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1、10申请公布号CN102007219A43申请公布日20110406CN102007219ACN102007219A21申请号200980113228922申请日20090414200810648820080416JPC12Q1/4820060171申请人独立行政法人国际农林水产业研究中心地址日本茨城县72发明人吉桥忠瓦卢尼巴拉尼亚侬帕查利汤托兰库维帕斯洛加纳莫塔库74专利代理机构北京林达刘知识产权代理事务所普通合伙11277代理人刘新宇李茂家54发明名称氨基丁酸的定量方法57摘要本发明提供一种氨基丁酸的定量方法，其包括以下工序为了排除结构与GABA类似的谷氨酸等氨基酸，使用特异性转氨酶、及要。
2、求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶的脱氢酶，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下使电子载体作用于所生成的NADPH，测定所生成的水溶性甲臜染料的工序。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010101486PCT申请的申请数据PCT/JP2009/0575372009041487PCT申请的公布数据WO2009/128461JA2009102251INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN102007232A1/1页21一种氨基丁酸的定量方法，其特征在于，该方法对含有氨基酸的试样。
3、中的氨基丁酸进行定量，其包括以下工序1使试样、氨基丁酸转氨酶和要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶的脱氢酶反应而生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；2在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸与电子载体反应而生成水溶性甲臜染料的工序；3测定所生成的水溶性甲臜染料的工序。2根据权利要求1所述的氨基丁酸的定量方法，所述四唑盐为22甲氧基4硝基苯基34硝基苯基2H四唑钠盐。3根据权利要求2所述的氨基丁酸的定量方法，所述要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶的脱氢酶为琥珀酸半醛脱氢酶。4根据权利要求3所述的氨基丁酸的定量方法，所述电子载体选自吩嗪硫酸甲酯、。
4、1甲氧基5甲基吩嗪硫酸甲酯盐及吩嗪硫酸乙酯。5根据权利要求1所述的氨基丁酸的定量方法，所述水溶性甲臜的测定为波长470NM下的吸光度的测定。6根据权利要求1所述的氨基丁酸的定量方法，所述酶的失活是添加硫酸。7根据权利要求16中任一项所述的氨基丁酸的定量方法，所述试样含有谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸或组氨酸。8根据权利要求7所述的氨基丁酸的定量方法，所述试样为饮食品。权利要求书CN102007219ACN102007232A1/5页3氨基丁酸的定量方法技术领域0001本发明涉及通过比色分析简便且迅速地对氨基丁酸以下有时也称为GABA。进行定量的方法，该方法不受试样中所含的各种氨基酸的影响。背景技术00。
5、02GABA是自然界广泛存在的氨基酸中的一种，已知有降压作用、安神作用等生理功能。为获得该作用，而制造了很多添加或强化了GABA的食品参照专利文献1。此外，已知的是，谷类种子只含有少量的GABA，但通过使种子发芽可增加GABA含量参照专利文献2。0003谷类种子的GABA的增加根据收获后处理、品质的不同而不同，此外，需要对消费者保证的是，进行了发芽处理等而强化GABA含量的食品中，通过该发芽处理确实地增加了GABA。0004专利文献3中公开了碱性磷酸酶活性的测定法，该方法通过碱性磷酸酶使氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸发生脱磷酸化反应，转变成氧化型烟酰胺腺嘌呤二核。
