技术领域
本发明涉及肿瘤细胞和肿瘤细胞原代培养领域，特别涉及一种人原代肿瘤细胞分离制备方法。
背景技术
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的调控，导致细胞的异常增生而形成的新生物，随着人民物质文化生活水平的提高，生活行为方式的改变，大气与环境污染的日趋严重以及人口老龄化寿命的延长等原因，我国人口的死亡谱已发生了很大的变化，恶性肿瘤等非传染性、慢性、中老年疾病已成为中国居民死亡的主要原因，成为人们关注的社会问题，肿瘤是常见的恶性肿瘤之一，以40岁到50岁年龄组发病率最高，据世界流行病学调查，发现肿瘤在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，而人原代肿瘤细胞的分离获得率严重影响人类肿瘤疾病的研究进程和对肿瘤疾病的治疗水平，目前，人原代肿瘤细胞的分离获得率较低、增殖慢，如何在不损伤肿瘤细胞的前提下，从肿瘤组织中分离出大量的高纯化新鲜肿瘤细胞并使其大量增殖一直是一个难题，阻碍了人类对肿瘤疾病研究的进展速度和肿瘤药物的研制进程，例如，CN1526814A公开了人肿瘤细胞的分离纯化方法，该方法可用来分离纯化人卵巢癌细胞、人肾癌组织细胞和人肺癌细胞等多种人肿瘤细胞，但该方法只能分离纯化出人肿瘤细胞，无法使人肿瘤细胞增殖、获得大量的人原代肿瘤细胞。
发明内容
针对以上人原代肿瘤细胞的分离获得率较低、增殖慢等问题，本发明提供了一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，该方法制备的细胞获得率高，增殖快，为操作人员节省了大量时间。
本发明具体技术方案如下：
一种人原代肿瘤细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：
1)用0.9％的氯化钠注射液冲洗分离出的肿瘤组织，去除血渍，剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的肿瘤组织剪成1mm3大小，放置于离心管内，在该离心管中加入5-15ml 0.1％I型胶原酶，在4℃条件下过夜冷消化，次日加入1-5ml 0.1mg/ml的透明质酸酶和5-10ml 10μl/ml的DNA酶，置于34-40℃摇床中消化4-6h，将消化后的混合液过40μm细胞筛网，收集滤液，离心1-5min，去上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入无血清原代培养基，吹打混匀、细胞计数，接种于培养瓶中，每瓶补充无血清原代培养基后，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，得可冻存细胞；
4)将步骤3)所得的可冻存细胞进行冻存。
进一步改进，所述细胞培养具体方法为：隔1-5天对无血清原代培养基进行一次全量换液，继续培养2周后，将无血清原代培养基换成二代培养基继续培养，隔1-7天换一次液，消化收获悬浮细胞。
进一步改进，所述无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：10-20ng/ml的神经营养因子3(NT3)、1-5mg/l的丙酮酸钠和20-50ng/ml的普鲁兰，以上组分的浓度均为在DMEM培养基中的浓度。
进一步改进，所述二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10-50ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、17-42ng/ml的月桂酰肌氨酸、14-36ng/ml的生物素和200-500ng/ml的氯化钠，以上组分的浓度均为在RPMI 1640培养基中的浓度。
进一步改进，所述细胞冻存的具体方法为：收集细胞并加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，次日，再将冻存管冻于液氮中。
进一步改进，所述消化收获悬浮细胞的具体方法为：倒去二代培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤培养瓶，在洗涤后的培养瓶中加入胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和二代培养基，将上述悬液转移至离心管中，离心收集细胞沉淀，重悬细胞，离心，弃上清即得。
进一步改进，所述离心速度为1500rpm。
进一步改进，所述冻存液包含以下浓度组分：5-15ml的琼脂胶、5-50ml的白蛋白和12-20ml胆固醇棕榈酸酯。
本发明提供了一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，该方法制备的细胞获得率高，增殖快，为操作人员节省了大量时间。
实施例1
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)用0.9％的氯化钠注射液冲洗分离出的肿瘤组织，去除血渍，剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的肿瘤组织剪成1mm3大小，放置于离心管内，在该离心管中加入15ml 0.1％I型胶原酶，在4℃条件下过夜冷消化，次日加入5ml 0.1mg/ml的透明质酸酶和10ml 10μl/ml的DNA酶，置于40℃摇床中消化6h，将消化后的混合液过40μm细胞筛网，收集滤液，离心5min，去上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入无血清原代培养基，吹打混匀、细胞计数，接种于培养瓶中，每瓶补充无血清原代培养基后，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，得可冻存细胞；
4)将步骤3)所得的可冻存细胞用冻存液冻存。
其中，细胞培养具体方法为：隔3天对无血清原代培养基进行一次全量换液，继续培养2周后，将无血清原代培养基换成二代培养基继续培养，隔4天换一次液，消化收获悬浮细胞。
无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的NT3、1mg/l的丙酮酸钠和20ng/ml的普鲁兰。
二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的GDNF、17ng/ml的月桂酰肌氨酸、14ng/ml的生物素和200ng/ml的氯化钠。
冻存液包含以下浓度组分：10ml的琼脂胶、25ml的白蛋白和16ml胆固醇棕榈酸酯。
实施例2
