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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710840829.6 (22)申请日 2017.09.18 (71)申请人 武汉科前生物股份有限公司 地址 430070 湖北省武汉市东湖高新技术 开发区高新二路419号 (72)发明人 董俊李冉徐高原金梅林 陈焕春 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 董建林徐瑛 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.0。
2、1) (54)发明名称 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方 法 (57)摘要 本发明公开了一种空肠弯曲菌的活菌定量 检测引物及方法。 本发明依据空肠弯曲菌的马尿 酸酶hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物， 并在此基础上建立针对空肠弯曲菌的MPN-PCR 快速定量检测方法， 包括如下步骤S1.禽肉前处 理； S2.PCR反应； S3.PCR产物鉴定； S4.计算样 品中活菌含量： 根据PCR鉴定结果， 确定空肠弯曲 菌阳性的试管数， 按照MPN法稀释度选择原则， 选 择三个连续稀释度， 查MPN检索表， 报告每g或每 mL样品中的值。 本发明运用所述引物对应的MPN- PCR方法， 检测。
3、结果可信度高， 可以用于市场上禽 肉制品的空肠弯曲菌快速定量检测， 为养禽业中 食源性病原菌的防控和禽肉类加工销售过程的 监管提供有效的工具。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 107400727 A 2017.11.28 CN 107400727 A 1.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物， 其特征在于， 依据空肠弯曲菌的马尿酸酶 hipO基因设计的一对特异性PCR检测引物： HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG； HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。 2.一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 包括如下步骤： S1. 。
4、禽肉前处理： 将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液， 将所述匀浆 液进行5个连续梯度的10倍稀释， 在微需氧环境下进行增菌培养； S2. PCR反应： 将上述增菌培养的样品， 离心弃上清， 用双蒸灭菌水重悬沉淀， 水浴煮沸 5min后冰浴5min， 离心， 取上清作为PCR模板； 取PCR模板5 L， 权利要求1所述的上、 下游引 物各1 L， 2Es Taq MasterMix 10 L， 灭菌双蒸水8 L， 混匀， 进行PCR扩增； S3. PCR产物鉴定： PCR扩增结束后， 进行琼脂糖凝胶电泳， 观察， 735bp处有条带即为阳 性， 拍照并分析试验结果； S4. 计算样。
5、品中活菌含量： 根据PCR鉴定结果， 确定空肠弯曲菌阳性的试管数， 按照MPN 法稀释度选择原则， 选择三个连续稀释度， 查MPN检索表， 报告每g或每mL样品中的值。 3.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 步骤S1所 述的增菌培养条件为在42培养48h。 4.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 步骤S2所 述的2Es Taq MasterMix包括： Es Taq DNA Polymerase， 2Es Taq PCR Buffer， 3 mM MgCl2， 400 M dNTPmix。 5.根据权利要求2所述的一种空肠弯。
6、曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 步骤S2所 述的PCR扩增条件为： 94 预变性5 min， 94变性30 s， 60退火30 s， 72延伸1 min， 进 行30个循环， 72再延伸10 min。 6.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 步骤S2所 述的离心条件均为12000rpm离心5min。 7.根据权利要求2所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 步骤S3所 述的凝胶电泳条件为120 V 电压电泳 30 min。 8.根据权利要求27任一项所述的一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 其特征在于， 所述的禽肉为鸡肉。 权利要求书 。