6、苷酸或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，然后在电子载体的存在下使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与四唑盐反应而生成甲臜染料，并对该甲臜染料进行测定。0005现有技术文献0006专利文献0007专利文献1日本特开2007159017号公报0008专利文献2日本特开2003250512号公报0009专利文献3日本特开2005304483号公报发明内容0010发明要解决的问题0011但是，对饮食品那样含有各种氨基酸的试样中的GABA进行定量时，应用专利文献3的方法的情况下，由于混杂的氨基酸的影响，甲臜染料发生沉淀，无法进行准确的测定。因此，在饮食品中那样混杂各种氨基酸的GABA的定量分析中，为了排除混杂的各种氨。
7、基酸的影响，而采用使用了氨基酸分析计或HPLC等昂贵设备的分离分析法。但是，在这样的分离分析法中，不仅需要昂贵设备，而且无法同时对多个待测物进行分析。因此，指出了制品中标示的GABA含量未必能保证是制品中实际所含的GABA含量等问题。0012如上所述，对饮食品那样的含有各种氨基酸的试样中的GABA进行定量的方法具有若干问题。即，在测定甲臜染料的方法中，受到混杂的氨基酸的影响，基本不可能准确地测定，另外，在分离分析法中，不仅需要昂贵设备，而且无法同时对多个待测物进行分析，因而效率差。0013本发明是为了解决这些问题而完成的，其目的在于提供一种同时且简便、迅速地说明书CN102007219ACN1。
8、02007232A2/5页4对少量多个待测物的试样中所含的GABA进行定量的方法，该方法无需使用氨基酸分析计或HPLC等昂贵设备，而且，不会受到待测物中所含的各种氨基酸等的影响。0014GABASE是存在于微生物、西红柿等多种生物中的酶复合体，兼具GABA转氨酶活性及琥珀酸脱氢酶活性。发明人等着眼于利用该酶由GABA生成琥珀酸半醛和将所生成的琥珀酸半醛氧化时作为辅酶的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸定量地转变成还原型，由所生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸偶联介由给电子体的水溶性腙的生成。其结果是，从GABA向琥珀酸的转变和水溶性腙的生成偶联进行，从而能够通过比色法进行GABA的定量。进而，通。
9、过利用比色法，能够使用比较廉价的酶标仪MICROPLATEREADER，并且成功缩小了反应体系，从而完成了本发明。0015用于解决问题的方案0016即，本发明为一种对饮食品那样含有各种氨基酸的试样中的氨基丁酸进行定量的方法，其特征在于，其包括以下工序00171使试样、氨基丁酸转氨酶和要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶的脱氢酶反应，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后使酶失活的工序；00182在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸与电子载体反应，从而生成水溶性甲臜染料的工序；00193测定水溶性甲臜的工序。0020发明的效果0021本发明通过对GABA作用特异。
10、性的转氨酶以及对其产物作用特异性的要求NADP作为辅酶的脱氢酶，生成NADPH，接着，在水溶性四唑盐的存在下使电子载体作用于NADPH，测定所生成的水溶性甲臜染料，从而能够简便地对GABA进行定量，因此具有以下的效果。0022根据本发明方法，由于不需要氨基酸分析计、HPLC等昂贵设备，因而比较经济，而且不会受到待测物中所含的各种氨基酸等的影响，能够同时且简便、迅速地对少量多个待测物的试样中所含的GABA进行定量。0023根据本发明方法，由于能够同时且迅速地对大米等食品中所含的GABA进行定量，因此能够测定生理功能备受瞩目且在各种食品中添加的GABA在食品中的含量，能够保证这些制品中所含的GAB。
11、A含量。0024进而，即使在利用大米内在的代谢酶组生成GABA并利用该特性强化了GABA的发芽糙米制品中，也能够更准确地进行GABA含量的表示，能够利用于由于糙米的发芽处理的失败而产生的GABA含量少的制品的检查。此外，通过本发明，能够容易地检定利用发芽处理产生的GABA含量的品种间差异，因而有利于适合发芽糙米的品种的筛选等。附图说明0025图1是GABA定量的原理说明图。0026图2是使用了GABA标准试样的标准曲线图。0027图3是采用DABSYL衍生化HPLC法的定量和利用本发明进行定量的比较线图。0028图4是泰国的各个品种的GABA生成能力的研究图。说明书CN102007219ACN。
