPS668_2165(phbA)

BTE：BTH_I2144BTH_I2256BTH_I2261

PNU：Pnuc_0927

BPE：BP0447BP0668BP2059

BPA：BPP0608BPP1744BPP3805BPP4216BPP4361

BBR：BB0614BB3364BB4250BB4804BB4947

RFR：Rfer_0272Rfer_1000Rfer_1871Rfer_2273Rfer_2561Rfer_2594 Rfer_3839

POL：Bpro_1577Bpro_2140Bpro_3113Bpro_4187

PNA：Pnap_0060Pnap_0458Pnap_0867Pnap_1159Pnap_2136 Pnap_2804

AAV：Aave_0031Aave_2478Aave_3944Aave_4368

AJS：Ajs_0014Ajs_0124Ajs_1931Ajs_2073Ajs_2317Ajs_3548 Ajs_3738Ajs_3776

VEI：Veis_1331Veis_3818Veis_4193

DAC：Daci_0025Daci_0192Daci_3601Daci_5988

MPT：Mpe_A1536Mpe_A1776Mpe_A1869Mpe_A3367

HAR：HEAR0577(phbA)

MMS：mma_0555

NEU：NE2262(bktB)

NET：Neut_0610

EBA：ebA5202p2A409(tioL)

AZO：azo0464(fadA1)azo0469(fadA2)azo2172(thlA)

DAR：Daro_0098Daro_3022

HPA：HPAG1_0675

HAC：Hac_0958(atoB)

GME：Gmet_1719Gmet_2074Gmet_2213Gmet_2268Gmet_3302

GUR：Gura_3043

BBA：Bd0404(atoB)Bd2095

DOL：Dole_0671Dole_1778Dole_2160Dole_2187

ADE：Adeh_0062Adeh_2365

AFW：Anae109_0064Anae109_1504

MXA：MXAN_3791

SAT：SYN_02642

SFU：Sfum_2280Sfum_3582

RPR：RP737

RCO：RC1134RC1135

RFE：RF_0163(paaJ)

RBE：RBE_0139(paaJ)

RAK：A1C_05820

RBO：A1I_07215

RCM：A1E_04760

PUB：SAR11_0428(thlA)

MLO：mlr3847

MES：Meso_3374

PLA：Plav_1573Plav_2783

SME：SMa1450SMc03879(phbA)

SMD：Smed_0499Smed_3117Smed_5094Smed_5096

ATU：Atu2769(atoB)Atu3475

ATC：AGR_C_5022(phbA)AGR_L_2713

RET：RHE_CH04018(phbAch)RHE_PC00068(ypc00040) RHE_PF00014(phbAf)

RLE：RL4621(phaA)pRL100301pRL120369

BME：BMEI0274BMEII0817

BMF：BAB1_1783(phbA-1)BAB2_0790(phbA-2)

BMS：BR1772(phbA-1)BRA0448(phbA-2)

BMB：BruAb1_1756(phbA-1)BruAb2_0774(phbA-2)

BOV：BOV_1707(phbA-1)

OAN：Oant_1130Oant_3107Oant_3718Oant_4020

BJA：bll0226(atoB)bll3949bll7400bH7819blr3724(phbA)

BRA：BRADO0562(phbA)BRADO0983(pimB)BRADO3110 BRADO3134(atoB)

BBT：BBta_3558BBta_3575(atoB)BBta_5147(pimB)BBta_7072(pimB) BBta_7614(phbA)

RPA：RPA0513(pcaF)RPA0531RPA3715(pimB)

RPB：RPB_0509RPB_0525RPB_1748

RPC：RPC_0504RPC_0636RPC_0641RPC_0832RPC_1050RPC_2005 RPC_2194RPC_2228

RPD：RPD_0306RPD_0320RPD_3105RPD_3306

RPE：RPE_0168RPE_0248RPE_3827

NWI：Nwi_3060

XAU：Xaut_3108Xaut_4665

CCR：CC_0510CC_0894CC_3462

SIL：SPO0142(bktB)SPO0326(phbA)SPO0773SPO3408

SIT：TM1040_0067TM1040_2790TM1040_3026TM1040_3735

RSP：RSP_0745RSP_1354RSP_3184

RSH：Rsph17029_0022Rsph17029_2401Rsph17029_3179 Rsph17029_3921

RSQ：Rsph17025_0012Rsph17025_2466Rsph17025_2833

JAN：Jann_0262Jann_0493Jann_4050

RDE：RD1_0025RD1_0201(bktB)RD1_3394(phbA)

PDE：Pden_2026Pden_2663Pden_2870Pden_2907Pden_4811 Pden_5022

DSH：Dshi_0074Dshi_3066Dshi_3331

MMR：Mmar10_0697

HNE：HNE_2706HNE_3065HNE_3133

NAR：Saro_0809Saro_1069Saro_1222Saro_2306Saro_2349

SAL：Sala_0781Sala_1244Sala_2896Sala_3158

SWI：Swit_0632Swit_0752Swit_2893Swit_3602Swit_4887Swit_5019 Swit_5309

ELI：ELI_01475ELI_06705ELI_12035

GBE：GbCGDNIH1_0447

ACR：Acry_1847Acry_2256

RRU：Rru_A0274Rru_A1380Rru_A1469Rru_A1946Rru_A3387

MAG：amb0842

MGM：Mmc1_1165

ABA：Acid345_3239

BSU：BG11319(mmgA)BG13063(yhfS)

BHA：BH1997BH2029BH3801(mmgA)

