酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶B5TRAP5B的底物的用途.pdf

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1、10申请公布号CN102007411A43申请公布日20110406CN102007411ACN102007411A21申请号200980113346X22申请日200904080806801720080415GB0815105220080819GBG01N33/53200601C12Q1/4220060171申请人伊姆诺诊断系统有限公司地址英国泰恩外恩72发明人B休斯敦D劳里J哈伦74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人李华英54发明名称酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶B5TRAP5B的底物的用途57摘要本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸。

2、酶TRAP的底物的用途。在用于测量受试者样本中TRAP5B的量的测定中使用所述底物，所述TRAP5B的量作为骨吸收率的指标，以及因此作为类似病况，例如骨质疏松的指标。本发明也提供了包含酞类化合物的单磷酸酯和任选包含结合总TRAP的抗体的试剂盒，以及方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010101586PCT申请的申请数据PCT/GB2009/0503442009040887PCT申请的公布数据WO2009/127855EN2009102251INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书15页附图3页CN102007424A1/4页21酞类化合物的。

3、单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5BTRAP5B的底物的用途。2用于测量样本中TRAP5B的量的方法，所述方法包括使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性。3用于测量受试者中骨吸收率的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中TRAP5B的量，其中存在于样本中的TRAP5B的量反映了骨吸收率。4诊断受试者中与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量，其中TRAP5B的非正常量是患者患有该障碍的指示。5监测用于预防或治疗与骨。

4、吸收率的变化相关的障碍的药物在服用该药物的受试者中的效果的方法，所述方法包括A通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量；和B将TRAP5B在上述样本中的量与TRAP5B在对照样本中的量进行比较。6筛选受试者对与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量，其中TRAP5B的非正常量表明对这类障碍的易感性。7根据权利要求2至6任一项的方法，所述方法包括A将样本中存在的TRAP与结合总TRAPTRAP5A和TRAP5B的抗体结合；和B通。

5、过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定与所述抗体结合的TRAP5B的活性而测量样本中TRAP5B的量。8根据权利要求2至7任一项的方法，其中TRAP5B活性的测定步骤在PH68至76，优选PH68至74，最优选PH7进行。9根据权利要求2至8任一项的方法，其中通过测量TRAP5B活性后样本颜色而测量TRAP5B的量。10根据权利要求1至9任一项的方法，其中测定样本中TRAP5B的活性的步骤包括如下连续的步骤E温育酞类化合物的单磷酸酯和样本以使TRAP5B代谢底物；F停止代谢；G任选地调节样本的PH；H测量由于被TRAP5B代谢而导致的底物的特征变化。11根据权利要求9或10的方法，其中使用分光。

6、光度计测量样本的颜色。12根据权利要求2至10任一项的方法，所述方法还包括通过将任一项权利要求中所得的TRAP5B的测量值与校正标准或曲线比较而得到存在于样本中的TRAP5B的量的绝对值。13根据权利要求2至11任一项的方法，其中TRAP5B活性的测定步骤在固体基质上进行，优选平台、多孔板或阵列。14根据权利要求13的方法，其中所述平台是自动化的。15根据权利要求13或14的方法，其中所述自动化平台包括磁珠。16用于实施根据任一项权利要求的方法的试剂盒，所述试剂盒包含酞类化合物的单磷酸酯和任选地包含结合总TRAP的抗体。权利要求书CN102007411ACN102007424A2/4页317酞。

7、类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP5B的底物而用作骨吸收的指示物的用途。18根据权利要求17的用途，其用于根据权利要求1至15任一项的方法中。19根据权利要求16的用途，所述用途包括将所述单磷酸酯与受试者的样本接触，随后测量样本的颜色。20根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是酚酞或磺酞。21根据权利要求19的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是苯酚磺酞。22根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物是具有式I的化合物其中A是取代或未经取代的O磷酰化的对苯酚；B是取代或未经取代的对苯酚磷酸酯；X是CO或SO2；R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5。

8、、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；并且R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；其中N是0、1或2；R5和R6各自独立地是氢或R7；并且R7选自烃基、CH2K杂环基、CH2KCO杂环基，其中的任意基团任选地被1。

