技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测人类NRAS基因突变的试剂盒。
背景技术
RAS基因是一种原癌基因，是细胞生长、增殖和分化中的关键调节因子。正常的RAS蛋白定位于细胞内膜，对GTP和GDP具有高度亲和力，并具有GTP酶的活性。RAS蛋白起着分子开关的作用，当正常表达时，能够调控细胞生长；当发生点突变时，过表达或者基因易位等异常情况会导致细胞异常增殖，并最终引发肿瘤形成。超过30％的人类肿瘤存在RAS基因的突变。RAS基因家族包括KRAS基因、NRAS基因和HRAS基因。近年来，已经在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌以及造血系统肿瘤中检测出了RAS基因的异常：KRAS基因突变通常出现在胰腺癌、肺癌以及结直肠癌实体瘤细胞中，HRAS基因突变一般在膀胱癌肿瘤中较为常见，而NRAS基因突变常常出现在血液肿瘤、黑色素瘤细胞和甲状腺癌细胞中。
NRAS基因编码的NRAS蛋白与RAS家族其它蛋白具有高达85％同源性，所以功能上NRAS蛋白也具有很多RAS家族蛋白共同的特征。NRAS蛋白位于细胞膜内侧，属于一种低分子量G蛋白，对鸟苷酸具有很强的亲和性并具有GTPASe活力；当NRAS蛋白与GDP结合时为失活状态；与GTP结合时为活化状态，激活下游信号通路，因此在信号传导中起着极为重要的开关作用。当NRAS蛋白发生突变时，会导致下游RAF以及MAPK等异常激活从而在肿瘤恶变中起重要作用。NRAS蛋白的突变主要发生第2外显子的密码子12和密码子13，以及位于第3外显子的密码子61上，其中第2外显子的密码子12和第3外显子的密码子61的突变频率最高。
研究表明，如果转移性结直肠癌患者的NRAS基因的第2外显子和第3外显子上发生突变，则不能从抗EGFR靶向治疗中获益，2017版《NCCN结直肠癌临床实践指南》指出只有NRAS基因野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。Douillard JY(2013)等人的研究表明，接受帕尼单抗联合FOLFOX4治疗的患者的其它RAS突变情况可以预测治疗疗效，没有RAS突变的转移性结直肠癌患者使用帕尼单抗联合FOLFOX4治疗可以改善患者总体生存率和无进展生存率。
近年，NRAS基因已被确认为肺癌发生的驱动基因，NRAS基因突变与肺癌治疗中的TKI耐药有关。与吉非替尼敏感的PC-9细胞(C-9/WT)相比，在产生吉非替尼耐药的PC-9细胞中并未检测到NRAS基因、HER2基因等EGFR-TKIs耐药基因，而发现了NRAS基因的61位密码子突变。并且，在吉非替尼或AZD6244/CI1040单独用药均不能促使细胞凋亡的情况下，两者联合用药时则可以有效促进细胞凋亡。因此，NRAS基因突变在肺癌治疗的TKI耐药中可能发挥着重要作用，这为肺癌检测与治疗提供了新的依据和可能。
黑色素瘤近年来已成为发病率增长最快的恶性肿瘤，年增长率约为3％至5％。在黑色素瘤中NRAS基因突变频率一般为20-30％。2012年安德森癌症中心研究结果表明，一种新的药物组合，即以CDK4为药物靶标的抑制剂与MEK抑制剂联合使用可以治疗NRAS基因突变的黑色素瘤患者。同年来自ESMO的PRIME研究的肿瘤基因分析显示：NRAS基因、NRAS基因和BRAF基因突变可作为转移性结肠癌接受帕尼单抗+FOLFOX一线治疗的生物学预测指标。另据2013年Lancet Oncology的一项Ⅱ期临床试验研究显示，对于NRAS基因变异的黑色素瘤患者，MEK162是第一个有效的靶向治疗药物，并且可能为几乎无有效治疗方法的癌症患者提供一种新的治疗选择。因此，对人类NRAS基因突变情况进行检测能指导医生对黑色素瘤等癌症患者进行治疗和预后。
总之，NRAS基因突变在人类黑色素瘤、结直肠癌、肺癌等很多肿瘤的发生发展中具有重要意义。对其突变的检测可准确预测对应靶向药物治疗的有效性，便于临床用药选择，显著提高治疗效果，使患者最大程度受益；同时，还可以避免不合理用药造成的病人医疗费用负担及社会医疗资源浪费，减少不必要的时效损失以及经济损失。
目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高分辨率溶解曲线检测法、高效液相色谱法、ARMS-PCR法等。目前比较常用的是ARMS-PCR法，即扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system ARMS)于1989年建立,该方法灵敏度高，特异性好，但是只可用于对已知突变基因进行检测。Sanger测序法是突变检测的金标准，经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1000bp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999％。