BAN：BA3687BA4240BA5589

BAR：GBAA3687GBAA4240GBAA5589

BAA：BA_0445BA_4172BA_4700

BAT：BAS3418BAS3932BAS5193

BCE：BC3627BC4023BC5344

BCA：BCE_3646BCE_4076BCE_5475

BCZ：BCZK3329(mmgA)BCZK3780(thl)BCZK5044(atoB)

BCY：Bcer98_2722Bcer98_3865

BTK：BT9727_3379(mmgA)BT9727_3765(thl)BT9727_5028(atoB)

BTL：BALH_3262(mmgA)BALH_3642(fadA)BALH_4843(atoB)

BLI：BL03925(mmgA)

BLD：BLi03968(mmgA)

BCL：ABC0345ABC2989ABC3617ABC3891(mmgA)

BAY：RBAM_022450

BPU：BPUM_2374(yhfS)BPUM_2941BPUM_3373

OIH：OB0676OB0689OB2632OB3013

GKA：GK1658GK3397

SAU：SA0342SA0534(vraB)

SAV：SAV0354SAV0576(vraB)

SAM：MW0330MW0531(vraB)

SAR：SAR0351(thl)SAR0581

SAS：SAS0330SAS0534

SAC：SACOL0426SACOL0622(atoB)

SAB：SAB0304(th1)SAB0526

SAA：SAUSA300_0355SAUSA300_0560(vraB)

SAO：SAOUHSC_00336SAOUHSC_00558

SAJ：SaurJH9_0402

SAH：SaurJH1_0412

SEP：SE0346SE2384

SER：SERP0032SERP0220

SHA：SH0510(mvaC)SH2417

SSP：SSP0325SSP2145

LMO：lmo1414

LMF：LMOf2365_1433

LIN：lin1453

LWE：lwe1431

LLA：L11745(thiL)L25946(fadA)

LLC：LACR_1665LACR_1956

LLM：llmg_0930(thiL)

SPY：SPy_0140SPy_1637(atoB)

SPZ：M5005_Spy_0119M5005_Spy_0432M5005_Spy_1344(atoB)

SPM：spyM18_0136spyM18_1645(atoB)

SPG：SpyM3_0108SpyM3_1378(atoB)

SPS：SPs0110SPs0484

SPH：MGAS10270_Spy0121MGAS10270_Spy0433 MGAS10270_Spy1461(atoB)

SPI：MGAS10750_Spy0124MGAS10750_Spy0452 MGAS10750_Spy1453(atoB)

SPJ：MGAS2096_Spy0123MGAS2096_Spy0451 MGAS2096_Spy1365(atoB)

SPK：MGAS9429_Spy0121MGAS9429_Spy0431 MGAS9429_Spy1339(atoB)

SPF：SpyM50447(atoB2)

SPA：M6_Spy0166M6_Spy0466M6_Spy1390

SPB：M28_Spy0117M28_Spy0420M28_Spy1385(atoB)

SAK：SAK_0568

LJO：LJ1609

LAC：LBA0626(thiL)

LSA：LSA1486

LDB：Ldb0879

LBU：LBUL_0804

LBR：LVIS_2218

LCA：LSEI_1787

LGA：LGAS_1374

LRE：Lreu_0052

EFA：EF1364

OOE：OEOE_0529

STH：STH2913STH725STH804

CAC：CAC2873CA_P0078(thiL)

CPE：CPE2195(atoB)

CPF：CPF_2460

CPR：CPR_2170

CTC：CTC00312

CNO：NT01CX_0538NT01CX_0603

CDF：CD1059(thlA1)CD2676(thlA2)

CBO：CBO3200(thl)

CBE：Cbei_0411Cbei_3630

CKL：CKL_3696(thlA1)CKL_3697(thlA2)CKL_3698(thlA3)

AMT：Amet_4630

AOE：Clos_0084Clos_0258

CHY：CHY_1288CHY_1355(atoB)CHY_1604CHY_1738

DSY：DSY0632DSY0639DSY1567DSY1710DSY2402DSY3302

DRM：Dred_0400Dred_1491Dred_1784Dred_1892

SWO：Swol_0308Swol_0675Swol_0789Swol_1486Swol_1934 Swol_2051

TTE：TTE0549(paaJ)

MTA：Moth_1260

MTU：Rv1135ARv1323(fadA4)Rv3546(fadA5)

MTC：MT1365(phbA)

MBO：Mb1167Mb1358(fadA4)Mb3576(fadA5)Mb3586c(fadA6)

MBB：BCG_1197BCG_1385(fadA4)BCG_3610(fadA5) BCG_3620c(fadA6)

MLE：ML1158(fadA4)

MPA：MAP2407c(fadA3)MAP2436c(fadA4)

MAV：MAV_1544MAV_1573MAV_1863MAV_5081

MSM：MSMEG_2224MSMEG_4920

MUL：MUL_0357

MVA：Mvan_1976Mvan_1988Mvan_4305Mvan_4677Mvan_4891

MGI：Mflv_1347Mflv_1484Mflv_2040Mflv_2340Mflv_4356Mflv_4368

MMC：Mmcs_1758Mmcs_1769Mmcs_3796Mmcs_3864

MKM：Mkms_0251Mkms_1540Mkms_1805Mkms_1816Mkms_2836 Mkms_3159

Mkms_3286Mkms_3869Mkms_3938Mkms_4227Mkms_4411 Mkms_4580

Mkms_4724Mkms_4764Mkms_4776

MJL：Mjls_0231Mjls_1739Mjls_1750Mjls_2819Mjls_3119Mjls_3235

Mjls_3800Mjls_3850Mjls_4110Mjls_4383Mjls_4705Mjls_4876

Mjls_5018Mjls_5063Mjls_5075

CGL：NCgl2309(cgl2392)