9、、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、COOH和其酯例如COC16烷基、亚磷酰胺、C16烷基和C16烷氧基的取代基取代；并且K是0、1、2、3、4、5或6；或者权利要求书CN102007411ACN102007424A3/4页4其中X是CO或SO2；R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、。

10、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；各R8选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；各R9选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；各R10选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；并且各R11选自氢、卤素、三氟甲基。

11、、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；其中N是0、1或2；R5和R6各自独立地是氢或R7；并且R7选自烃基、CH2K杂环基、CH2KCO杂环基，其中的任意基团任选被1、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、COOH和其酯例如COC16烷基、亚磷酰胺、C16烷基和C16烷氧基的取代基取代；并且K是0、1、2、3、4、5或6。23根据前述权利要求任一项的用途、方法或试剂盒，其中酞类化合物的单磷酸酯选自酚酞单磷酸酯、甲酚酞单磷酸酯、百里酚酞单磷酸酯、邻氯酚酞单磷酸酯、苯酚磺酞单磷酸酯、邻甲酚磺酞单磷酸酯、间甲酚紫单磷酸酯、溴甲。

12、酚紫单磷酸酯、溴甲酚绿单磷酸酯、溴酚权利要求书CN102007411ACN102007424A4/4页5蓝单磷酸酯、百里酚蓝单磷酸酯、溴百里酚蓝单磷酸酯、二甲苯酚蓝单磷酸酯和氯酚红单磷酸酯。权利要求书CN102007411ACN102007424A1/15页6酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶B5TRAP5B的底物的用途技术领域0001本发明涉及酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶TARTRATERESISTANTACIDPHOSPHATASE，TRAP，优选TRAP5B的底物的用途。本发明也涉及测量在受试者样本中作为骨吸收率指标的TRAP5B的量，以及与其相关的方法。本发明也提。

13、供了酞类化合物的单磷酸酯在测量样本中TRAP5B中的用途，和实施本发明的方法的试剂盒。背景技术0002骨由2种主要的细胞类型组成负责形成骨的成骨细胞和负责破坏吸收骨的破骨细胞。破骨细胞是进入矿化骨，将其破坏为其组成部分的多核细胞。吸收过程包括破骨细胞向骨单位的附着。然后破骨细胞引发其细胞膜的内摺，并分泌胶原酶和其它在吸收过程中重要的酶。由于骨被吸收，高水平的钙、镁、磷酸根和胶原的产物被释放到细胞外液。通常成骨细胞和破骨细胞处于平衡中，以使吸收的骨的量和形成的骨的量相同。在童年，骨形成超过吸收，但随年龄增长，吸收超过形成。0003已知若干医学病况与骨吸收率的变化相关，可能最广泛存在的是骨质疏松。。

14、这种特定病况被认为是破骨细胞活性增加的结果，其特别是在绝经后妇女中导致骨量减少。这导致骨的弱化并增加了对骨折的易感性。该年龄组的妇女中骨折可能是潜在严重的，由骨质疏松引起的这些和其它症状的治疗是昂贵的并需要医学专业。长期以来对那些易患骨质疏松的人的诊断被认为是重要的，以预防这种病况的潜在严重后果。已日益通过例如雌性激素替代治疗或双膦酸酯治疗成功治疗骨质疏松。0004骨质疏松或其易感性的指标是测量受试者中骨密度，其中低的骨密度暗示骨吸收过量，因此有骨质疏松或其它病况的可能。由于该组人群被认为是重要的商业市场，特别是在西方国家，已发展了很多方法和仪器以测量骨密度。其中，以那些特异性、快速和廉价的为。

15、人所欢迎。0005根据其电泳迁移率，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP属于酸性磷酸酶的5型种类。它是已鉴定的7种酸性磷酸酶中酸性最强的，并且是唯一一种抵抗酒石酸引起的抑制的酸性磷酸酶。TRAP是一种在分子的活性位点含有自旋偶联铁单位的碱性糖蛋白。TRAP的双核铁单位含有2个高铁离子，其使蛋白质呈紫色，因此它也被称为紫色酸性磷酸酶。这种蛋白有32KD的分子量。当酶被例如巯基乙醇还原，其中一个高铁离子被还原，酶变为粉红色。TRAP在体外可以作为蛋白酪氨酸磷酸酶起作用，其氨基酸序列含有与磷蛋白磷酸酶同源的区域。但是，TRAP的天然底物依然是未知的。0006若干研究已涉及在骨吸收过程中的TRAP。小鼠中TRA。