由于具有很高的读取准确率，Sanger测序法成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准，对未知突变位点也能有效检出。肿瘤组织中，NRAS野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10～20％，即当突变型细胞占整体检测细胞的10～20％时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。因此，需要建立一种灵敏、快速有效、能一次检测多个突变位点的NRAS基因突变检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测人类NRAS基因是否突变。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测人类NRAS基因突变的试剂盒。
本发明所提供的检测人类NRAS基因突变的试剂盒，可包括组分甲和/或组分乙。
所述组分甲可包括封闭序列甲和引物对甲；
所述封闭序列甲可为单链DNA分子，其中若干核苷酸发生了锁核酸修饰；
所述引物对甲可由用于扩增特异DNA片段甲的两条引物组成；所述特异DNA片段甲中具有靶序列甲；所述靶序列甲可为人类基因组中上游引物F1和下游引物R1组成的引物对甲的靶序列；
所述上游引物F1可为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述下游引物R1可为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述封闭序列甲和所述靶序列甲可满足如下关系(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：
(c1)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的一条链中的50个以上连续核苷酸相同；
(c2)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的正义链中的50个以上连续核苷酸相同；
(c3)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的反义链中的50个以上连续核苷酸相同；
(c4)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的一条链相同；
(c5)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的正义链相同；
(c6)所述封闭序列甲和所述靶序列甲的反义链相同。
所述组分乙可包括封闭序列乙和引物对乙；
所述封闭序列乙可为单链DNA分子，其中若干核苷酸发生了锁核酸修饰；
所述引物对乙可由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成；所述特异DNA片段乙中具有靶序列乙；所述靶序列乙可为人类基因组中上游引物F2和下游引物R2组成的引物对乙的靶序列；
所述上游引物F2可为如下a5)或a6)：
a5)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
a6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述下游引物R2可为如下a7)或a8)：
a7)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
a8)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述封闭序列乙和所述靶序列乙可满足如下关系(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)：
(d1)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的一条链中的50个以上连续核苷酸相同；
(d2)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的正义链中的50个以上连续核苷酸相同；
(d3)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的反义链中的50个以上连续核苷酸相同；
(d4)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的一条链相同；
(d5)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的正义链相同；
(d6)所述封闭序列乙和所述靶序列乙的反义链相同。