CGB：cg2625(pcaF)

CEF：CE0731CE2295

CJK：jk1543(fadA3)

NFA：nfa10750(fadA4)

RHA：RHA1_ro01455RHA1_ro01623RHA1_ro01876 RHA1_ro02517(catF)

RHA1_ro03022RHA1_ro03024RHA1_ro03391RHA1_ro03892

RHA1_ro04599RHA1_ro05257RHA1_ro08871

SCO：SCO5399(SC8F4.03)

SMA：SAV1384(fadA5)SAV2856(fadA1)

ART：Arth_1160Arth_2986Arth_3268Arth_4073

NCA：Noca_1371Noca_1797Noca_1828Noca_2764Noca_4142

TFU：Tfu_1520Tfu_2394

FRA：Francci3_3687

FRE：Franean1_1044Franean1_2711Franean1_2726Franean1_3929 Franean1_4037Franean1_4577

FAL：FRAAL2514FRAAL2618FRAAL5910(atoB)

ACE：Acel_0626Acel_0672

SEN：SACE_1192(mmgA)SACE_2736(fadA6)SACE_4011(catF) SACE_6236(fadA4)

STP：Strop_3610

SAQ：Sare_1316Sare_3991

RXY：Rxyl_1582Rxyl_1842Rxyl_2389Rxyl_2530

FNU：FN0495

BGA：BG0110(fadA)

BAF：BAPKO_0110(fadA)

LIL：LA0457(thiL1)LA0828(thiL2)LA4139(fadA)

LIC：LIC10396(phbA)

LBJ：LBJ_2862(paaJ-4)

LBL：LBL_0209(paaJ-4)

SYN：slr1993(phaA)

SRU：SRU_1211(atoB)SRU_1547

CHU：CHU_1910(atoB)

GFO：GFO_1507(atoB)

FJO：Fjoh_4612

FPS：FP0770FP1586FP1725

RRS：RoseRS_3911RoseRS_4348

RCA：Rcas_0702Rcas_3206

HAU：Haur_0522

DRA：DR_1072DR_1428DR_1960DR_2480DR_A0053

DGE：Dgeo_0755Dgeo_1305Dgeo_1441Dgeo_1883

TTH：TTC0191TTC0330

TTJ：TTHA0559

TME：Tmel_1134

FNO：Fnod_0314

PMO：Pmob_0515

HMA：rrnAC0896(acaB3)rrnAC2815(aca2)rrnAC3497(yqeF) rrnB0240(aca1)rrnB0242(acaB2)rrnB0309(acaB1)

TAC：Ta0582

TVO：TVN0649

PTO：PTO1505

APE：APE_2108

SSO：SSO2377(acaB_4)

STO：ST0514

SAI：Saci_0963Saci_1361(acaB1)

MSE：Msed_0656

PAI：PAE1220

PIS：Pisl_0029Pisl_1301

PCL：Pcal_0781

PAS：Pars_0309Pars_1071

CMA：Cmaq_1941

示例性HMG-CoA合酶核酸和多肽

HSA：3157(HMGCS1)3158(HMGCS2)

PTR：457169(HMGCS2)461892(HMGCS1)

MCC：702553(HMGCS1)713541(HMGCS2)

MMU：15360(Hmgcs2)208715(Hmgcs1)

RNO：24450(Hmgcs2)29637(Hmgcs1)

CFA：479344(HMGCS1)607923(HMGCS2)

BTA：407767(HMGCS1)

SSC：397673(CH242-38B5.1)

GGA：396379(HMGCS1)

XLA：380091(hmgcs1)447204(MGC80816)

DRE：394060(hmgcs1)

SPU：578259(LOC578259)

DME：Dmel_CG4311(Hmgs)

CEL：F25B4.6

ATH：AT4G11820(BAP1)

OSA：43314184347614

CME：CMM189C

SCE：YML126C(ERG13)

AGO：AGOS_ADL356C

PIC：PICST_83020

CAL：CaO19_7312(CaO19.7312)

CGR：CAGL0H04081g

SPO：SPAC4F8.14c(hcs)

MGR：MGG_01026

ANI：AN4923.2

AFM：AFUA_3G10660AFUA_8G07210

AOR：AO090003000611AO090010000487

CNE：CNC05080CNG02670

UMA：UM05362.1

ECU：ECU10_0510

DDI：DDBDRAFT_0217522DDB_0219924(hgsA)

TET：TTHERM_00691190

TBR：Tb927.8.6110

YPE：YPO1457

YPK：y2712(pksG)

YPM：YP_1349(pksG)

YPA：YPA_0750

YPN：YPN_2521

YPP：YPDSF_1517

YPS：YPTB1475

CBD：COXBU7E912_1931

TCX：Tcr_1719

DNO：DNO_0799

BMA：BMAA1212

BPS：BPSS1002

BPM：BURPS1710b_A2613

BPL：BURPS1106A_A1384

BPD：BURPS668_A1470

BTE：BTH_II1670

MXA：MXAN_3948(tac)MXAN_4267(mvaS)

BSU：BG10926(pksG)

OIH：OB2248

SAU：SA2334(mvaS)

SAV：SAV2546(mvaS)

SAM：MW2467(mvaS)

SAR：SAR2626(mvaS)

SAS：SAS2432

SAC：SACOL2561

SAB：SAB2420(mvaS)