16、P基因的破坏HAYMAN，ARETALDEVELOPMENT12231513162，1996导致软骨内骨化被破坏和轻度骨质疏松，其暗示TRAP通过对骨基质吸收的关键作用在骨发展、保持成年骨的完整性和更新中对于软骨正常的矿化是必需的。说明书CN102007411ACN102007424A2/15页70007在人类中，已发现存在TRAP的正常细胞仅有破骨细胞和激活的巨噬细胞。已发现在骨吸收期间TRAP被破骨细胞分泌到血液中。因此暗示TRAP在血清中的浓度作为骨吸收的标记，并且已发现TRAP在血清中的浓度与骨吸收率相关KRAENZLINMEETALJOURNALOFCLINICALENDOCRINO。

17、LOGYANDMETABOLISM712442451，1990；CHEUNGCKETALCLINCHEM415679686，1995；CHAMBERLAINPETALCLINCHEM411014951499，1995和HALLEENJETALJOURNALOFBONEANDMINERALRESEARCH111014441452，1996。0008已鉴定出2种TRAP的同工型，TRAP5A和TRAP5BLAMWKWETALCLINCHEM24711051108，1978。TRAP5A在较低最佳PH比TRAP5B更具活性，由此允许对TRAP各同工型的的功能测定。为了测定例如骨吸收率而进行的TRAP。

18、5B血清或血浆的浓度测量中的主要困难，是存在主要由巨噬细胞和树突细胞产生的酶的5A同工型。这两种同工型都是ACP5基因的产物，区别仅在于在翻译后修饰中的变异。TRAP5B缺少某些在TRAP5A中存在的唾液酸残基在蛋白质的糖基团上。所述同工型也在如下方面有所不同氨基酸链的约14个残基片段已经从TRAP5B被蛋白水解切除。另外，核心蛋白是相同的，在单纯免疫学基础上没有区分这两种同工型的方法。因此，商业上存在的TRAP5B免疫测定利用这两种形式之间的生化差异。0009可以通过分光光度计测定TRAP的活性，例如在酒石酸存在时通过给予对硝基苯基磷酸酯PNPP作为底物，酒石酸抑制大多数其它酸性磷酸酶。但是。

19、，该方法特异性不强，因此为了测定TRAP，已发展了更具特异性的方法即免疫测定。已发展了多种使用多克隆抗体的TRAP的测定方法STEPANJJETALBIOCHEM，BIOPHSRESCOMMUN16510271034，1989，KRAENZLINMEETALJOURNALOFCLINICALENDROCRINOLOGYANDMETABOLISM712442451，1990和CHEUNGCKETALCLINCHEM415679686，1995。针对TRAP使用多克隆抗体的研究显示儿童和绝经后妇女具有升高的血清TRAP浓度HALLEENJETALJOURNALOFBONEANDMINERALRES。

20、EARCH111014441452，1996。0010CHAMBERLAINPETALCLINCHEM411014951499，1995描述了针对重组产生的TRAP使用单克隆抗体的测定。0011基于TRAP5B是比总TRAP更具特异性的骨吸收的生化标记的发现，国际专利申请NOWO1999/050662描述了TRAP5B的测定，所述测定在具有确定PH范围的缓冲液中使用普通磷酸酶底物，对硝基苯基磷酸酯PNPP以使5B同工型的活性最大化，而降低TRAP5A的干扰。0012欧洲专利NO1598670描述了适于测量TRAP5B的酸性磷酸酶底物，其中实施例底物之一，2氯4硝基苯基磷酸酯，对TRAP5B相对。