上述试剂盒中，所述“若干核苷酸发生了锁核酸修饰”可指每隔2-5个碱基存在一处锁核酸修饰(即锁核酸修饰基本均匀分布)，例如锁核酸修饰的分布为每隔2、3、4或5个未修饰碱基存在一个修饰碱基。
上述试剂盒中，所述封闭序列甲的长度比所述靶序列甲短约20-40个碱基，且所述封闭序列甲的两端与所述上游引物F1和所述下游引物R1分别有大约3-5个碱基的重叠。所述封闭序列乙的长度比所述靶序列乙短约20-40个碱基，且所述封闭序列乙的两端与所述上游引物F2和所述下游引物R2分别有大约3-5个碱基的重叠。
上述试剂盒中，所述封闭序列甲或所述封闭序列乙均可进行化学修饰。所述封闭序列甲在3’端包含防止所述封闭序列甲在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。所述封闭序列乙在3’端包含防止所述封闭序列乙在PCR反应中进行延伸的化学修饰，例如磷酸化修饰、C3-间隔子修饰、C6-间隔子修饰。
上述试剂盒中，所述封闭序列甲和所述靶序列甲具体可满足如下关系：所述封闭序列甲和所述靶序列甲的一条链中的69个连续核苷酸相同。所述封闭序列乙和所述靶序列乙具体可满足如下关系：所述封闭序列乙和所述靶序列乙的一条链中的69个连续核苷酸相同。
上述试剂盒中，所述封闭序列甲的核苷酸序列可如序列表中的序列2所示。
上述试剂盒中，所述引物对甲可由所述上游引物F1和所述下游引物R1组成。
上述试剂盒中，所述封闭序列乙的核苷酸序列可如序列表中的序列6所示。
上述试剂盒中，所述引物对乙可由所述上游引物F2和所述下游引物R2组成。
上述任一所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。上述任一所述试剂盒的制备方法可包括将所述封闭序列甲、所述上游引物F1、所述下游引物R1、所述封闭序列乙、所述上游引物F2、所述下游引物R2分别单独包装的步骤。
上述任一所述试剂盒在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能可为如下b1)或b2)：
b1)鉴定或辅助鉴定待测组织是否为肿瘤组织；
b2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为癌症患者。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测人类NRAS基因突变的方法。
本发明所提供的检测人类NRAS基因突变的方法，可包括如下步骤：采用上述任一所述的试剂盒对人类NRAS基因进行偏向扩增，得到扩增产物；鉴定所述扩增产物中的突变。
上述方法中，所述偏向扩增的反应体系(以下简称偏向扩增体系)可包括所述上游引物F1、所述下游引物R1和所述封闭序列甲。所述偏向扩增的反应体系可包括所述上游引物F2、所述下游引物R2和所述封闭序列乙。所述偏向扩增的反应体系具体可为20μL，由10μL Premix Ex Taq(2×)、0.5μL浓度为10μmol/L的所述上游引物F1、0.5μL浓度为10μmol/L的所述下游引物R1、0.5μL浓度为2.5nM的所述封闭序列甲、1μL待测人类基因组DNA(约50ng)和7.5μL无核酸酶水组成。所述偏向扩增的反应体系具体可为20μL，由10μL Premix Ex Taq(2×)、0.5μL浓度为10μmol/L的所述上游引物F2、0.5μL浓度为10μmol/L的所述下游引物R2、0.5μL浓度为2.5nM的所述封闭序列乙、1μL待测人类基因组DNA(约50ng)和7.5μL无核酸酶水组成。所述Premix Ex Taq(2×)可为TAKARA公司的产品，产品目录号为RR390A。
上述方法中，所述偏向扩增体系的反应条件具体可为：95℃预变性5min 1个循环；95℃变性15s，70.5℃退火90s，84℃关键温度下变性20s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测组织是否为或候选为肿瘤组织的方法，可包括如下步骤：采用上述任一所述的试剂盒分别对待测组织和正常组织进行偏向扩增，然后进行如下判断：
如果所述待测组织的扩增产物与正常组织的扩增产物的核苷酸序列一致，则所述待测组织不为或候选不为肿瘤组织；
如果所述待测组织的扩增产物与正常组织的扩增产物的核苷酸序列不一致，则所述待测组织为或候选为肿瘤组织。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测患者是否为癌症患者的方法，可包括如下步骤：采用上述任一所述的试剂盒分别对待测患者的组织和正常人的组织进行偏向扩增，然后进行如下判断：
如果所述待测患者的组织的扩增产物与所述正常人的组织的扩增产物的核苷酸序列一致，则所述待测患者不为或候选不为癌症患者；
如果所述待测患者的组织的扩增产物与所述正常人的组织的扩增产物的核苷酸序列不一致，则所述待测患者为或候选为癌症患者。