SAA：SAUSA300_2484

SAO：SAOUHSC_02860

SAJ：SaurJH9_2569

SAH：SaurJH1_2622

SEP：SE2110

SER：SERP2122

SHA：SH0508(mvaS)

SSP：SSP0324

LMO：lmo1415

LMF：LMOf2365_1434(mvaS)

LIN：lin1454

LWE：lwe1432(mvaS)

LLA：L13187(hmcM)

LLC：LACR_1666

LLM：llmg_0929(hmcM)

SPY：SPy_0881(mvaS.2)

SPZ：M5005_Spy_0687(mvaS.1)

SPM：spyM18_0942(mvaS2)

SPG：SpyM3_0600(mvaS.2)

SPS：SPs1253

SPH：MGAS10270_Spy0745(mvaS1)

SPI：MGAS10750_Spy0779(mvaS1)

SPJ：MGAS2096_Spy0759(mvaS1)

SPK：MGAS9429_Spy0743(mvaS1)

SPF：SpyM51121(mvaS)

SPA：M6_Spy0704

SPB：M28_Spy0667(mvaS.1)

SPN：SP_1727

SPR：spr1571(mvaS)

SPD：SPD_1537(mvaS)

SAG：SAG1316

SAN：gbs1386

SAK：SAK_1347

SMU：SMU.943c

STC：str0577(mvaS)

STL：stu0577(mvaS)

STE：STER_0621

SSA：SSA_0338(mvaS)

SSU：SSU05_1641

SSV：SSU98_1652

SGO：SGO_0244

LPL：lp_2067(mvaS)

LJO：LJ1607

LAC：LBA0628(hmcS)

LSA：LSA1484(mvaS)

LSL：LSL_0526

LDB：Ldb0881(mvaS)

LBU：LBUL_0806

LBR：LVIS_1363

LCA：LSEI_1785

LGA：LGAS_1372

LRE：Lreu_0676

PPE：PEPE_0868

EFA：EF1363

OOE：OEOE_0968

LME：LEUM_1184

NFA：nfa22120

SEN：SACE_4570(pksG)

BBU：BB0683

BGA：BG0706

BAF：BAPKO_0727

FJO：Fjoh_0678

HAL：VNG1615G(mvaB)

HMA：rrnAC1740(mvaS)

HWA：HQ2868A(mvaB)

NPH：NP2608A(mvaB_1)NP4836A(mvaB_2)

示例性羟甲基戊二酰-CoA还原酶核酸和多肽

HSA：3156(HMGCR)

PTR：471516(HMGCR)

MCC：705479(HMGCR)

MMU：15357(Hmgcr)

RNO：25675(Hmgcr)

CFA：479182(HMGCR)

BTA：407159(HMGCR)

GGA：395145(RCJMB04_14m24)

SPU：373355(LOC373355)

DME：Dmel_CG10367(Hmgcr)

CEL：F08F8.2

OSA：4347443

SCE：YLR450W(HMG2)YML075C(HMG1)

AGO：AGOS_AER152W

CGR：CAGL0L11506g

SPO：SPCC162.09c(hmg1)

ANI：AN3817.2

AFM：AFUA_1G11230AFUA_2G03700

AOR：AO090103000311AO090120000217

CNE：CNF04830

UMA：UM03014.1

ECU：ECU10_1720

DDI：DDB_0191125(hmgA)DDB_0215357(hmgB)

TBR：Tb927.6.4540

TCR：506831.40509167.20

LMA：LmjF30.3190

VCH：VCA0723

VCO：VC0395_0662

VVU：VV2_0117

VVY：VVA0625

VPA：VPA0968

VFI：VFA0841

PAT：Patl_0427

CBU：CBU_0030CBU_0610

CBD：COXBU7E912_0151COXBU7E912_0622(hmgA)

TCX：Tcr_1717

DNO：DNO_0797

CVI：CV_1806

SUS：Acid_5728Acid_6132

SAU：SA2333(mvaA)

SAV：SAV2545(mvaA)

SAM：MW2466(mvaA)

SAB：SAB2419c(mvaA)

SEP：SE2109

LWE：lwe0819(mvaA)

LLA：L10433(mvaA)

LLC：LACR_1664

LLM：llmg_0931(mvaA)

SPY：SPy_0880(mvaS.1)

SPM：spyM18_0941(mvaS1)

SPG：SpyM3_0599(mvaS.1)

SPS：SPs1254

SPH：MGAS10270_Spy0744

SPI：MGAS10750_Spy0778

SPJ：MGAS2096_Spy0758

SPK：MGAS9429_Spy0742

SPA：M6_Spy0703

SPN：SP_1726

SAG：SAG1317

SAN：gbs1387

STC：str0576(mvaA)

STL：stu0576(mvaA)

STE：STER_0620

SSA：SSA_0337(mvaA)

LPL：lp_0447(mvaA)

LJO：LJ1608

LSL：LSL_0224

LBR：LVIS_0450

LGA：LGAS_1373

EFA：EF1364

NFA：nfa22110

BGA：BG0708(mvaA)

SRU：SRU_2422

FPS：FP2341

MMP：MMP0087(hmgA)

MMQ：MmarC5_1589

MAC：MA3073(hmgA)

MBA：Mbar_A1972

MMA：MM_0335

MBU：Mbur_1098

MHU：Mhun_3004

MEM：Memar_2365

MBN：Mboo_0137

MTH：MTH562

MST：Msp_0584(hmgA)