7、1/1 页 2 CN 107400727 A 2 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法 技术领域 0001 本发明属于微生物检测技术领域， 更具体地， 涉及一种空肠弯曲菌的活菌定量检 测引物及方法。 背景技术 0002 空肠弯曲菌是鸡群中较为常见的人畜共患致病菌， 且流行趋势呈逐年递增， 不仅 对我国的畜禽养殖业造成了严重的危害， 而且在一定程度上还会导致家禽产品及食品的污 染， 对人类和动物的健康造成了巨大的威胁， 危害公共卫生安全。 0003 因此， 调查了解该病原菌对日常生活中禽肉产品的污染程度， 对控制食品中空肠 弯曲菌的污染， 以及减少人类食源性疾病的发生显得尤为重要。 但目前为止。
8、， 病原菌的定量 检测以传统的平板活菌计数为主， 操作繁琐、 耗时费力， 且存在由于病原菌进入可存活但不 可培养(VBNC)状态所导致的漏检， 而单纯采用MPN法(Most Probable Number， 最大可能数 法)则需要通过生化实验进行进一步鉴定， 同样操作繁琐。 0004 在分子生物学飞速发展的今天， 荧光定量PCR也被用于微生物的定量检测， 它具有 快速简单、 特异性强和敏感性高等特点。 中国专利公开号105420404 A公开了一种鉴别空肠 弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌双重PCR引物及其鉴别方法， 以空肠弯曲杆菌特有的hipO靶基因 设计引物， 取样本基因组DNA进行PCR扩增， 当。
9、电泳检测在653bp和313bp位置有两条扩增条 带表示样品为阳性， 鉴别出样品中含有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。 但该方法只能对反 应体系中模板DNA进行定量， 不能鉴别污染食品中死活菌体， 无法准确测出污染食品的活菌 量。 发明内容 0005 针对上述现有技术中的问题， 本发明旨在将MPN法和PCR技术相结合， 提供一种空 肠弯曲菌的活菌定量检测引物， 并建立针对空肠弯曲菌的MPN-PCR快速定量检测方法。 0006 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。 0007 一种用于空肠弯曲菌的活菌定量检测引物， 依据空肠弯曲菌的马尿酸酶hipO基因 设计的一对特异性PCR检测引物(如序列。
10、表SEQ ID NO.12所示)： 0008 SEQ ID NO.1： HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG； 0009 SEQ ID NO.2： HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。 0010 上述引物进行了特异性检测， 具体方法为： 0011 取大肠杆菌菌液、 产气荚膜梭菌菌液、 空肠弯曲菌菌液、 沙门氏菌菌液提取细菌 DNA做模板， 用上述引物进行PCR扩增， 对引物进行特异性检测。 反应体系为25 L， 包括： 2 EsTaq MasterMix 10 L， 模板2.5 L， 上、 下游引物各1 L， 灭菌双蒸水10.5 L， 混匀。 PCR扩。
11、增 条件为： 945min， 9430s， 6030s， 721min， 进行30个循环， 72再延伸10min。 同时以 双蒸灭菌水为模板， 设为阴性对照进行同条件扩增。 实验结果确定上述引物具有检测空肠 弯曲菌的特异性。 说明书 1/5 页 3 CN 107400727 A 3 0012 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 包括如下步骤： 0013 S1.禽肉前处理： 将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液， 将所述 匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释， 在微需氧环境下进行增菌培养； 0014 S2.PCR反应： 将上述增菌培养的样品， 离心弃上清， 用双蒸灭菌水重悬沉淀， 水。
12、浴 煮沸5min后冰浴5min， 离心， 取上清作为PCR模板； 取PCR模板5 L， 序列表SEQ ID NO.12所 述的上、 下游引物各1 L， 2Es Taq MasterMix 10 L， 灭菌双蒸水8 L， 混匀， 进行PCR扩增； 0015 S3.PCR产物鉴定： PCR扩增结束后， 进行琼脂糖凝胶电泳， 观察， 735bp处有条带即 为阳性， 拍照并分析试验结果； 0016 S4.计算样品中活菌含量： 根据PCR鉴定结果， 确定空肠弯曲菌阳性的试管数， 按照 MPN法稀释度选择原则， 选择三个连续稀释度， 查MPN检索表， 报告每g或每mL样品中的值。 0017 优选地， 步骤。
13、S1所述的增菌培养条件为在42培养48h。 0018 优选地， 步骤S2所述的2Es Taq MasterMix包括： Es Taq DNA Polymerase， 2 Es Taq PCR Buffer， 3mM MgCl2， 400 M dNTPmix。 0019 优选地， 步骤S2所述的PCR扩增条件为： 94预变性5min， 94变性30s， 60退火 30s， 72延伸1min， 进行30个循环， 72再延伸10min。 0020 优选地， 步骤S2所述的离心条件均为12000rpm离心5min。 0021 优选地， 步骤S3所述的凝胶电泳条件为120V电压电泳30min。 0022。
