技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列，更具体地，涉及一种按植物 偏爱密码子的hHscFv基因序列。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)恶性程度极高，发病隐匿、 转移早、死亡率高，严重地危害人类健康，在众多致死性肿瘤中居第4位，在我 国排第2位。传统的手术和放、化疗方法治疗肝癌有易复发、杀伤肿瘤细胞靶向 性差的缺陷，抗体是目前肿瘤治疗中靶标最明确的特异靶向药物。不过完整抗 体因分子量大(难以进入肿瘤组织)、免疫源性(目前抗体多为鼠源)、用量 大和价格昂贵等因素，临床应用受限。因而，生产分子量小、人源化的单链抗 体是目前肿瘤靶向治疗的主要趋势，基因工程技术为人源化单链抗体的设计和 生产提供了可能。
经对现有技术文献的检索发现，虽然利用基因工程技术在人源化抗肝细胞 癌单链可变区抗体(human-originate hepatocellular carcinoma single chain variable fragments，hHscFv)表达研究取得了一些进展，如付勇等(生物技 术通讯，2003，14(5)：353-356)、袁清安等(生物工程学报，2000，16(1)： 86-90)和Zhang等(World J Gastroenterol 2004，10(13)：1872-1875)利用 原核系统(大肠杆菌)成功地表达了人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体。不过 包括细菌在内的原核表达系统和真核表达素统如酵母、动物细胞和转基因动物 等在规模化生产、产品安全和成本方面与植物相比存在明显缺陷(Fischer et al. Transgenic Research，2000，9：279-299；Ma et al.Nature reviews genetics， 2003，4：794-805)，但目前尚未有利用植物系统表达hHscFv的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，本发明提供一种按植物偏爱密码 子的hHscFv基因序列，在本发明中公开了一种按植物偏爱密码子设计合hHscFv 基因序列和上述基因编码蛋白质分子的序列。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明按植物偏爱密码子合成的DNA 分子，该分子包括：编码具有hHscFv抗体活性多肽的核苷酸序列，该核苷酸序 列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第51-812位的核苷酸序列有至少70％的同源性， 该序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
所述的核苷酸序列在50-65℃下用洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)或洗膜液 II(0.1*SSC，0.1％SDS)(详见公开文献：金冬雁，等译著.《分子克隆实验指南》， 第2版，北京，科学出版社，2002)洗涤膜，与SEQ ID NO.1中从核苷酸第51-812 位的核苷酸序列杂交。
所述的hHscFv抗体活性多肽，其在植物中表达，包括：具有SEQ ID NO.2 氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
在本发明提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。用该载体转化的宿主 细胞是真核细胞。在实例中该宿主细胞是番茄和烟草细胞。
在本发明中，“按植物偏爱密码子”、“人工合成”DNA是指，该DNA或片段 是依据在植物中编码氨基酸密码子使用的偏好通过人工设计和化学合成实现的， 并连入相应的克隆载体(本发明为pUC18质粒)。
在本发明中，术语“人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体(多肽)编码序列” 指编码具有人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第51-812位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1 序列的编码框第51-812位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的 简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1 中第51-812位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2 所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与 SEQ ID NO.1中从核苷酸第51-812位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语 还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第51-812位的核苷酸序列的同源性至少70％， 较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与在植物中表达人源化抗肝细胞癌单链可变区抗 体相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形 式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20 个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加 数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5 个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体(多肽)”指具有人 源化抗肝细胞癌单链可变区抗体蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语 还包括具有与在植物中表达人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50 个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/ 或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地 为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相 似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人源 化抗肝细胞癌单链可变区抗体蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的在植物中表达人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体多肽的变异形式 包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高 或低的严紧条件下能与人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体DNA杂交的DNA所编码 的蛋白、以及利用抗人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体多肽的抗血清或抗体获得 的多肽或蛋白。