MSI：Msm_0227

MKA：MK0355(HMG1)

AFU：AF1736(mvaA)

HAL：VNG1875G(mvaA)

HMA：rrnAC3412(mvaA)

HWA：HQ3215A(hmgR)

NPH：NP0368A(mvaA_2)NP2422A(mvaA_1)

TAC：Ta0406m

TVO：TVN1168

PTO：PTO1143

PAB：PAB2106(mvaA)

PFU：PF1848

TKO：TK0914

RCI：RCIX1027(hmgA)RCIX376(hmgA)

APE：APE_1869

IHO：Igni_0476

HBU：Hbut_1531

SSO：SSO0531

STO：ST1352

SAI：Saci_1359

PAI：PAE2182

PIS：Pisl_0814

PCL：Pcal_1085

PAS：Pars_0796

示例性甲羟戊酸激酶核酸和多肽

HSA：4598(MVK)

MCC：707645(MVK)

MMU：17855(Mvk)

RNO：81727(Mvk)

CFA：486309(MVK)

BTA：505792(MVK)

GGA：768555(MVK)

DRE：492477(zgc：103473)

SPU：585785(LOC585785)

DME：Dmel_CG33671

OSA：4348331

SCE：YMR208W(ERG12)

AGO：AGOS_AER335W

PIC：PICST_40742(ERG12)

CGR：CAGL0F03861g

SPO：SPAC13G6.11c

MGR：MGG_06946

ANI：AN3869.2

AFM：AFUA_4G07780

AOR：AO090023000793

CNE：CNK01740

ECU：ECU09_1780

DDI：DDBDRAFT_0168621

TET：TTHERM_00637680

TBR：Tb927.4.4070

TCR：436521.9509237.10

LMA：LmjF31.0560

CBU：CBU_0608CBU_0609

CBD：COXBU7E912_0620(mvk)

LPN：lpg2039

LPF：lpl2017

LPP：lpp2022

BBA：Bd1027(lmbP)Bd1630(mvk)

MXA：MXAN_5019(mvk)

OIH：OB0225

SAU：SA0547(mvaK1)

SAV：SAV0590(mvaK1)

SAM：MW0545(mvaK1)

SAR：SAR0596(mvaK1)

SAS：SAS0549

SAC：SACOL0636(mvk)

SAB：SAB0540(mvaK1)

SAA：SAUSA300_0572(mvk)

SAO：SAOUHSC_00577

SEP：SE0361

SER：SERP0238(mvk)

SHA：SH2402(mvaK1)

SSP：SSP2122

LMO：lmo0010

LMF：LMOf2365_0011

LIN：lin0010

LWE：lwe0011(mvk)

LLA：L7866(yeaG)

LLC：LACR_0454

LLM：llmg_0425(mvk)

SPY：SPy_0876(mvaK1)

SPZ：M5005_Spy_0682(mvaK1)

SPM：spyM18_0937(mvaK1)

SPG：SpyM3_0595(mvaK1)

SPS：SPs1258

SPH：MGAS10270_Spy0740(mvaK1)

SPI：MGAS10750_Spy0774(mvaK1)

SPJ：MGAS2096_Spy0753(mvaK1)

SPK：MGAS9429_Spy0737(mvaK1)

SPF：SpyM51126(mvaK1)

SPA：M6_Spy0699

SPB：M28_Spy0662(mvaK1)

SPN：SP_0381

SPR：spr0338(mvk)

SPD：SPD_0346(mvk)

SAG：SAG1326

SAN：gbs1396

SAK：SAK_1357(mvk)

SMU：SMU.181

STC：str0559(mvaK1)

STL：stu0559(mvaK1)

STE：STER_0598

SSA：SSA_0333(mvaK1)

SSU：SSU05_0289

SSV：SSU98_0285

SGO：SGO_0239(mvk)

LPL：lp_1735(mvaK1)

LJO：LJ1205

LAC：LBA1167(mvaK)

LSA：LSA0908(mvaK1)

LSL：LSL_0685(eRG)

LDB：Ldb0999(mvk)

LBU：LBUL_0906

LBR：LVIS_0858

LCA：LSEI_1491

LGA：LGAS_1033

LRE：Lreu_0915

PPE：PEPE_0927

EFA：EF0904(mvk)

OOE：OEOE_1100

LME：LEUM_1385

NFA：nfa22070

BGA：BG0711

BAF：BAPKO_0732

FPS：FP0313

MMP：MMP1335

MAE：Maeo_0775

MAC：MA0602(mvk)

MBA：Mbar_A1421

MMA：MM_1762

MBU：Mbur_2395

MHU：Mhun_2890

MEM：Memar_1812

MBN：Mboo_2213

MST：Msp_0858(mvk)

MSI：Msm_1439

MKA：MK0993(ERG12)

HAL：VNG1145G(mvk)

HMA：rrnAC0077(mvk)

HWA：HQ2925A(mvk)

NPH：NP2850A(mvk)

PTO：PTO1352

PHO：PH1625

PAB：PAB0372(mvk)

PFU：PF1637(mvk)

TKO：TK1474

RCI：LRC399(mvk)

APE：APE_2439

HBU：Hbut_0877

SSO：SSO0383

STO：ST2185

SAI：Saci_2365(mvk)

MSE：Msed_1602

PAI：PAE3108

PIS：Pisl_0467

PCL：Pcal_1835

示例性磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽

HSA：10654(PMVK)

PTR：457350(PMVK)

MCC：717014(PMVK)

MMU：68603(Pmvk)

CFA：612251(PMVK)

