技术领域
本发明涉及一种抗癌抗菌基因工程活性肽的生产方法，尤其是涉及一种抗 菌肽基因异源表达工程菌的生产方法。
背景技术
近年来，由于癌症发病率上升和农作物病害日渐严重，对一些癌症的治疗 与病害的防治，困难大增。而抗癌抗菌活性肽，因其独特的生物活性，以及不 同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴趣，成为新药领域 的研究热点之一。
抗菌肽(antibacterial peptides)是指分子量在2000～7000左右，由20～ 60个氨基酸残基组成，带正电荷的一类小肽，是宿主天然防御的重要参与者。 其不仅能抗多种细菌，而且可以抑杀真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞，具有广 谱抗性的特点。在结构上，抗菌肽大多具有两亲性α螺旋，该区域的极性和非 极性氨基酸残基数目成一定比例，使抗菌肽在中性pH环境下带正电。关于抗菌 肽的作用机理，虽然至今仍存在不同看法，但一般认为，抗菌肽通过静电作用 与细胞膜相结合，形成离子通道后，造成细胞膜结构破坏，引起细胞内物质的 大量渗出，最终导致细菌死亡。Christensen等以脂质双分子层为模型，详细描 述了抗菌肽的通道形成过程：抗菌肽分子通过其两亲α螺旋上的正电荷与细菌 细胞质膜磷脂分子上的负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上，接着分子中的 疏水段借助于分子中的连接结构的柔性插入到质膜中，之后抗菌肽分子的两亲 α螺旋也插入到质膜中，打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，由于α 螺旋是亲水和疏水两亲性的，所以最终通过膜内分子的相互位移使抗菌肽分子 相互聚集在一起，形成离子通道，造成菌膜失去膜势，胞内物质泄漏，不能保 持正常的渗透压而死亡。在过去的20年内，已有多种抗菌肽从动物(包括脊椎动 物和无脊椎动物)、植物、细菌和真菌中分离出来，显示出广阔的应用潜力。
在肿瘤治疗方面，目前化学疗法所使用的药物，对癌细胞和正常细胞，大 多不能区分，以至其疗效与毒性，往往成正相关，副作用相当大。而抗菌肽却 能特异性地抑制某些肿瘤细胞的生长，对正常人体细胞无害，同时还能促进人 白细胞的增值，调动人体免疫系统对抗癌瘤的侵蚀。
在农林抑菌方面，传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必不可少的条 件，例如使酶失活变性，达到杀菌的目的，细菌只要改变一种基因就足以抵抗 此类抗生素的攻击。而抗菌肽是通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用， 穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。但由于抗菌肽天然资源 有限，且提取难度大，而化学合成肽类成本高，因而采用基因工程方法表达抗菌 肽成为人们研究的一个热点。
现有的抗菌肽基因工程生产方法多采用融合表达载体表达并利用融合表达 的蛋白标记进行纯化分离这一路线进行。但是标记蛋白的加入破坏了抗菌肽原 有的蛋白结构，不利于其构象的维持，降低了其抗癌抑菌的活性；且需增加体 外酶切等下游工艺，才能获得抗菌肽产品，生产工艺繁琐，生产成本较高。
发明内容
本发明旨在克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种生产工艺较简单，生 产成本更低的抗癌抗菌基因工程活性肽的生产方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
通过对比植物抗菌肽硫素(thionin)、有效的抗真菌肽类抗生素制霉菌素 (nystatin)和尼可霉素Z(nikkomycin Z)的氨基酸序列，人工合成的抗菌肽 Ap1及Ap2(Javadpour等，De Novo Antimicrobial Peptides with Low Mammalian Cell Toxicity，J.Med.Chem.1996，39，3107-3113)在拟膜环境下显示出 适度的螺旋结构，其对引发水稻纹枯病的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) 具有很好的毒杀效果，而将其与LH/CG偶联后在一系列的体内体外活性试验中， 也表现出对乳腺癌细胞、前列腺癌细胞特异性毒杀及抑制活性。
Ap1和Ap2编码基因片段较小，通过人工方法直接合成获得，同时在两端引 入粘性接头用于构建表达载体这一方法能有效的简化基因工程操作过程，是一 种简便快捷而有效的方法。但由于宿主大肠杆菌对密码子使用的相当偏爱性， 往往会显著降低抗菌肽基因的表达水平，甚至不表达。
本发明优选出大肠杆菌宿主偏爱密码子，设计并合成Ap1和Ap2编码基因， 有利于外源抗菌肽在表达系统中实现高效表达。
本发明下述之异源表达工程菌是Ap1和Ap2两种合成抗菌肽分别或共表达 的抗癌抗真菌工程菌株。
本发明之抗癌抗菌基因工程活性肽的生产方法包括以下步骤：
(1)采用大肠杆菌的偏爱密码子将Ap1及Ap2基因密码子进行优化；
(2)PCR分别合成抗菌肽基因Ap1和Ap2；