在本发明中，“人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体保守性变异多肽”指与 SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多 5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽 最好根据表1进行替换而产生。
表1 hHscFv保守性变异多肽氨基酸替换表 最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
发明还包括人工合成的在植物中表达的人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体 或多肽的类似物。这些类似物与hHscFv的差别可以是氨基酸序列上的差异，也 可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱 导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变 剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物 还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天 然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽 并不限于上述列举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式 如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步 加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行 糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有 磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被 修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、 粘粒和λ噬菌体等。在植物中表达或生产本发明的hHscFv时，可以将hHscFv 编码序列可操作性地连于表达调控序列，从而形成hHscFv的表达载体。
如本发明所用“可操作地连于”术语是指这样一种状况，即线性DNA序列 的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA 作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地 连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列； 如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序 列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读 框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵 母细胞、番茄细胞、烟草细胞及其它植物细胞。
还可用Nothern印迹法技术分析hHscFv基因转录情况，即分析hHscFv的 转录产物RNA在细胞中的存在与否和数量多寡。
hHscFv RNA的Northern印迹分析和特异抗体的hHscFv的Western印迹分 析联合使用，可以证实在生物样本中hHscFv的表达。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该探针分子通常具有 hHscFv核苷酸编码序列的8-50个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。 该探针可用于检测样品中是否存在编码hHscFv的核酸分子。
本发明还提供了一种检测样品中是否存在编码hHscFv的核苷酸序列方法， 它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地， 该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hHscFv核苷酸编码序列， 并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。更佳地， 该样品是含有hHscFv核苷酸编码序列的DNA分子，其中DNA分子可以使用本领 域常规的方法从转基因生物的基因组中通过分离和纯化获得。
本发明的人源化抗肝细胞癌单链可变区抗体核苷酸编码序列或片段通常可 以用人工合成、PCR或重组方法获得。特别是人工合成方法，可根据本发明所公 开的相关核苷酸序列用本领域研究常用的核酸合成仪来实现。对于PCR方法可根 据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用含有 本发明所公开核酸序列的载体或生物体基因组DNA或mRNA为模板扩增而获得相 关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞 中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合 成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85： 2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化 学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因在植物中高效表 达，所表达的hHscFv多肽或蛋白对肝细胞癌具有特异的靶向性，对肝细胞癌治 疗具有重大应用价值。
具体实施方式
下面结合实验室具体的试验数据和实施例进一步阐述本发明。应理解，这些 实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
实施例1
hHscFv基因设计合成、序列信息和同源性分析
1.hHscFv基因合成(gene synthesis)
hHscFv基因由本实验室根据植物偏爱密码子原则设计并委托上海生工合成 之后连入pUC18载体，即pUC18-hHscFv
2.hHscFv基因序列信息
本发明的按植物偏爱密码子设计合成的hHscFv基因全长为826bp(含保护 碱基和酶切位点组成的接头)，详细序列见SEQID NO.1。其中开放读框位于 51-812位核苷酸，是由重链可变区(VH)(51-428位)、柔性肽3×(Gly4Ser1) 编码区(429-473位)和轻链可变区(VL)(474-812位)构成的开放读框序列。 据此所推导出的全长hHscFv的氨基酸序列共254个氨基酸残基，分子量Mw＝ 27273.3，等电点pI＝8.60。详细序列见SEQ ID NO.2。
3.hHscFv基因同源性分析