BTA：513533(PMVK)

DME：Dmel_CG10268

ATH：AT1G31910

OSA：4332275

SCE：YMR220W(ERG8)

AGO：AGOS_AER354W

PIC：PICST_52257(ERG8)

CGR：CAGL0F03993g

SPO：SPAC343.01c

MGR：MGG_05812

ANI：AN2311.2

AFM：AFUA_5G10680

AOR：AO090010000471

CNE：CNM00100

UMA：UM00760.1

DDI：DDBDRAFT_0184512

TBR：Tb09.160.3690

TCR：507913.20508277.140

LMA：LmjF15.1460

MXA：MXAN_5017

OIH：OB0227

SAU：SA0549(mvaK2)

SAV：SAV0592(mvaK2)

SAM：MW0547(mvaK2)

SAR：SAR0598(mvaK2)

SAS：SAS0551

SAC：SACOL0638

SAB：SAB0542(mvaK2)

SAA：SAUSA300_0574

SAO：SAOUHSC_00579

SAJ：SaurJH9_0615

SEP：SE0363

SER：SERP0240

SHA：SH2400(mvaK2)

SSP：SSP2120

LMO：lmo0012

LMF：LMOf2365_0013

LIN：lin0012

LWE：lwe0013

LLA：L10014(yebA)

LLC：LACR_0456

LLM：llmg_0427

SPY：SPy_0878(mvaK2)

SPZ：M5005_Spy_0684(mvaK2)

SPM：spyM18_0939

SPG：SpyM3_0597(mvaK2)

SPS：SPs1256

SPH：MGAS10270_Spy0742(mvaK2)

SPI：MGAS10750_Spy0776(mvaK2)

SPJ：MGAS2096_Spy0755(mvaK2)

SPK：MGAS9429_Spy0739(mvaK2)

SPF：SpyM51124(mvaK2)

SPA：M6_Spy0701

SPB：M28_Spy0664(mvaK2)

SPN：SP_0383

SPR：spr0340(mvaK2)

SPD：SPD_0348(mvaK2)

SAG：SAG1324

SAN：gbs1394

SAK：SAK_1355

SMU：SMU.938

STC：str0561(mvaK2)

STL：stu0561(mvaK2)

STE：STER_0600

SSA：SSA_0335(mvaK2)

SSU：SSU05_0291

SSV：SSU98_0287

SGO：SGO_0241

LPL：lp_1733(mvaK2)

LJO：LJ1207

LAC：LBA1169

LSA：LSA0906(mvaK2)

LSL：LSL_0683

LDB：Ldb0997(mvaK)

LBU：LBUL_0904

LBR：LVIS_0860

LCA：LSEI_1092

LGA：LGAS_1035

LRE：Lreu_0913

PPE：PEPE_0925

EFA：EF0902

NFA：nfa22090

BGA：BG0710

BAF：BAPKO_0731

NPH：NP2852A

SSO：SSO2988

STO：ST0978

SAI：Saci_1244

示例性二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽

HSA：4597(MVD)

PTR：468069(MVD)

MCC：696865(MVD)

MMU：192156(Mvd)

RNO：81726(Mvd)

CFA：489663(MVD)

GGA：425359(MVD)

DME：Dmel_CG8239

SCE：YNR043W(MVD1)

AGO：AGOS_AGL232C

PIC：PICST_90752

CGR：CAGL0C03630g

SPO：SPAC24C9.03

MGR：MGG_09750

ANI：AN4414.2

AFM：AFUA_4G07130

AOR：AO090023000862

CNE：CNL04950

UMA：UM05179.1

DDI：DDBDRAFT_0218058

TET：TTHERM_00849200

TBR：Tb10.05.0010Tb10.61.2745

TCR：507993.330511281.40

LMA：LmjF18.0020

CBU：CBU_0607(mvaD)

CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)

LPN：lpg2040

LPF：lpl2018

LPP：lpp2023

TCX：Tcr_1734

DNO：DNO_0504(mvaD)

BBA：Bd1629

MXA：MXAN_5018(mvaD)

OIH：OB0226

SAU：SA0548(mvaD)

SAV：SAV0591(mvaD)

SAM：MW0546(mvaD)

SAR：SAR0597(mvaD)

SAS：SAS0550

SAC：SACOL0637(mvaD)

SAB：SAB0541(mvaD)

SAA：SAUSA300_0573(mvaD)

SAO：SAOUHSC_00578

SAJ：SaurJH9_0614

SAH：SaurJH1_0629

SEP：SE0362

SER：SERP0239(mvaD)

SHA：SH2401(mvaD)

SSP：SSP2121

LMO：lmo0011

LMF：LMOf2365_0012(mvaD)

LIN：lin0011

LWE：lwe0012(mvaD)

LLA：L9089(yeaH)

LLC：LACR_0455

LLM：llmg_0426(mvaD)

SPY：SPy_0877(mvaD)

SPZ：M5005_Spy_0683(mvaD)

SPM：spyM18_0938(mvd)

SPG：SpyM3_0596(mvaD)

SPS：SPs1257

SPH：MGAS10270_Spy0741(mvaD)

SPI：MGAS10750_Spy0775(mvaD)

SPJ：MGAS2096_Spy0754(mvaD)

SPK：MGAS9429_Spy0738(mvaD)

SPF：SpyM51125(mvaD)

SPA：M6_Spy0700

SPB：M28_Spy0663(mvaD)

SPN：SP_0382

SPR：spr0339(mvd1)

SPD：SPD_0347(mvaD)

SAG：SAG1325(mvaD)