21、TRAP5A的相对活性仅仅比上述WO1999/050662中获得的活性高08倍。0013美国专利NO7,074,903描述了自称相对TRAP5A显示对TRAP5B的特异性的单克隆抗体。但是该抗体显示与重组人TRAP5等效的交叉反应性，这被认为与TRAP5B从人血清中分离相比更类似于天然的TRAP5A。因此，所述测定中的抗体功能特异性在区别TRAP5A和5B方面并不显著优于描述于WO1999/050662或EP1598670中的活性测定。0014已知的商业测定适于使用在某些临床应用中，因为TRAP5A的酶促活性比5B临床应用的形式低相当多。但是，通过评价公布于诸多研究范围内的数据，可以估计在正常。

22、说明书CN102007411ACN102007424A3/15页8样本中5A的影响可能高达50。尽管对于某些TRAP5B水平的变化是显著的临床应用，这并不代表一种显著的困难，但是已知的方法可能缺乏区分TRAP5B水平中更细微的变化的能力。0015应用于已知测定中的底物PNPP及其4卤取代衍生物在溶液中是不稳定的。当手工进行测定且其中底物是作为在使用之前立即溶解的固体应用时，这不是问题。但是，底物的不稳定性使这些化合物难以应用于自动化免疫测定平台，所述平台需要底物在溶液中稳定若干周。0016专利NOUS3,975,405描述了一种邻甲酚酞的单磷酸酯及其在血清样本中作为测量碱性磷酸酶的底物的用途，。

23、并自称具有如下利益避免由胆红素引起的干扰，并且与百里酚酞单磷酸酯相比对碱性磷酸酶的肠道和胎盘内的同工型更敏感。所述方法不区分碱性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型，或描述其作为TRAP5B的底物的用途。0017专利NOUS4,045,290描述了百里酚蓝单磷酸酯作为磷酸酶底物用于在血清中测量总碱性磷酸酶和在血清中适宜PH条件下测量总酸性磷酸酶的制备和用途。所述方法不区分碱性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型。0018因此，需要用于测定TRAP5B的方法，其中与现有测定相比TRAP5A的干扰显著减少，并且其可易于应用于自动化模式中。发明内容0019本发明提供了酞类化合物的单磷酸酯作为抗酒石酸酸性磷酸酶5。

24、BTRAP5B的底物的用途。0020在本文中，酞类化合物的单磷酸酯定义为下式的化合物00210022其中0023A是取代或未经取代的O磷酰化的对苯酚；0024B是取代或未经取代的对苯酚磷酸酯；0025X是CO或SO2；0026R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0027R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0028R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R。

25、6、CONR5R6和R7；并且0029R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SO说明书CN102007411ACN102007424A4/15页9NR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0030其中0031N是0、1或2；0032R5和R6各自独立地是氢或R7；并且0033R7选自烃基、CH2K杂环基、CH2KCO杂环基，其中的任意基团任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤素、氰基、氨基、羟基、COOH和其酯例如COC16烷基、亚磷酰胺、C16烷基和C16烷氧基的取代基取代；并且K是0、1、2、3、4、5或6。0034优选地，酞类化合物的单磷酸酯。

26、定义为下式的化合物00350036其中0037X是CO或SO2；0038R1选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0039R2选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0040R3选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0041R4选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6。

27、和R7；0042各R8选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0043各R9选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0044各R10选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、OR5、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；并且0045各R11选自氢、卤素、三氟甲基、氰基、硝基、ORW、COR5、COOR5、OCOR5、SONR5、NR5R6、CONR5R6和R7；0046其中说明书CN10200。

28、7411ACN102007424A5/15页100047N是0、1或2；0048R5和R6各自独立地是氢或R7；并且0049R7选自烃基、CH2K杂环基、CH2KCO杂环基，其中的任意基团任选地被1、2、3、4或5个独立选自卤素、氰基、氨基、羟基、COOH和其酯例如COC16烷基、亚磷酰胺、C16烷基和C16烷氧基的取代基取代；并且K是0、1、2、3、4、5或6。0050优选地，由其衍生出本发明的单磷酸酯的酞类化合物是酚酞或磺酞SULPHOPHTHALEIN，优选苯酚磺酞PHENOLSULPHOPHTHALEIN。0051本发明也提供了用于测量样本中TRAP5B的量的方法，所述方法包括使用酞类。