上述任一所述肿瘤组织具体可为人甲状腺癌组织。
上述任一所述癌症具体具体可为人甲状腺癌。
实验表明，采用本发明提供的试剂盒检测人类NRAS基因突变，准确率高，灵敏度也较高(灵敏度可低至0.5％-1％，而常规Sanger测序法的灵敏度仅为10％-20％)，从而大大的降低了检测的假阴性率。因此，采用本发明所提供的试剂盒具有重要的应用价值。
附图说明
图1为细胞系1的偏向扩增的实验结果。
图2为细胞系2的偏向扩增的实验结果。
图3为细胞系3的偏向扩增的实验结果。
图4为细胞系4的偏向扩增的实验结果。
图5为细胞系5的偏向扩增的实验结果。
图6为细胞系6的偏向扩增的实验结果。
图7为细胞系7的偏向扩增的实验结果。
图8为细胞系8的偏向扩增的实验结果。
图9为细胞系9的偏向扩增的实验结果。
图10为实施例4的部分实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Light Cycler 480荧光定量PCR仪为Roche公司的产品。SYBR Premix Ex Taq(2×)和Premix Ex Taq(2×)均为TAKARA公司的产品，产品目录号依次为RR820A和RR390A。
实施例1、封闭序列和引物的设计与合成
一、NRAS基因第2外显子的封闭序列和引物的设计与合成
正常人类NRAS基因的第2外显子及其周边序列如序列表中序列1所示。
5’-TGATTATAGAAAGCTTTAAAGTACTGTAGATGTGGCTCGCCAATTAACCCTGATTACTGGTTTCCAACAGGTTCTTGCTGGTGTGAAATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGAAAAGCGCACTGACAATCCAGCTAATCCAGAACCACTTTGTAGATGAATATGATCCCACCATAGAGGTGAGGCCCAGTGGTAGCCCGCTGACCTGATCCTGTCTCTCACTTGTCGGATCATCTTTACCC-3’(序列表中序列1)
根据突变位置(位于第2外显子的密码子12和密码子13)，设计并合成NRAS基因第2外显子的封闭序列(单链DNA分子)。NRAS基因第2外显子的封闭序列如序列表中序列2所示(斜体带星号的碱基代表该碱基为锁核酸修饰)。
5’-AAT*GACT*GAG*TACAAAC*TG*GTGGT*GGTT*GGAGC*AGGTGG*TGT*TGGG*AAAAGC*GCACT*GACAA*TCC*AGCT-3’(序列表中序列2)
根据突变位置(位于第2外显子的密码子12和密码子13)，设计并合成用于检测NRAS基因第2外显子的引物对甲。引物对甲由上游引物F1和下游引物R1组成。
上游引物F1：5’-TTCTTGCTGGTGTGAAATGA-3’(序列表中序列3)。
下游引物R1：5’-CAAAGTGGTTCTGGATTAGCT-3’(序列表中序列4)。
引物对甲的靶序列为序列表中序列1自5’末端起第72至172位所示的DNA分子(即下划线部分)(101bp)。
二、NRAS基因第3外显子的封闭序列和引物的设计与合成
正常人类NRAS基因的第3外显子及其周边序列如序列表中序列5所示。
5’-GGTTTTTAATAAAAATTGAACTTCCCTCCCTCCCTGCCCCCTTACCCTCCACACCCCCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGTTATAGATGGTGAAACCTGTTTGTTGGACATACTGGATACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAATACATGAGGACAGGCGAAGGCTTCCTCTGTGTATTTGCCATCAATAATAGCAAGTCATTTGCGGATATTAACCTCTACAGGTACTAGGAGCA-3’(序列表中序列5)。
根据突变位置(位于第3外显子的密码子61)，设计并合成NRAS基因第3外显子的封闭序列(单链DNA分子)。NRAS基因第3外显子的封闭序列如序列表中序列6所示(斜体带星号的碱基代表该碱基为锁核酸修饰)。
5’-TGGT*GAAA*CCTGT*TTGT*TGGA*CATA*CTG*GATAC*AGCTG*GACAA*GAAGA*GTACA*GTGCC*ATGA*GAG*ACCA-3’(序列表中序列6)
根据突变位置(位于第3外显子的密码子61)，设计并合成用于检测NRAS基因第3外显子的引物对乙。引物对乙由上游引物F2和下游引物R2组成。
上游引物F2：5’-AACAAGTGGTTATAGATGGTG-3’(序列表中序列7)。
下游引物R2：5’-GCCTTCGCCTGTCCTCATGTA-3’(序列表中序列8)。
引物对乙的靶序列为序列表中序列5自5’末端起第74至180位所示的DNA分子(即下划线部分)(107bp)。