SAN：gbs1395

SAK：SAK_1356(mvaD)

SMU：SMU.937

STC：str0560(mvaD)

STL：stu0560(mvaD)

STE：STER_0599

SSA：SSA_0334(mvaD)

SSU：SSU05_0290

SSV：SSU98_0286

SGO：SGO_0240(mvaD)

LPL：lp_1734(mvaD)

LJO：LJ1206

LAC：LBA1168(mvaD)

LSA：LSA0907(mvaD)

LSL：LSL_0684

LDB：Ldb0998(mvaD)

LBU：LBUL_0905

LBR：LVIS_0859

LCA：LSEI_1492

LGA：LGAS_1034

LRE：Lreu_0914

PPE：PEPE_0926

EFA：EF0903(mvaD)

LME：LEUM_1386

NFA：nfa22080

BBU：BB0686

BGA：BG0709

BAF：BAPKO_0730

GFO：GFO_3632

FPS：FP0310(mvaD)

HAU：Haur_1612

HAL：VNG0593G(dmd)

HMA：rrnAC1489(dmd)

HWA：HQ1525A(mvaD)

NPH：NP1580A(mvaD)

PTO：PTO0478PTO1356

SSO：SSO2989

STO：ST0977

SAI：Saci_1245(mvd)

MSE：Msed_1576

示例性异戊烯磷酸激酶(IPK)核酸和多肽

Methanobacteriumthermoautotrophicumgi|2621082

MethanococcusjannaschiiDSM2661gi|1590842；

Methanocaldococcusjannaschiigi|1590842

Methanothermobacterthermautotrophicusgi|2621082

PicrophilustorridusDSM9790(IG-57)gi|48477569

Pyrococcusabyssigi|14520758

PyrococcushorikoshiiOT3gi|3258052

ArchaeoglobusfulgidusDSM4304gi|2648231

示例性异戊烯基二磷酸δ异构酶(IDI)核酸和多肽

HSA：3422(IDI1)91734(IDI2)

PTR：450262(IDI2)450263(IDI1)

MCC：710052(LOC710052)721730(LOC721730)

MMU：319554(Idi1)

RNO：89784(Idi1)

GGA：420459(IDI1)

XLA：494671(LOC494671)

XTR：496783(idi2)

SPU：586184(LOC586184)

CEL：K06H7.9(idi-1)

ATH：AT3G02780(IPP2)

OSA：43387914343523

CME：CMB062C

SCE：YPL117C(IDI1)

AGO：AGOS_ADL268C

PIC：PICST_68990(IDI1)

CGR：CAGL0J06952g

SPO：SPBC106.15(idi1)

ANI：AN0579.2

AFM：AFUA_6G11160

AOR：AO090023000500

CNE：CNA02550

UMA：UM04838.1

ECU：ECU02_0230

DDI：DDB_0191342(ipi)

TET：TTHERM_00237280TTHERM_00438860

TBR：Tb09.211.0700

TCR：408799.19510431.10

LMA：LmjF35.5330

EHI：46.t00025

ECO：b2889(idi)

ECJ：JW2857(idi)

ECE：Z4227

ECS：ECs3761

ECC：c3467

ECI：UTI89_C3274

ECP：ECP_2882

ECV：APECO1_3638

ECW：EcE24377A_3215(idi)

ECX：EcHS_A3048

STY：STY3195

STT：t2957

SPT：SPA2907(idi)

SEC：SC2979(idi)

STM：STM3039(idi)

SFL：SF2875(idi)

SFX：S3074

SFV：SFV_2937

SSN：SSON_3042SSON_3489(yhfK)

SBO：SBO_3103

SDY：SDY_3193

ECA：ECA2789

PLU：plu3987

ENT：Ent638_3307

SPE：Spro_2201

VPA：VPA0278

VFI：VF0403

PPR：PBPRA0469(mvaD)

PEN：PSEEN4850

CBU：CBU_0607(mvaD)

CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)

LPN：lpg2051

LPF：lpl2029

LPP：lpp2034

TCX：Tcr_1718

HHA：Hhal_1623

DNO：DNO_0798

EBA：ebA5678p2A143

DVU：DVU1679(idi)

DDE：Dde_1991

LIP：LI1134

BBA：Bd1626

AFW：Anae109_4082

MXA：MXAN_5021(fni)

RPR：RP452

RTY：RT0439(idi)

RCO：RC0744

RFE：RF_0785(fni)

RBE：RBE_0731(fni)

RAK：A1C_04190

RBO：A1I_04755

RCM：A1E_02555

RRI：A1G_04195

MLO：mlr6371

RET：RHE_PD00245(ypd00046)

XAU：Xaut_4134

SIL：SPO0131

SIT：TM1040_3442

RSP：RSP_0276

RSH：Rsph17029_1919

RSQ：Rsph17025_1019

JAN：Jann_0168

RDE：RD1_0147(idi)

DSH：Dshi_3527

BSU：BG11440(ypgA)

BAN：BA1520

BAR：GBAA1520

BAA：BA_2041

BAT：BAS1409

BCE：BC1499

BCA：BCE_1626

BCZ：BCZK1380(fni)

BCY：Bcer98_1222

BTK：BT9727_1381(fni)

BTL：BALH_1354

BLI：BL02217(fni)

BLD：BLi02426

BAY：RBAM_021020(fni)

BPU：BPUM_2020(fni)

OIH：OB0537

SAU：SA2136(fni)

SAV：SAV2346(fni)

SAM：MW2267(fni)

SAR：SAR2431(fni)