12、102007232A3/5页5具体实施方式0029以下，通过实施例对用于实施本发明的最优的方式进行说明。另外，当然，本发明并不限定于这些实施例。0030本发明的GABA的定量方法包括以下工序为了排除各种氨基酸、特别是结构与GABA类似的谷氨酸等氨基酸，而使用特异性转氨酶、及要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADP。作为辅酶的脱氢酶以下也称作NADP要求性脱氢酶。，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADPH。后使酶失活的工序；在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下，使电子载体作用于所生成的NADPH，并测定所生成的水溶性甲臜染料的工序。0031这里，各种氨基酸是指前述的谷氨酸以。
13、及具有与GABA类似结构的氨基酸，例如谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸。0032转氨酶可列举出GABA转氨酶以下称作GABAT。，NADP要求性脱氢酶可列举出琥珀酸半醛脱氢酶以下称作SSADH。0033电子载体可列举出人工电子载体，例如吩嗪硫酸甲酯以下称作PMS。、1甲氧基5甲基吩嗪硫酸甲酯盐以下称作1MEOPMS。、吩嗪硫酸乙酯以下称作PES。0034生成水溶性甲臜染料的四唑盐可列举出例如22甲氧基4硝基苯基34硝基苯基2H四唑钠盐以下称作WST8。0035图1中示出了本发明的原理。本发明是对饮食品那样含有各种氨基酸的试样中的氨基丁酸进行定量的方法，其包括以下工序第一工序，通过氨基丁酸转氨酶和。
14、NADP要求性脱氢酶的二酶体系，生成对氨基丁酸转氨酶特异性的NADPH后使酶失活；第二工序，用第一工序中生成的NADPH将四唑盐还原而生成水溶性甲臜染料，并测定水溶性甲臜的颜色。即，包括以下工序通过GABAT及SSADH将NADP转变成NADPH后，使酶失活的第一工序；在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下，由NADPH介由电子载体而生成水溶性甲臜，测定由该甲臜产生的颜色黄色的第二工序。0036第一工序中，如果不使酶失活就添加生成水溶性甲臜染料的四唑盐和电子载体，则同时进行酶催化的非特异性四唑盐的还原反应，无法准确地测定GABA。0037此外，使用生成水不溶性的甲臜染料的四唑盐的情况下，还原而生。
15、成的甲臜染料发生沉淀，因此难以准确地测定。0038酶的失活例如通过将反应溶液调成酸性来实现。更具体而言，添加盐酸、硫酸等酸，使PH为2以下。0039以下，示出若干实施例对本发明进行更具体的说明。0040实施例10041以下示出了调查氨基酸对本发明的GABA的定量造成的影响的例子。0042调制含有GABASE、NADP的以下那样的试剂1、作为反应终止液的试剂2及含有1MEOPMS、WST8的试剂3。0043试剂10044100MMTRIS缓冲液PH89004510MM酮戊二酸00462MM2巯基乙醇说明书CN102007219ACN102007232A4/5页6004705MMNADP00480。
16、25U/MLGABASE来源于PSEUDOMONASFLUORESCENS0049试剂200501M硫酸0051试剂300521MEOPMS、WST8混合试剂和光纯制药CELLCOUNTINGKIT80053使用这些试剂，通过以下的步骤测定GABA浓度。即，使用GABA的浓度调节至01PPM、05PPM、1PPM、5PPM、10PPM、20PPM、50PPM、100PPM的水溶液作为试样，向试样100L中加入90L的试剂1，然后将其在30下加热15分钟，接着，混合10L的试剂2，进而加入5L的试剂3，通过酶标仪TEKAN公司制SAPPHIRE根据终点法ENDPOINTMETHOD测定波长470。
17、NM下的吸光度。此外，对试样中添加了100PPM谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸的试样也进行了测定。如图2所示，GABA在至50PPM为止的区间相关系数为0999，显示出较高的线性，能够进行定量测定。此外可知，也没有受到谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸等其他氨基酸的影响。0054实施例20055对食品中的GABA进行定量。0056通过DABSYL衍生物化HPLC法对各种精白米、糙米、发芽糙米的水提取物中的GABA含量进行测定并比较，结果如图3所示，得到0999的非常高的相关系数。由此可知，能够通过精度与HPLC法同等的比色分析进行定量。0057实施例30058对发芽糙米中的GABA进行定量。005。