实施例2、检测人类NRAS基因突变的方法
相对于天然寡核苷酸序列，锁核酸对其反向互补的DNA序列有着更强的亲和力。经过反复验证NRAS基因第2外显子的封闭序列和NRAS基因第3外显子的封闭序列中的锁核酸数量及位置，使得关键变性温度Tc(低于封闭序列与靶标DNA之间的Tm值)略高于PCR扩增产物的Tm值。
1、确定产物熔解温度(Tm)
以正常人类细胞的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙在Light Cycler 480荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系见表1，反应条件如下：95℃2min；95℃15s，56℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s，1个循环。PCR最后一步为产物熔解曲线分析：95℃1min，40℃1min，65～85℃。
表1
组分 体积 SYBR Premix Ex Taq(2×) 10μL 上游引物(浓度为10μmol/L) 0.5μL 下游引物(浓度为10μmol/L) 0.5μL 模板 1μL(50ng) 无核酸酶水 8μL
结果表明，NRAS基因第2外显子的野生型产物熔解温度(Tm)为82.5℃；NRAS基因第3外显子的野生型产物熔解温度(Tm)为82℃。
2、关键变性温度(Tc值)的测定
以NRAS基因第2外显子的封闭序列为模板，用上游引物F1和下游引物R1在Light Cycler 480荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系见表1，反应条件如下：95℃5min，1个循环；95℃15s，70.5℃90s，Tx℃20s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。其中Tx(待改变和摸索的温度)，一般从高到低开始测定，通过改变Tx值观察实验结果确定偏向扩增体系中的关键变性温度(Tc值)：初始Tx值以高于Tm值1～2℃为宜，若能扩增出PCR扩增产物，则进一步降低Tx值，每次降低0.5～l℃，直至Tx值降低到不能检测到荧光信号为止(即不能扩增出PCR扩增产物)，则此Tx值上的1个温度梯度则偏向扩增体系或PCR扩增产物的Tc值。
本实验的Tx值从86℃开始。当Tx值设为86℃时，能扩增出PCR扩增产物；进一步降低Tx值为85.5℃、85℃、84.5℃、84℃时，仍能扩增出PCR扩增产物；但当Tx值降低到83.5℃时，则不能扩增出PCR扩增产物。因此，NRAS基因第2外显子的偏向扩增体系的关键变性温度为84℃。
按照上述方法，将NRAS基因第2外显子的封闭序列替换为NRAS基因第3外显子的封闭序列，上游引物F1替换为上游引物F2，下游引物R1替换为上游引物R2，其它步骤均不变，得到NRAS基因第3外显子的偏向扩增体系的关键变性温度为84℃。
综上所述，检测人类NRAS基因突变的具体步骤如下：以待测患者的基因组DNA为模板，采用引物对甲或引物对乙进行偏向扩增(采用引物对甲的PCR反应体系见表2，采用引物对乙的PCR反应体系见表3)，得到PCR扩增产物；然后对PCR扩增产物进行测序，从而判断待测患者NRAS基因是否发生突变。
偏向扩增体系的反应条件：95℃预变性5min 1个循环；95℃变性15s，70.5℃退火90s，84℃关键温度下变性20s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
表2
表3
实施例3、灵敏度实验
对人甲状腺癌WRO细胞系的NRAS基因进行点突变，得到分别含有NRAS基因第2外显子和第3外显子的不同组成型突变的9株细胞系。9株细胞系的详细信息见表4。
表4
采用上述9株细胞系进行灵敏度实验，具体步骤如下：
1、建立上述9株细胞系的培养方法，并且提取8株细胞系的全基因组DNA。
2、采用梯度稀释法，将8株细胞系的全基因组DNA分别按照一定比例(1：5、1:10、1:20、1:100或1:200)与正常人类细胞的全基因组DNA混合，得到混合DNA。
3、以混合DNA为模板，采用引物对甲或引物对乙进行偏向扩增(突变区域为第2外显子的PCR反应体系见表5，突变区域为第3外显子的PCR反应体系见表6)，得到PCR扩增产物；然后由北京梓熙生物有限公司对PCR扩增产物进行Sanger测序，计算灵敏度。
偏向扩增体系的反应条件：95℃预变性5min 1个循环；95℃变性15s，70.5℃退火90s，84℃关键温度下变性20s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
表5
表6
实验结果见图1至图9。结果表明，本发明提供的方法检测细胞系1、细胞系2、细胞系3、细胞系4、细胞系6和细胞系7的最低突变DNA比例均为1:200(0.5％)，比传统sanger测序的方法提高了20倍；本发明提供的方法检测细胞系5、细胞系8和细胞系9的最低突变DNA比例均为1:100(1％)，比传统sanger测序的方法提高了10倍。