SAS：SAS2237

SAC：SACOL2341(fni)

SAB：SAB2225c(fni)

SAA：SAUSA300_2292(fni)

SAO：SAOUHSC_02623

SEP：SE1925

SER：SERP1937(fni-2)

SHA：SH0712(fni)

SSP：SSP0556

LMO：lmo1383

LMF：LMOf2365_1402(fni)

LIN：lin1420

LWE：lwe1399(fni)

LLA：L11083(yebB)

LLC：LACR_0457

LLM：llmg_0428(fni)

SPY：SPy_0879

SPZ：M5005_Spy_0685

SPM：spyM18_0940

SPG：SpyM3_0598

SPS：SPs1255

SPH：MGAS10270_Spy0743

SPI：MGAS10750_Spy0777

SPJ：MGAS2096_Spy0756

SPK：MGAS9429_Spy0740

SPF：SpyM51123(fni)

SPA：M6_Spy0702

SPB：M28_Spy0665

SPN：SP_0384

SPR：spr0341(fni)

SPD：SPD_0349(fni)

SAG：SAG1323

SAN：gbs1393

SAK：SAK_1354(fni)

SMU：SMU.939

STC：str0562(idi)

STL：stu0562(idi)

STE：STER_0601

SSA：SSA_0336

SGO：SGO_0242

LPL：lp_1732(idi1)

LJO：LJ1208

LAC：LBA1171

LSA：LSA0905(idi)

LSL：LSL_0682

LDB：Ldb0996(fni)

LBU：LBUL_0903

LBR：LVIS_0861

LCA：LSEI_1493

LGA：LGAS_1036

LRE：Lreu_0912

EFA：EF0901

OOE：OEOE_1103

STH：STH1674

CBE：Cbei_3081

DRM：Dred_0474

SWO：Swol_1341

MTA：Moth_1328

MTU：Rv1745c(idi)

MTC：MT1787(idi)

MBO：Mb1774c(idi)

MBB：BCG_1784c(idi)

MPA：MAP3079c

MAV：MAV_3894(fni)

MSM：MSMEG_1057(fni)MSMEG_2337(fni)

MUL：MUL_0380(idi2)

MVA：Mvan_1582Mvan_2176

MGI：Mflv_1842Mflv_4187

MMC：Mmcs_1954

MKM：Mkms_2000

MJL：Mjls_1934

CGL：NCgl2223(cgl2305)

CGB：cg2531(idi)

CEF：CE2207

CDI：DIP1730(idi)

NFA：nfa19790nfa22100

RHA：RHA1_ro00239

SCO：SCO6750(SC5F2A.33c)

SMA：SAV1663(idi)

LXX：Lxx23810(idi)

CMI：CMM_2889(idiA)

AAU：AAur_0321(idi)

PAC：PPA2115

FRA：Francci3_4188

FRE：Franean1_5570

FAL：FRAAL6504(idi)

KRA：Krad_3991

SEN：SACE_2627(idiB_2)SACE_5210(idi)

STP：Strop_4438

SAQ：Sare_4564Sare_4928

RXY：Rxyl_0400

BBU：BB0684

BGA：BG0707

SYN：sll1556

SYC：syc2161_c

SYF：Synpcc7942_1933

CYA：CYA_2395(fni)

CYB：CYB_2691(fni)

TEL：tll1403

ANA：all4591

AVA：Ava_2461Ava_B0346

TER：Tery_1589

SRU：SRU_1900(idi)

CHU：CHU_0674(idi)

GFO：GFO_2363(idi)

FJO：Fjoh_0269

FPS：FP1792(idi)

CTE：CT0257

CCH：Cag_1445

CPH：Cpha266_0385

PVI：Cvib_1545

PLT：Plut_1764

RRS：RoseRS_2437

RCA：Rcas_2215

HAU：Haur_4687

DRA：DR_1087

DGE：Dgeo_1381

TTH：TT_P0067

TTJ：TTHB110

MJA：MJ0862

MMP：MMP0043

MMQ：MmarC5_1637

MMX：MmarC6_0906

MMZ：MmarC7_1040

MAE：Maeo_1184

MVN：Mevan_1058

MAC：MA0604(idi)

MBA：Mbar_A1419

MMA：MM_1764

MBU：Mbur_2397

MTP：Mthe_0474

MHU：Mhun_2888

MLA：Mlab_1665

MEM：Memar_1814

MBN：Mboo_2211

MTH：MTH48

MST：Msp_0856(fni)

MSI：Msm_1441

MKA：MK0776(lldD)

AFU：AF2287

HAL：VNG1818G(idi)VNG6081G(crt_1)VNG6445G(crt_2)VNG7060 VNG7149

HMA：rrnAC3484(idi)

HWA：HQ2772A(idiA)HQ2847A(idiB)

NPH：NP0360A(idiB_1)NP4826A(idiA)NP5124A(idiB_2)

TAC：Ta0102

TVO：TVN0179

PTO：PTO0496

PHO：PH1202

PAB：PAB1662

PFU：PF0856

TKO：TK1470

RCI：LRC397(fni)

APE：APE_1765.1

SMR：Smar_0822

IHO：Igni_0804

HBU：Hbut_0539

SSO：SSO0063

STO：ST2059

SAI：Saci_0091

MSE：Msed_2136

PAI：PAE0801

PIS：Pisl_1093

PCL：Pcal_0017

PAS：Pars_0051

TPE：Tpen_0272

示例性异戊二烯合酶核酸和多肽

Genbank登录号

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AY316691

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