将按植物偏爱密码子设计合成的hHscFv基因全长序列及其编码蛋白质序列 用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核 苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与人类抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)scFv 抗体核苷酸序列(GenBank Accession No.AJ549501.1)和氨基酸序列(GenPept Accession No.CAD70712.1)的同源性分别为70％和61％(见表2和表3)；
本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因核苷酸序列与人类 抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)scFv抗体(GenBank Accession No. AJ549501.1) 核苷酸序列同源比较(GAP)，相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出，如 表2：
70％identity in 275nt overlap
Query：475 ttgttatgactcaatctccactttctcttccagttactcttggacaaccagcttctattt 534
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Sbjct：413 ttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct 472
Query：535 cttgcagatcttctcaatctcttgtttactctgatggaaacacttaccttaactggttcc 594
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Sbjct：473 cttgcagagctagtcagagcattgtccacagttatggagacacctatttggaatggcacc 532
Query：595 aacaaagaccaggacaatctccaagaagacttatttacaaggtttctaacagagattctg 654
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Sbjct：533 tgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctg 592
Query：655 gagttccagatagattctctggatctggatctggaactgatttcactcttaagatttcta 714
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Sbjct：593 gggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagaattcacactcaagatcagca 652
Query：715 gagttgaggctgaggatgttggagtttactactgc 749
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Sbjct：653 gagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgc 687
Query：按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因核苷酸序列
Sbjct：人类抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)scFv抗体核苷酸序列
表2按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因核苷酸序列与人类抗乙型肝 炎表面抗原(HBsAg)scFv抗体核苷酸序列同源比较(GAP)。
本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因所编码的氨基酸序列 与人类乙型肝炎表面抗原scFv抗体氨基酸序列(GenPept Accession No. CAD70712.1)同源(FASTA)比较，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸 单字符标出，如表3：
61％identity in 259aa overlap
Query 2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYNMNWVRQVTGKGLEWVSAI--GTAGDQY 59
EVQL+ G L PG SL++SC ASG++FS YN++WV+Q G+GLEW+ I G Y
Sbjct 1 EVQLQQPGAELATPGASLKMSCKASGYSFSTYNIHWVKQTPGRGLEWIGTIYPGIGDTSY 60
Query 60 YDSVKGRFTISRNDSKNTLYLNMNSLRAEDTAVYYCARSPVSLVDGWLYYYYGSV----- 114
KG+ T++ + S +T YL++NSL +ED+AVYYCARS+ YYG+
Sbjct 61 NQKFKGKATLTADKSSSTAYLHLNSLTSEDSAVYYCARSDI---------YYGNYNALDY 111
Query 115 WGQGTLVTVXXXXXXXXXXXXXXXXXDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDG 174
WGQGT VTVSS GGGSGGGG+GGGGS +VMTQ+PLSLPV+LG ASISCR+SQS+V+S G
Sbjct 112 WGQGTSVTVSSSGGGSGGGGTGGGGS-IVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRASQSIVHSYG 170
Query 175 NTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCM 234
+TYL W Q+PGQSP+ LIYKVSNR SGVPDRFSGSGSGT+FTLKISRVEAED+GVY+C
Sbjct 171 DTYLEWHLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDLGVYFCF 230
Query 235 QGTHWSWTFGQGTKVEIKR 253
Q ++ WTFG GTK+E+KR
Sbjct 231 QRSYVPWTFGGGTKLELKR 249
Query：按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv所编码氨基酸序列
Sbjct：人类乙型肝炎表面抗原scFv抗体氨基酸序列
表3按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv所编码氨基酸序列与人类乙型肝 炎表面抗原scFv抗体氨基酸序列比较(FASTA)。