29、化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性。0052本发明也提供了用于测量受试者中骨吸收率的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中TRAP5B的量，其中存在于样本中的TRAP5B的量反映了骨吸收率。0053本发明也提供了用于诊断受试者中与骨吸收率的变化相关的障碍的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量，其中TRAP5B的非正常量表明受试者患有该障碍。0054本发明也提供了监测用于预防或治疗与骨吸收率的变化相关的障碍的药物在服用该药物的受试者中的效果的方法，所。

30、述方法包括A通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量；和B将TRAP5B在上述样本中的量与TRAP5B在对照样本中的量进行比较。0055本发明也提供了筛选受试者对与骨吸收率的变化相关的障碍的易感性的方法，所述方法包括通过使用酞类化合物的单磷酸酯作为底物测定TRAP5B的活性而测量受试者样本中存在的TRAP5B的量，其中TRAP5B的非正常量表明对这类障碍的易感性。0056优选地，本发明的方法包括A将样本中存在的总TRAP与对总TRAP、TRAP5A或TRAP5B具有特异性的抗体结合；B洗脱未结合的级分；和C通过使用酞类化合物的单磷酸酯作。

31、为底物测定与抗体结合的TRAP5B的活性或在未结合级分中TRAP5B的量，从而测量样本中TRAP5B的量。0057优选地，测定样本中TRAP5B活性包括如下连续的步骤0058A温育样本和作为底物的酞类化合物的单磷酸酯以使TRAP5B代谢底物；0059B停止代谢；0060C任选地调节样本的PH；0061D测量由于被TRAP5B代谢而导致的底物的特征变化。0062也提供了实施本发明方法的试剂盒，其包含酞类化合物的单磷酸酯和任选地包含对总TRAP、TRAP5A或TRAP5B具有特异性的抗体。0063也提供了酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP5B的底物而用作骨吸收率的指示物的用途。优选地，通过使受试。

32、者样本接触所述单磷酸酯并随后测量所述单磷酸酯的特征的任何变化，将酞类化合物的单磷酸酯用作骨吸收率的指示物。在本发明的方法中，优选提供了酞类化合物的单磷酸酯通过作为TRAP5B的底物而用作骨吸收率的指示物的用途。0064附图简述0065图1显示了APTMP被TRAP5A水解的过程；BPTMP被TRAP5B水解的过程；C说明书CN102007411ACN102007424A6/15页11TTMP被TRAP5A水解的过程；DTTMP被TRAP5B水解的过程。每个曲线图的图例显示了每次测定使用的TRAP5的量。0066图2显示了在使用PTMP底物的情况下，TRAP5A和TRAP5B的PH相对活性曲线。。

33、0067图3显示了在CMSEPHAROSE琼脂糖上源自人血清的TRAP5A和TRAP5B的分离。0068图4显示了通过基于PNPP的测定和基于PTMP的测定所测得的血清TRAP5浓度的关系。0069图5显示了使用对硝基苯基磷酸酯PNPP和酚酞单磷酸酯作为底物的TRAP5A和TRAP5B的测定结果。0070发明详述0071本文中，TRAP意指抗酒石酸酸性磷酸酶，其是酸性磷酸酶5型家族的成员。除另有说明，“TRAP”或总TRAP包括酶的两种同工型，即TRAP5A和TRAP5B。TRAP5B是在其烃链中缺少唾液酸的TRAP酶的同工型，并在PH57到61之间对PNPP底物显示最佳酶活性。TRAP5A是。

34、在其烃链中具有唾液酸残基的酶的同工型，并在PH约49时对PNPP显示最佳酶活性的酶的形式。术语TRAP、TRAP5A和TRAP5B可分别与TRACP、TRACP5A和TRACP5B替换使用。0072酞类化合物的单磷酸酯定义为如上定义的具有式I的化合物或优选具有式II的化合物。0073在一个实施方案中，各R1至R4和R8至R11独立选自H、F、CL、BR、CF3、OCF3、CN、OH、NO2、SO2H或其酯、NH2、COOH或其酯、CONH2、C14烷基例如ME、ET、PR或BU或C14烷氧基例如OME、OET、OPR或OBU。合适的酯包括例如C1C4烷基的烷基酯和例如N羟基琥珀酰亚胺的活化酯。。