18、9将精白米、糙米浸渍到水中，对发芽的情况下的GABA进行定量。对泰国产的各种糙米试样进行水浸渍处理，通过实施例1所示的方法测定处理前后的GABA含量，结果在低温干燥米和日晒干燥米中确认到GABA含量的增加。另一方面，在泰国经雨期广泛应用的高温干燥处理的大米中，GABA生成酶失活，如图4所示未出现GABA的增加，确认了本法的可靠性。0060实施例40061对巧克力中的GABA进行定量。0062通过本法及HPLC法对市售巧克力中所含的GABA进行定量。用热水对添加有GABA的巧克力及通常的巧克力进行提取，通过实施例1所示的方法测定GABA含量。在添加有GABA的巧克力中定量出289584PPM的G。
19、ABA，在同一条件下，从通常的巧克力中未检测到GABA。在HPLC法中，在添加有GABA的巧克力中定量出296554PPM的GABA，在通常的巧克力中未检测到GABA。由这些结果可确认，本发明的方法对于添加有GABA的食品中的GABA含量的保证也是有效的。0063实施例50064对清凉饮料中的GABA进行定量。0065与实施例1同样地对市售清凉饮料水中所含的GABA进行定量。测定添加有GABA的清凉饮料及添加有氨基酸的清凉饮料中的GABA含量，结果在添加有GABA的清凉饮料中定量出984295PPM的GABA，在同一条件下，在不含GABA的添加有氨基酸的清凉饮料中未检测到GABA。由这些结果可。
20、确认，本发明的方法对于添加有GABA的清凉饮料中的GABA含说明书CN102007219ACN102007232A5/5页7量的保证是有效的。0066由这些结果可确认，通过本发明的方法，能够保证广泛的食品中的GABA含量。0067比较例0068对代替水溶性甲臜WST8而使用非水溶性甲臜即MTT的方法进行比较。0069在各种精白米、糙米、发芽糙米的水提取物中，使用MTT34，5二甲基2噻唑基2，5二苯基2H四唑溴化物时，即使低浓度下反应产物也发生沉淀，沉积在微孔板表面，因而无法进行分析。认为这是由于食品的水提取物中所含的蛋白质等和MTT甲臜共沉淀而导致的。进而，对含有GABA的巧克力水提取物中的。
21、GABA进行分析时，提取物中所含的有色物质所产生的可见光部的吸收妨碍了分析。0070另一方面，适用水溶性甲臜的情况下，没有溶解性的问题，通过增加甲臜浓度，能够解决问题。0071首先，基本上提供一种简便地对GABA进行定量的方法，其特征在于，其包括以下工序第一工序，为了排除结构与GABA类似的谷氨酸等氨基酸，使用特异性转氨酶、及要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADP。作为辅酶的脱氢酶，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADPH。；和第二工序，在四唑盐的存在下，使电子载体作用于所生成的NADPH，测定所生成的水溶性甲臜染料。0072详细而言，一种简便地对GABA进行定量的方法。
22、，其特征在于，其包括以下工序第一工序，为了排除结构与GABA类似的谷氨酸等氨基酸，使用特异性转氨酶、及要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADP。作为辅酶的脱氢酶，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸以下称作NADPH。后，添加硫酸；和第二工序，在四唑盐的存在下使电子载体作用于所生成的NADPH，测定所生成的水溶性甲臜染料。0073更详细而言，一种饮食品中的氨基丁酸的定量方法，其特征在于，0074该方法对饮食品中的氨基丁酸进行定量，其包括以下工序00751使食品的水提取液或饮料、氨基丁酸转氨酶、和要求氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶的脱氢酶反应，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸后，添。
23、加硫酸的工序；00762在生成水溶性甲臜染料的四唑盐的存在下，使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸与电子载体反应，从而生成水溶性甲臜染料的工序；00773测定水溶性甲臜的工序。这里，四唑盐为22甲氧基4硝基苯基34硝基苯基2H四唑钠盐。0078另外，由前述的本发明的原理可知，本发明的对氨基丁酸进行定量的方法并不限定于实施例所示的饮食品中的氨基丁酸的定量，也适用于含有结构与GABA类似的谷氨酸等氨基酸的测定试样、例如生物待测物试样。说明书CN102007219ACN102007232A1/2页8图1图2说明书附图CN102007219ACN102007232A2/2页9图3图4说明书附图CN102007219A。