通过对hHscFv基因的核苷酸序列和所编码氨基酸序列与人类抗乙型肝炎表 面抗原scFv抗体基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AJ549501.1)和氨基 酸序列(GenPept Accession No.CAD70712.1)比较，从表2和表3可见，本实 施例的按植物偏爱密码子设计人工合成的hHscFv基因与人类抗乙型肝炎表面抗 原scFv抗体基因无论是在核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。人类抗乙 型肝炎表面抗原scFv抗体对被肝炎侵染的肝脏细胞具有特异的靶向性，对肝细 胞癌治疗具有重大应用价值，因此可以认为按植物偏爱密码子设计合成的 hHscFv，在植物中表达对肝细胞癌的治疗具有相似的功能。
实施例2
hHscFV基因表达载体构建
1.酶切(restriction enzyme cutting)
将含有hHscFv基因pUC-18克隆载体(pUC18-hHscFv)用Bam H I和Sac I 双酶切，获得带有Bam H I及Sac I粘性末端(与表达载体相同)的hHscFv基 因的DNA片段；
2.连接(ligation)
将切下的hHscFv基因连入已经用Bam H I及Sac I切好的质粒pBI121或 用pBI121改造过的pCAMBIA2300植物表达载体大片段中，用蓝白筛选或PCR方 法检测转化的大肠杆菌，从而获得阳性克隆。
3.目的基因的PCR检测
根据所述基因的核苷酸序列，设计引物：hHscFvF：5’-atg gag gtt caa ctt gtt gag-3’(正向引物)，hHscFvR：5’-tct ctt aat ctc aac ctt agt -3’(反向引物SEQ ID NO.4)，以含所述基因的载体或宿主菌为模板进行PCR 扩增，PCR条件为94℃3分钟，随之以94℃40秒、60℃40秒和72℃ 1分钟 10秒进行35个循环，最后以72℃延伸8分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩 增片段长度为762bp。
本实施例通过酶切、连接和PCR检测获得了植物双元表达载体，并证实了 该表达载体是所期望的含有目的基因hHscFv的植物双元表达载体。
实施例3
hHscFv在番茄和烟草真核细胞表达
1.含目hHscFv基因植物表达载体的工程菌制备
将实施例2所获得的含有hHscFv基因的植物表达载体，通过酶切鉴定和测 序，在确保表达载体中的hHscFv基因连接和阅读框架正确的前提下，再将所构 建的载体转入农杆菌(如EHA105)中获得用于植物遗传转化的工程菌，利用农 杆菌介导法转化番茄和烟草。
2.农杆菌介导法转化番茄
①将番茄(Lycopersicon esculentum.var.cerasiforme cv.Yellow fruit No.22)(22#黄樱桃番茄)种子用75％乙醇和20％次氯酸钠灭菌后播于1/2MS培 养基上，待6~8天子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片(小段)用于转化；
②农杆菌过夜培养，待菌摇至OD600＝0.8~1.0，室温下6,000g离心5~8min；
③弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，然后加入准备好的外植体(子叶 或下胚轴)浸泡8~10分钟；
④取出染菌后的外植体，用无菌吸水纸吸去多余菌液；然后将外植体放在共 培养的MS1培养基(MS+ZT 1.0mg/L+I AA 1.0mg/L)上，共培养36小时；
⑤共培养后将外植体转移到含kanamycin的分化筛选培养基(MS+ZT 1.0mg/L +IAA 1.0mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，在25-28℃光照下培养，3~4周 可见形成抗性愈伤组织或再生芽；
⑥待再生芽长至约3-4厘米时将再生芽切下移植到生根培养基(1/2MS+ NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L+Cb 250mg/L)上进行生根培养，7~10天左右生 根；
⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净根系上所附着的固体培养基，在 珍珠岩中驯化并用1％的MS补充营养和水分，一周后移入土中。
3.农杆菌介导法转化烟草
①取含表达载体的农杆菌500μL接种于100mL LB+Rif(40mg/L)+ Str(25mg/L)+Kan(75mg/L)液体培养基中，28℃过夜摇菌，使其OD600≈0.8-1.0， 8000rpm下离心收集菌体并用等体积的MS重悬备用；
②用灭菌剪刀将健壮无菌烟草(Nicotiana tabacum L.cv.BaiRihong)(百 日红)苗的幼嫩叶片剪成0.6×0.6cm2见方叶盘(去主脉)，为防止叶盘脱水置 其于MS1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)培养基上；
③取约120~150片叶盘在放入用MS重悬农杆菌中，在60-80rpm摇床上室温 摇动10min，使农杆菌被叶盘充分吸附；
④吸附完成后用灭菌吸水纸吸去多余菌液；
⑤将吸干的叶盘小心置于加盖一层滤纸的共培养的MS1培养基上(叶盘间不 要叠加在一起)，用parafilm封好培养皿，于暗黑处25℃共培养48小时； 将共培养后的叶盘直接转入分化培养基MS2(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ Kan45mg/L+Cb400mg/L)上，尽可能使叶盘边缘与培养基接触，每2周转接1 次，其间培养条件为25℃，光周期14小时/10小时(光/暗)；
⑥待叶盘边缘的再生芽长至3-4厘米(约30天)，切下置于生根培养基1/2MS 中生根；
待生根后用水冲去根部粘附的培养基，然后栽入盛有预先用自来水清洗过的 珍珠岩的营养钵中，驯化7-10天后移入带有营养土的花盆中，细心养护，用于 以后的研究。
4.hHscFv基因在转基因番茄或烟草基因组中拷贝数分析
采用常规方法从番茄或烟草叶片(果实)中提取DNA(参考《分子克隆》， Sambrook等，1989)，分别用Hind III、Xba I、Bam H I和Eco R I酶切DNA[30 μg(微克)/样品]后，将酶切后的DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTM Contents CDP-StarTM labelling module (PRN3540)，将hHscFv基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16 小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次 15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，0.1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15 分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled 试剂盒说明书)。依据(Southern blot)的杂交膜上出现的杂交条带，确定hHscFv 基因在转基因番茄或烟草基因组中的拷贝数。
5.hHscFv在转基因番茄和烟草植株中转录水平表达(Northern blot)