35、0074在一个实施方案中，各R1至R4是H。0075根据另一个实施方案，R3是H、ME、ET、PR、卤素或三氟甲基。0076根据另一个实施方案，R3选自H、溴、氯、氟，甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。任选地，R3是H。在本段提及的实施方案的某些化合物中，R1、R2和R4都是H。在某些其它化合物中，它们选自H、卤素和C1C4烷基。0077术语“烃基”包括含有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。该术语包括具有1、2、3、4、5或6个碳原子的无环脂肪族基团、含有3、4、5或6个碳原子的环脂肪族基团和含有6个碳原子的芳香族基团。通常，术语烃基意指含有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基基团。但是。

36、，术语烃基也意欲包括含有2、3、4、5或6个碳原子的烯基和炔基基团。0078术语“杂环基”包括含有3、4、5或6个环成员的环的基团，其中至少1个是杂原子例如N、O或S。0079根据一个实施方案，各R8独立选自H、甲基、乙基、异丙基、溴、氯、氟、甲氧基、乙氧基、异丙氧基或叔丁氧基。任选地，各R8是H、ME、BR、异丙基或CL。0080根据一个实施方案，各R9独立选自H、甲基、乙基、异丙基、溴、氯、氟、甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。任选地，各R9是H、ME或BR。0081根据一个实施方案，各R10独立选自H或ME。0082根据一个实施方案，各R11独立选自H或ME。说明书CN10200741。

37、1ACN102007424A7/15页120083本文中，独立指相同或不同。0084当A是经取代的O磷酰化的对苯酚时，合适的取代基包括F、CL、BR、CH3、CF3、OCF3、CN、OH、NO2、SO2H、NH2、COOH、CONH2、C14烷基例如ME、ET、PR或BU或C14烷氧基例如OME、OET、OPR或OBU或类似基团。0085当B是经取代的对苯酚磷酸酯时，合适的取代基包括F、CL、BR、CH3、CF3、OCF3、CN、OH、NO2、SO2H、NH2、COOH、CONH2、C14烷基例如ME、ET、PR或BU或C14烷氧基例如OME、OET、OPR或OBU或类似基团。0086在一种类。

38、型的实施方案中，化合物包含至少1个选自R1至R11的取代基，所述取代基含有直接或间接与例如生物分子、蛋白质或多肽的其他分子链接的反应官能团。0087在一个实施方案中，R1至R4各自是H，X是CO，R8、R9、R10和R11如表1中所定义。在另一个实施方案中，R1至R4各自是H，X是SO2，R8、R9、R10和R11如表2中所定义。0088在一个实施方案中，各R8基团独立地是溴、氯或氟，各R9基团独立地是甲基、乙基、异丙基或叔丁基。任选地，各R8基团独立地是溴或氯，各R9基团独立地是甲基、乙基或异丙基。0089在一个实施方案中，仅仅R1至R11中的1、2或3个不是H。0090在一个实施方案中，各。

39、R8基团独立地是溴、氯或氟，各R9基团独立地是溴、氯或氟。任选地，各R8基团独立地是溴或氯，各R9基团独立地是溴或氯。0091在一个实施方案中，各R8基团独立地是甲基、乙基、异丙基或叔丁基，各R10基团为甲基、乙基、异丙基或叔丁基。任选地，各R8基团独立地是甲基、乙基或异丙基，各R10基团为甲基、乙基或异丙基。0092本发明中优选的酞类化合物的单磷酸酯包括酚酞单磷酸酯、甲酚酞单磷酸酯、百里酚酞单磷酸酯、邻氯酚酞单磷酸酯、苯酚磺酞单磷酸酯、邻甲酚磺酞单磷酸酯单磷酸酯、间甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚紫单磷酸酯、溴甲酚绿单磷酸酯、溴酚蓝单磷酸酯、百里酚蓝单磷酸酯、溴百里酚蓝单磷酸酯、二甲苯酚蓝单磷酸酯和氯。