14、 优选地， 所述的禽肉为鸡肉。 0023 优选地， 步骤S1所述培养液为添加有相应抗生素的布氏肉汤； 所述匀浆液获得的 条件为5000rpm速度进行匀浆。 0024 优选地， 步骤S2进行PCR扩增时， 同时以提取的标准菌DNA和双蒸灭菌水为模板， 分 别设为阳性对照和阴性对照进行同条件PCR扩增。 0025 优选地， 步骤S3中为1琼脂糖凝胶， 取8 L PCR产物和5 L DL2000DNAMarker加 样， 进行琼脂糖凝胶电泳。 0026 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 本发明设计的PCR检测引物具有较高的 特异性， 运用所述引物对应的MPN-PCR方法， 检测结果可信度高，。
15、 可以用于市场上禽肉制品 的空肠弯曲菌快速定量检测， 为养禽业中食源性病原菌的防控和禽肉类加工销售过程的监 管提供有效的工具， 还对食品公共卫生安全领域中食源性病原菌的检测等诸多领域提供一 定的帮助。 附图说明 0027 图1为本发明所述引物的特异性检测结果； M： DNA Marker 2000； 1： 大肠杆菌； 2： 产 气荚膜梭菌； 3： 空肠弯曲菌； 4： 沙门氏菌； 5： 阴性对照。 0028 图2为本发明空肠弯曲菌MPN-PCR法与平板计数法相关性结果。 具体实施方式 0029 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 。
16、应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 除非特别说明， 本发明采用的试剂、 方法和设备为本技术领域常规试剂、 方法 说明书 2/5 页 4 CN 107400727 A 4 和设备。 0030 以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。 0031 实施例1PCR特异性引物的设计与合成 0032 依据空肠弯曲菌特有的马尿酸酶hipO基因设计一对特异性PCR检测引物， 由生工 生物工程(上海)股份有限公司合成， 如序列表SEQ ID NO.12所示。 0033 SEQ ID NO.1： HIP-F1 GAAGAGGGTTTGGGTGGTG； 0034。
17、 SEQ ID NO.2： HIP-R1 AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG。 0035 将上述引物进行特异性检测： 取大肠杆菌菌液、 产气荚膜梭菌菌液、 空肠弯曲杆菌 菌液、 沙门氏菌菌液提取细菌DNA做模板， 用空肠弯曲杆菌hipO基因引物进行PCR扩增， 对引 物进行特异性检测。 0036 反应体系为25 L， 包括： 2EsTaq MasterMix 10 L， 模板2.5 L， 上、 下游引物各1 L， 灭菌双蒸水10.5 L， 混匀。 PCR扩增条件为： 945min， 9430s， 6030s， 721min， 进行 30个循环， 72再延伸10min。 同时以双蒸灭。
18、菌水为模板， 设为阴性对照进行同条件扩增。 hipO引物特异性检测结果见图1。 0037 实施例2空肠弯曲菌活菌定量检测方法的建立 0038 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测方法， 包括如下步骤： 0039 S1.禽肉前处理： 将采集的肉样加培养液制成质量体积比为1:9的匀浆液， 将所述 匀浆液进行5个连续梯度的10倍稀释， 在微需氧环境下进行增菌培养； 0040 S2.PCR反应： 将上述增菌培养的样品， 离心弃上清， 用双蒸灭菌水重悬沉淀， 水浴 煮沸5min后冰浴5min， 离心， 取上清作为PCR模板； 取PCR模板5 L， 实施例1所述的上、 下游引 物各1 L， 2Es Taq Mas。
19、terMix 10 L， 灭菌双蒸水8 L， 混匀， 进行PCR扩增； 0041 S3.PCR产物鉴定： PCR扩增结束后， 进行琼脂糖凝胶电泳， 观察， 735bp处有条带即 为阳性， 拍照并分析试验结果； 0042 S4.计算样品中活菌含量： 根据PCR鉴定结果， 确定空肠弯曲菌阳性的试管数， 按照 MPN法稀释度选择原则， 选择三个连续稀释度， 查MPN检索表， 报告每g或每mL样品中的值。 0043 实施例3鸡肉中空肠弯曲菌活菌定量检测 0044 本实施例在实施例2的基础上， 分次多点采集鸡肉作为禽肉实验样本， 用保鲜袋包 好采集的样品于冰盒中运送到实验室。 0045 具体的实验步骤如。
20、下： 0046 S1.禽肉前处理： 在无菌超净台中， 将采集的鸡肉肉样剪碎， 并称取10g放入200mL 的无菌烧杯中， 加入90mL布氏肉汤， 用匀浆器以5000rpm速度进行匀浆， 获得匀浆液； 0047 样品的增菌培养： 取1mL所述匀浆液入9mL空肠弯曲杆菌的布氏肉汤(已经添加了 相应的抗生素)增菌液中， 振荡试管使其混匀， 再从混匀的稀释液中取1mL加入9mL布氏肉汤 增菌液中， 依此方法共进行5个连续梯度的10倍系列稀释， 每个梯度平行接种3管， 42微需 氧环境下增菌培养48h。 0048 S2.PCR反应： 取2mL上述增菌培养获得的样品， 12000rpm离心5min， 弃上。