1)RNA的提取：取转基因烟草和番茄(以非转基因烟草“百日红”和“22# 黄樱桃番茄”作阴性对照)嫩叶，用TRIzol试剂盒(GIBCO BRL，USA)提取并 参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2)RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260； RNA含量计算：1OD260＝40μg/mL。
3)总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：①取6mL 25*(倍)电泳缓冲液，加入117mL 无菌水，混匀。②称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化， 转入55℃水浴中。③于通风橱中取26.8mL甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混 匀。④迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。⑤将提取的RNA (20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。⑥在 样品中加入2uL 10*上样缓冲液，混匀。⑦在电泳液未盖过胶的条件下点样， 5V/cm电压电泳5小时左右。
4)RNA尼龙膜上转移：①转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。②将湿润的 膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上， 排除气泡。③滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和 一重物，水平放置，转移12-20小时。④转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5)膜上杂交信号的检出：①将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/mL 鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。②将用Gene ImagesTM Contents CDP-StarTMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入①的杂交液中， 于65℃杂交16-24小时。③取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于 65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，0.1％SDS)中于65℃漂 洗3次，每次15分钟。④用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参 照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；未转化烟草和番茄 (阴性对照)未检测到杂交信号，转化hHscFv基因的烟草和番茄的杂交信号在 株间存在一定差异，说明hHscFv基因在转基因烟草和番茄株间在转录水平存在 差异。
6.hHscFv在转基因番茄和烟草植株中翻译水平表达(western blot)
1)蛋白提取(在冰上进行)
①取50mg叶片，加入100uL 1×PBS(KH2PO40.2gL，Na2HPO41.15g/L，KCl0.2g/L，NaCl 8g/L)于1.5mL离心管中研磨；②13000rpm 4℃离心10分钟； ③取上清，备用。
2)蛋白定量：参考Bradford法(Bradford，1976)，取2uL蛋白样品加1mL； Bradford试剂混匀后，分光光度计测OD595。
3)SDS-PAGE分离蛋白：SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等， 1989)；
①加样前样品中加入少量的含50mM/L DTT加样缓冲液(2×加样缓冲液：甘 油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81mL；溴酚兰0.01％，H2O定容至20mL)，煮沸10分 钟；②室温100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿 达到凝胶底部。
4)蛋白质向硝酸纤维膜上转移
①转移之前，用转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0.037％SDS， 20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；②室温下用半干式电转仪转移1小时， 凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；
5)硝酸纤维膜蛋白检测
①将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液：取 5g脱脂奶粉溶于100mL 1×PBS(含0.5g叠氮钠))；②再将滤膜浸泡在洗涤缓冲 液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；③加入第一抗体(抗hHscFv的抗体)，37 ℃温育30分钟；同步骤②，洗涤三次；④加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复 合物)，37℃温育30分钟；同步骤②，洗涤两次；⑤加入底物显色观察蛋白条 带。
本实施例通过步骤1、2和3的实施获得了含HHscFv工程菌和转HHscFv基因的 番茄和烟草植株。Southern blot分析显示，在转hHscFv的番茄和烟草基因组中 外源基因HHscFv拷贝数为1-5个，而阴性对照却未检测到信号，说明外源基因 HHscFv已成功地整合到转基因番茄和烟草基因组中。Northern blot和Western blot分析表明，外源基因hHscFv在转基因番茄和烟草中已成功表达(在转录和翻 译水平)，而非转基因番茄和烟草植株中却未检测到hHscFv的表达，说明hHscFv 已成功在转基因植物中表达。在植物中高效表达hHscFv蛋白，不仅可能提高该蛋 白或多肽的安全性和生产成本，对肝细胞癌治疗也具有重要应用价值。
<110>上海交通大学
<120>按植物偏爱密码子的hHscFv基因序列
<160>2
<170>Patent In version 3.3
<210>1
<211>826
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(51)...(812)
<223>按植物偏爱密码子原则设计合成，编码hHscFv蛋白
<400>1
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tcggacaagg aactaaggtt gagattaaga gataatagga gctcgg 826
<210>2
<211>254
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
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