40、酚红单磷酸酯。0093也包括在本发明中的底物是本发明的酞类化合物的单磷酸酯的功能衍生物或盐，其在TRAP5B代谢后显示特征的变化。0094可以通过式I的羟基基团的酯化制备酞类化合物的单磷酸酯。可通过本领域已知的和描述于例如US3,975,405和US4,045,290中的方法制备酞类化合物的单磷酸酯。0095受试者可以是任何脊椎动物，优选哺乳动物，且最优选人。在实施方案中，受试者是女性。0096受试者的样本可以是源自受试者的任何体液样本，优选血样，例如血浆或血清。其它合适的体液样本包括滑液、唾液和尿液。0097在本发明中使用的针对TRAP的抗体包括结合总TRAP且对任一种同工型不具有特异性的抗。

41、体，以及显示优选结合一种TRAP的同工型并因此被称为对TRAP5A或TRAP5B具有特异性的抗体。用于测定抗TRAP抗体的特异性的方法描述于本领域，例如HALLEENETALJBMRVOL15133514342000中。在本发明中使用的抗体可以是多克隆或单克隆的，但优选后者。可以在任何物种中产生针对TRAP5B的抗体，但优选小鼠、大鼠或人。优选地，使用本领域可获得的方法，使用天然的TRAP5B作为免疫源，从任何合适的动物来源，例如小鼠、兔、绵羊、山羊衍生抗体TISSJEN，EDPRACTICEANDTHEORYOFENZYME说明书CN102007411ACN102007424A8/15页13。

42、IMMUNOASSAYLABORATORYTECHNIQUESINBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGY，VOL15CHAPTER5。在本发明中使用的优选的单克隆抗体包括4E6、01A和J1BHALLEENETALJMBR1446491999，14G6和9C5JANCKILLAETALHYBRIDOMA16，175821997。0098本发明基于使用酞类化合物的单磷酸酯作为TRAP5B的底物，以测量样本中TRAP的量，其作为受试者中骨吸收率的指示。这基于如下观察酞类化合物的单磷酸酯优选被TRAP5B而非TRAP5A代谢，这可用于特异性测量样本中TRAP5B活性。TRAP。

43、5B对底物的活性也被称为TRAP5B引起的底物的代谢，其改变底物的特征性，该变化用作TRAP5B的活性的度量，因此用作样本中TRAP5B的量的度量。该特征性可以是任何可测量的特征性，例如结构或功能的变化。优选地，该变化是结构变化，且优选是通过TRAP5B从底物移除磷酸酯基团，优选移除式I中的A或B的磷酸酯，更特别优选移除式II的磷酸酯基团。这种结构变化导致底物的颜色变化，其可被测量以表明所存在的TRAP5B的量。0099因此，测量TRAP5B的量包括测定TRAP5B对底物的活性。该测定包括温育受试者的样本和本发明的底物。0100优选地，该测定包括首先将样本中的TRAP结合到抗体上，以从样本中分。

44、离TRAP。根据所用抗体的特异性，可以分离总TRAP、TRAP5A或TRAP5B。然后可以根据所用抗体的特异性，通过将底物加入至样本的未结合级分或结合级分而测量TRAP5B的活性。当使用非同工型特异性抗体时，还可以采用其它方法特异性测定TRAP5B的活性，例如在利于TRAP5B活性的情况下实施活性测定。因此，优选地，TRAP5B的活性测定步骤包括I结合至TRAP5A特异性抗体并测定含有TRAP5B的非结合级分对底物的活性；II结合至TRAP5B特异性抗体并测定含有TRAP5B的结合级分对底物的活性；或III结合至非同工型特异性TRAP抗体；在利于TRAP5B活性的情况下测定含有TRAP5A和T。

45、RAP5B的结合级分对底物的活性。在进一步增加TRAP5B活性测定的特异性的优选的实施方案中，上述I和/或II也可以在利于TRAP5B活性的情况下进行。0101影响相对TRAP5A活性的TRAP5B活性的条件包括PH。例如可以在优选TRAP5B的活性而不是TRAP5A的活性的PH下实施测定。因此，优选地，TRAP5B的活性测定步骤在PH68至76进行，优选PH68至74，且最优选PH7至72。0102优选地，底物的代谢通过改变反应条件而停止，例如通过添加例如氢氧化钠、盐酸、正磷酸氢二钠、正磷酸二氢钠或1MPH11的甘氨酸/NAOH的试剂。0103可以使用任何合适的方法测量由TRAP5B的代谢导。