实施例4、临床样本验证
1、模板制备
取112例甲状腺癌患者(甲状腺癌患者均知情同意)的石蜡包埋组织切片样本，然后提取基因组DNA(测定基因组DNA的浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μL；OD260nm/OD280nm在1.8-2.0之间)。
2、分别以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物对甲或引物对乙进行偏向扩增(采用引物对甲的PCR反应体系见表2，采用引物对乙的PCR反应体系见表3)，得到PCR扩增产物；然后对PCR扩增产物进行测序，从而判断待测患者NRAS基因是否发生突变。
偏向扩增体系的反应条件：95℃预变性5min 1个循环；95℃变性15s，70.5℃退火90s，84℃关键温度下变性20s，56℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
部分实验结果见图10(A为突变类型为Q61K的检测结果，B为突变类型为Q61R的检测结果，C为突变类型为G12D的检测结果，D为突变类型为G13D的检测结果)和表7。结果表明，112例甲状腺癌患者中，3例患者的NRAS基因第2外显子发生了突变，其中突变区域为密码子12的2例，突变区域为密码子13的1例，6例患者的NRAS基因第3外显子发生了突变，总检出率8％。
表7
采用ARMS-PCR方法对112例甲状腺癌患者的NRAS基因进行检测。ARMS-PCR方法检测的实验结果与本发明提供的方法的实验结果完全一致。
因此，采用本发明所提供的方法检测待测患者NRAS基因是否发生突变，准确率高，具有重要的应用价值。
<110> 北京福安华生物科技有限公司
<120> 一种检测人类NRAS基因突变的试剂盒
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgattataga aagctttaaa gtactgtaga tgtggctcgc caattaaccc tgattactgg 60
tttccaacag gttcttgctg gtgtgaaatg actgagtaca aactggtggt ggttggagca 120
ggtggtgttg ggaaaagcgc actgacaatc cagctaatcc agaaccactt tgtagatgaa 180
tatgatccca ccatagaggt gaggcccagt ggtagcccgc tgacctgatc ctgtctctca 240
cttgtcggat catctttacc c 261
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 2
aatgactgag tacaaactgg tggtggttgg agcaggtggt gttgggaaaa gcgcactgac 60
aatccagct 69
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ttcttgctgg tgtgaaatga 20
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caaagtggtt ctggattagc t 21
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gattcttaca gaaaacaagt ggttatagat ggtgaaacct gtttgttgga catactggat 120
acagctggac aagaagagta cagtgccatg agagaccaat acatgaggac aggcgaaggc 180
ttcctctgtg tatttgccat caataatagc aagtcatttg cggatattaa cctctacagg 240
tactaggagc a 251
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<220>
<223>
<400> 6
tggtgaaacc tgtttgttgg acatactgga tacagctgga caagaagagt acagtgccat 60
gagagacca 69
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
aacaagtggt tatagatggt g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 8
gccttcgcct gtcctcatgt a 21