(3)选用PCR对表达载体进行改造，构建载体pETΔt；
(4)将Ap1和Ap2分别克隆进pETΔt表达载体，构建抗菌肽Ap1和Ap2 的重组质粒pETΔt1及pETΔt2；
(5)构建多顺反子表达载体pETΔt21，以共表达抗菌肽Ap1及Ap2；
(6)将所述重组质粒分别转入大肠杆菌DH10B，构建抗癌抗菌工程菌，实 现抗菌肽的异源表达；
(7)异源表达抗菌肽Ap1和Ap2的纯化。
本发明通过在上游工艺中引入PCR技术对载体进行改造，从而使该生产方法 在不影响表达抗菌肽的正常折叠，促进其活性的维持的同时，无需额外进行去 Tag步骤，简化了下游工艺，降低了生产成本；且本发明中涉及两种抗菌肽的共 表达技术，为构建抗癌抗真菌双效工程菌提供了生产模式，建立了生产平台。
附图说明
图1Ap1及Ap2基因合成流程示意图；
图2表达质粒pET28a的改造流程图；
图3重组质粒pETΔt1及pETΔt2构建流程图；
图4多顺反子表达载体pETΔt21的构建流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式加以详细说明。
以下所述步骤中所使用的限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公 司，抗生素均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
(1)AP1及Ap2基因密码子优化：经采用基因进化技术获得Ap1及Ap2抗 菌肽一级结构序列及大肠杆菌偏爱密码子信息，优化其序列，并引入SacI和 HindIII酶切位点、RBS结合位点于Ap1，引入BamHI和SacI酶切位点于Ap2， 设计合成序列如下：
P1：CGG AGC TCA GGA AAC AGA CCA TGA AGT TCG CCA AGT TTG CAA AGA AAT
TCG CCA AGT TCG CTA AGT GA
P2：CCC AAG CTT TCA CTT AGC GAA CTT GGC GAA TTT CTT TGC AAA CTT GGC
GAA CTT
P3：CGG GAT CCA AGT TCG CCA AGT TTG CAA AGA AAT TCG CCA AGT TCG CTA
AGA AGT TCG CTA AGT TCG CCA AGT GA
P4：CCG AGC TCT CAC TTG GCG AAC TTA GCG AAC TTC TTA GCG AAC TTG GCG
AAT TTC TTT GCA AAC TTG GCG AAC TT
(2)PCR合成抗菌肽基因：参照图1，将上述P1和P2、P3和P4等摩尔混 合，分别进行降落PCR(Touchdown PCR)退火，采用的程序为：94℃3min，93℃ 45s，92℃45s，91℃45s……62℃45s，61℃45s，60℃45s，即在94℃保持 3min，降至93℃后，每45s下降1℃，直到降至60℃保持45s止；经聚丙烯酰 胺凝胶分离检测大小正确，电洗脱回收后即得到完整的两端带有酶切位点的Ap1 及Ap2抗菌肽基因，其序列如下：
Ap1(77bp)：CGG AGC TCAAGA CCA TGA AGT TCG CCA AGT TTG CAA
AGA AAT TCG CCA AGT TCG CTA AGT GAA AGC TTG GG
Ap2(82bp)：CGG GAT CCA AGT TCG CCA AGT TTG CAA AGA AAT TCG CCA AGT
TCG CTA AGA AGT TCG CTA AGT TCG CCA AGT GAG AGC TCG G
下划线“____”表示引入的酶切位点，下划线“_ _ _”表示引入的RBS序 列；
考虑到Ap1及Ap2抗菌肽分子量较小，且以包涵体形式表达后，可直接提 取利用，故去掉表达载体的tag区，将有助于目的蛋白功能及毒杀活性的维持。 pET28a(+)质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)的Tag编码区位于BamHI 酶切位点及转录起始位点之间，其中207～239位为T7-Tag编码区，270～287 位为His-Tag编码区，通过酶切方式无法将其切除，故采用PCR方法进行载体 改造；
(3)表达载体pETΔt的构建：参照图2，以pET28a(+)质粒为模板，用 Pyrobest高保真DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行PCR扩增， 获得5.2kb大小片段，
引物序列为：F-28Δt(5’GGA TCC GAA TTC GAG CTC CG 3’)
R-28Δt(5’GCT GCT GCC CAT GGT ATA TCT CCT TC 3’)
线性PCR产物回收后，先用T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase， 购自宝生物工程(大连)有限公司)37℃处理30min，在5’端加磷酸，再用T4DNA 连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)使其环化，转化E.coli DH10B后， 测序正确；