21、清液， 用50 L双蒸灭菌水重新悬浮沉淀， 置于100水浴中煮沸5min， 冰浴5min， 12000rpm离心5min， 取 上清液作为PCR模板。 PCR反应体系PCR扩增反应总体积为25 L， 包括： 2Es Taq MasterMix 10L(包括： Es Taq DNA Polymerase， 2Es Taq PCR Buffer， 3mM MgCl2， 400M 说明书 3/5 页 5 CN 107400727 A 5 dNTPmix)， 模板5 L， 实施例1上、 下游引物各1 L， 灭菌双蒸水8 L， 混匀。 PCR扩增条件为： 94 预变性5min， 94变性30s， 60退。
22、火30s， 72延伸1min， 进行30循环， 72再延伸10min。 同时以提取的标准菌DNA和双蒸灭菌水为模板， 分别设为阳性对照和阴性对照进行同条件 扩增。 0049 S3.PCR产物鉴定： 配制1琼脂糖凝胶， 待PCR扩增结束后， 取8 L PCR产物和5 L DL2000DNAMarker加样， 120V电压电泳30min， 进行凝胶紫外成像系统观察， 735bp处有条带 即为阳性， 拍照并分析试验结果。 0050 S4.计算样品中活菌含量： 根据PCR鉴定结果， 确定空肠弯曲杆菌阳性的试管数， 按 照MPN法稀释度选择原则， 选择三个连续稀释度， 查MPN检索表， 报告每g(mL)。
23、样品中的值。 0051 对比例 0052 按照与实施例1相同的设计原则， 设计出另一对特异性PCR检测引物， 由生工生物 工程(上海)股份有限公司合成， 如序列表SEQ ID NO.34所示。 0053 SEQ ID NO.3： HIP-F2 ATGATGGCTTCTTCGGATAG； 0054 SEQ ID NO.4： HIP-R2 GCTTCGCATAATAACTTGC。 0055 将以上引物按照实施例1相同的方法进行特异性检测， 仅在空肠弯曲杆菌菌液的 DNA做模板时， 上述引物在598bp处有条带。 0056 将序列表SEQ ID NO.34所示的以上引物替代实施例1中的引物应用在相同。
24、方法 条件下(实施例3)进行的空肠弯曲菌活菌定量检测。 0057 应用例MPN-PCR法和平板计数法的一致性检测 0058 将不同稀释梯度的空肠弯曲杆菌菌液进行MPN-PCR法检测和平板计数， 每个稀释 梯度作为一个独立样品进行两种方法的一致性检测。 MPN-PCR法根据阳性管数和稀释梯度 选择原则， 查MPN检索表(附录)， 计算MPN值； 平板计数选择3个平板上生长的菌落均在30 300个之间的稀释梯度， 进行计数求平均值， 根据平板对应的稀释倍数和接种涂布的量换算 出空肠弯曲杆菌不同稀释梯度的含菌量。 取空肠弯曲杆菌6个样品分别用MPN-PCR法和平板 计数法进行定量检测， 其结果见下表。
25、。 0059 0060 附录 0061 细菌的最可能数(MPN)检索表 说明书 4/5 页 6 CN 107400727 A 6 0062 0063 相关性分析结果表明， SEQ ID NO.12引物对应的MPN-PCR方法与平板计数法相 关性较好， 而SEQ ID NO.34引物对应的MPN-PCR方法与平板计数法相关性较差。 SEQ ID NO.12的MPN-PCR方法与平板计数法线性方程式为y0.9898x-0.1225， R20.9905(如图 2所示)， 该MPN-PCR法检测结果和平板计数结果相关性良好， 即本发明运用SEQ ID NO.12 引物对应的MPN-PCR方法进行空肠弯。
26、曲杆菌定量检测的结果可信。 而在相同设计原则下获 得的其他引物运用至本发明MPN-PCR方法时， 对于禽肉中空肠弯曲菌的活菌定量检测的效 果不佳。 0064 以上详细描述了本发明的实施， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中的具体细 节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这些简单变 型均属于本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 107400727 A 7 SEQUENCE LISTING 武汉科前生物股份有限公司 一种空肠弯曲菌的活菌定量检测引物及方法 4 PatentIn version 3.3 1 19 DNA 人工序列HIP-F1 1 gaagagggtt tgggtggtg 19 2 23 DNA 人工序列HIP-R1 2 agctagcttc gcataataac ttg 23 3 20 DNA 人工序列HIP-F2 3 atgatggctt cttcggatag 20 4 19 DNA 人工序列HIP-R2 4 gcttcgcata ataacttgc 19 序列表 1/1 页 8 CN 107400727 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 107400727 A 9 。