46、致的底物的特征性变化。当变化导致颜色改变时，优选使用分光光度计测量。所得值可以作为TRAP5B的活性的量的指示，因此可以用作样本中TRAP5B的量的度量。该值可以通过与校正标准或曲线比较转化为TRAP5B的量。0104当用分光光度计测量底物的颜色变化时，在酞类化合物具有最大吸光度的波长下测量吸光度。优选地，在450NM、540NM、550NM、592NM或595NM下测量吸光度。0105为观察到样本中任意颜色变化，某些底物可能需要调节PH。因此，本发明的方法可包括在测量样本中任何颜色变化之前调节样本的PH。可以通过添加适当量的酸或碱调节PH以使样本的PH调节至观察到特定底物的任意颜色变化的PH。

47、。在“DATAFORBIOCHEMICALRESEARCH3RDEDITION，RMCDAWSONETAL，CLARENDONPRESS，OXFORD1989”中提供了观察到底物颜色变化的PH。说明书CN102007411ACN102007424A9/15页140106因此，本发明的方法还可进一步提供通过将所得TRAP5B的测量值与校正标准或曲线比较得到存在的TRAP5B的量的绝对值。绝对值是测得的每分钟水解的底物小分子单位中TRAP5B的量。0107优选地，可同时测定多个样本，例如在阵列、芯片或多孔板上。本发明的测定优选在自动化平台的固定基质上进行。优选地，固定基质是被抗体包被的。最优选地，。

48、当使用基质时，其包含磁珠，所述磁珠被抗体包被，以通过例如机器人或其它自动化仪器实现样本的高通量分析。0108涉及骨吸收率变化的障碍包括任何骨吸收率非正常的障碍，其通常导致非正常的骨密度。这种障碍可包括骨质疏松、畸形性骨炎、多发性骨髓瘤、骨代谢性疾病、转移瘤、骨损害、骨关节炎、类风湿性关节炎和心血管障碍，特别是那些与动脉粥样硬化斑块形成相关的障碍。骨吸收率的变化意味着骨被破坏或吸收程度的变化，其可以因此影响骨密度。0109可以通过将样本中TRAP5B的量或TRAP5B的活性与骨吸收率的校正标准或曲线比较而确定骨吸收率。所得骨吸收率可以用于诊断与骨吸收率变化相关的障碍或测定对这类障碍的易感性。在优。

49、选的实施方案中，本发明的方法包括将样本中TRAP的测量值与曲线比较以直接将所述测量值与特定障碍的易感性或存在关联起来。0110“诊断障碍”意指通过评价受试者中的骨吸收率确定障碍的存在。该方法也可以包括鉴定其它已知与特定障碍或骨吸收率相关的症状存在或不存在。0111“测定障碍的易感性”意指通过评价骨吸收率而确定受试者中障碍发病的可能。该方法还可以比较鉴定所述障碍可能发病的任何其它指示。0112涉及监测用于治疗或预防与非正常骨吸收率相关障碍的药物效果的本发明方法包括将已施用该药物的受试者样本中TRAP5B活性的量与不接受该药物的受试者的对照样本进行比较。因此，对照样本可以定义为来自不接受待测药物的受试者，优选其TRAP5B的活性是非正常的受试者，且更优选与接受待测药物的受试者患有相同障碍的受试者。已经给予药物的受试者可以是相同的或不同的，但优选相同的。当受试者相同时，对照样本优选在任何给药之前取自受试者。在监测药物效果的方法中，优选以合适的时间间隔，可以将对照样本与一个或多个来自给药之后的受试者的样本比较。通过评价给药后受试者的样本中任何骨吸收率的变化测定药物效果。0113根据本发明的试剂盒含有酞类化合物的单磷酸酯和任选地含有与TRAP、TRAP5A和/或TRAP5B结合的抗体。优选地，提供了在本发明的测定中使用的单独的试剂。试剂盒也可以提供在本发明方法中使用的试剂，包括那些。