(4)pETΔt1及pETΔt2重组质粒的构建：参照图3，将PCR扩增得到的 Ap1用SacI和HindIII进行双酶切，纯化后，与同样双酶切的pETΔt质粒以 3∶1的摩尔比于16℃连接过夜，即构建重组质粒pETΔt1。而Ap2片段则用BamHI 和SacI双酶切后以同样操作构建重组质粒pETΔt2；
本发明共表达Ap1和Ap2两种抗菌肽，在设计Ap1基因合成时，使其带有 独自的RBS(AGGAAA)及ATG序列，以构建多顺反子表达载体，共表达Ap2与 Ap1两种抗菌肽基因；
(5)多顺反子表达载体pETΔt21的构建：参照图4，将构建好的pETΔt1 质粒用SacI和BamHI双酶切后，与同样双酶切的Ap2片段以1∶1的摩尔比16℃ 进行连接，形成重组质粒pETΔt21；
(6)Ap1、Ap2抗菌肽异源表达菌株的构建：将构建好的pETΔt1、pETΔt2 及pETΔt21重组质粒分别转入E.coli DH10B，Kan抗性筛选，进行快速裂解、 菌落PCR检测，再分别提取转化子质粒，进行酶切、测序鉴定，证实均为目的 重组质粒，成功构建了三株Ap1或/和Ap2抗菌肽异源表达工程菌；
由于抗菌肽对于表达宿主菌有一定程度的抗杀作用，所以采用使宿主菌正 常生长至一定数量，再使用IPTG诱导的表达策略；
Ap1及Ap2抗菌肽异源表达检测：
将三株抗菌肽异源表达菌株37℃摇床培养3小时至OD600约为0.4～0.6时， 加入终浓度为0.4mM IPTG(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)诱导继 续培养2-4h后，镜检观察发现有包涵体产生，SDS-PAGE检测及Western印迹 也在5kD或/和6kD大小左右检测到目的条带，验证了目的外源蛋白的表达；
(7)纯化Ap1和Ap2蛋白：
IPTG诱导表达4h，收集菌体，超声破碎细胞包涵体，离心后以1mL PBS缓 冲液洗涤2次，以8M尿素(pH7.4)溶解。以强阳离子交换柱(购自通用电器 公司General Electric Company)进行纯化，条件为：10mM NaCl平衡，洗脱 ABCD液分别为220，350，500及1000mM NaCl，收集洗脱峰，脱盐，低温低压 冻干，获得目的蛋白。
异源表达的Ap1及Ap2抗菌肽的活性测定：
①抗菌活性检测：采用生长速率法测定Ap1及Ap2的抗菌活性。将立枯丝 核菌接种于PDA培养基中，取1ml发酵液与100ml PDA培养基(马铃薯抽出物 20％，葡萄糖2％，琼脂2％)混合均匀制成1％的带药培养基，倒皿，待冷却后，在平 板中央接直径为0.6cm的立枯丝核菌菌片。以加1ml 80％酒精的PDA培养基作 对照(ck)。置于25℃恒温培养箱内培养，约5d后，待对照菌长满皿时，用十 字交叉法测量菌落直径大小(单位mm)，并以如下公式计算抑制百分率。
抑菌百分率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
结果显示：Ap1对立枯丝核菌的抑菌圈直径平均约为13mm，抑菌百分率为 45.8％；Ap2对立枯丝核菌的抑菌圈直径平均约为8mm，抑菌百分率为66.7％。
②抗癌活性检测：①体外试验：采用四唑盐(MTT)比色法进行检测。将乳 腺癌单层培养细胞以0.25％胰蛋白酶(购自上海生工生物工程技术服务有限公 司)消化后，用含1％抗菌肽的培养液悬浮后接种于96孔培养板，于CO2孵箱中 37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养3～5天；加入5mg/ml MTT溶液20μl，继 续孵育4h，终止培养。弃去孔内培养上清，对悬浮生长的细胞1000rpm/5min离 心，然后弃去孔内培养物，每孔加入150μ1DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶 解。以不加细胞只加培养液为空白对照，490nm波长检测。测得Ap1及Ap2对乳腺 癌细胞的抑制率分别为40.7％、54.2％。②体内试验：采用穿刺法建立移植乳 腺癌裸鼠动物模型，试验组设6只小鼠，对照组设8只小鼠，1％抗菌肽以皮下注 射方式进行给药，每天给药1次，连续给药5次。试验第6天处死小鼠，称瘤重。 抑瘤率按下面公式计算：
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-试验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100 ％。
试验结果：对照组为(3.02±0.51)g，Ap1试验组为(1.99±0.31)g，抑 癌率为34.1％，Ap2试验组为(1.61±0.44)g，抑癌率为46.7％，显示了良好的 抑癌活性。
使用本发明生产的产品与现有的同类医药产品相比具有以下优势：
(1)广谱抗菌及抗耐受性：Ap1及Ap2其抗菌机制不同于传统抗生素，通 过静电作用进行膜穿孔，因而不仅可对多种细菌、真菌，甚至多种癌细胞起作 用，且不易产生抗性菌和交叉抗性反应；
(2)经济效益显著：采用大肠杆菌异源高产量表达抗菌肽，简化了工艺， 降低了生产成本，提高了经济效益；
(3)安全性高：具有与天然抗菌肽同样无毒副作用，活性浓度高，无畸变 作用等特点，极具药用农用价值；
因此，在农业防治与肿瘤医疗上的应用前景广阔。