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)用0.9％的氯化钠注射液冲洗分离出的肿瘤组织，去除血渍，剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的肿瘤组织剪成1mm3大小，放置于离心管内，在该离心管中加入5ml 0.1％I型胶原酶，在4℃条件下过夜冷消化，次日加入1ml 0.1mg/ml的透明质酸酶和5ml 10μl/ml的DNA酶，置于34℃摇床中消化4h，将消化后的混合液过40μm细胞筛网，收集滤液，离心1min，去上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入无血清原代培养基，吹打混匀、细胞计数，接种于培养瓶中，每瓶补充无血清原代培养基后，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，得可冻存细胞；
4)将步骤3)所得的可冻存细胞用冻存液冻存。
其中，细胞培养具体方法为：隔3天对无血清原代培养基进行一次全量换液，继续培养2周后，将无血清原代培养基换成二代培养基继续培养，隔4天换一次液，消化收获悬浮细胞。
无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的NT3、1mg/l的丙酮酸钠和20ng/ml的普鲁兰。
二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的GDNF、17ng/ml的月桂酰肌氨酸、14ng/ml的生物素和200ng/ml的氯化钠。
冻存液包含以下浓度组分：10ml的琼脂胶、25ml的白蛋白和16ml胆固醇棕榈酸酯。
实施例3
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)用0.9％的氯化钠注射液冲洗分离出的肿瘤组织，去除血渍，剪除坏死及结缔组织；
2)将步骤1)所得的肿瘤组织剪成1mm3大小，放置于离心管内，在该离心管中加入10ml 0.1％I型胶原酶，在4℃条件下过夜冷消化，次日加入3ml 0.1mg/ml的透明质酸酶和8ml 10μl/ml的DNA酶，置于36℃摇床中消化5h，将消化后的混合液过40μm细胞筛网，收集滤液，离心3min，去上清，得单细胞悬液；
3)向步骤2)所得的单细胞悬液中加入无血清原代培养基，吹打混匀、细胞计数，接种于培养瓶中，每瓶补充无血清原代培养基后，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于37±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，得可冻存细胞；
4)将步骤3)所得的可冻存细胞用冻存液冻存。
其中，细胞培养具体方法为：隔3天对无血清原代培养基进行一次全量换液，继续培养2周后，将无血清原代培养基换成二代培养基继续培养，隔4天换一次液，消化收获悬浮细胞。
无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的NT3、1mg/l的丙酮酸钠和20ng/ml的普鲁兰。
二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：10ng/ml的GDNF、17ng/ml的月桂酰肌氨酸、14ng/ml的生物素和200ng/ml的氯化钠。
冻存液包含以下浓度组分：10ml的琼脂胶、25ml的白蛋白和16ml胆固醇棕榈酸酯。
实施例4
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：15ng/ml的NT3、3mg/l的丙酮酸钠和35ng/ml的普鲁兰。
二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：30ng/ml的GDNF、30ng/ml的月桂酰肌氨酸、25ng/ml的生物素和350ng/ml的氯化钠。
实施例5
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，无血清原代培养基以DMEM培养基为基础，包含以下浓度组分：20ng/ml的NT3、5mg/l的丙酮酸钠和50ng/ml的普鲁兰。
二代培养基以RPMI 1640培养基为基础，包含以下浓度组分：50ng/ml的GDNF、42ng/ml的月桂酰肌氨酸、36ng/ml的生物素和500ng/ml的氯化钠。
实施例6
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下浓度组分：15ml的琼脂胶、50ml的白蛋白和20ml胆固醇棕榈酸酯。
实施例7
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下浓度组分：5ml的琼脂胶、5ml的白蛋白和12ml胆固醇棕榈酸酯。
对照例1-8
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，所述无血清原代培养基与二代培养基的配方见表1，表中没有提及到的组分与实施例1相同，并且表中各成分的单位与实施例1中的单位相同。
表1对照例1-8中无血清原代培养基和二代培养基中各组分含量
对照例9
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，细胞培养具体方法为：隔1天对无血清原代培养基进行一次全量换液，继续培养2周后，使用无血清原代培养基继续培养，隔1天换一次液，消化收获悬浮细胞。
对照例10
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下组分浓度：15ml的琼脂胶和50ml的白蛋白。
对照例11
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下组分浓度：10ml的琼脂胶、25ml的白蛋白和50ml胎牛血清。
对照例12
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下组分浓度：15ml的琼脂胶和25ml的白蛋白、20ml胆固醇棕榈酸酯和10ml二甲基亚砜。
对照例13
一种人原代肿瘤细胞分离制备方法，与实施例1的区别在于，其中，冻存液包含以下组分浓度：90ml胎牛血清和10ml二甲基亚砜。
试验1：人原代肿瘤细胞体外增殖情况
按照实施例1-3和对照例1-9的人原代肿瘤细胞分离制备方法对人原代肿瘤细胞进行体外扩增培养，检测细胞数量，计算细胞的扩增倍数，结果见表2。
表2人原代肿瘤细胞体外培养扩增细胞数量
由上述试验结果可知，对照例1-8是在本发明所提供的培养基配方的基础上，对配方中的原料组分进行常规增加、删除、替换进行探索，例如对照例1中增加试剂IL-2和HEPES；对照例2中增加试剂PHA和HEPES；对照例3中增加试剂新生牛血清和丙古二肽；对照例4中删除丙酮酸钠和IPDGF；对照例5中删除NT3和生物素；对照例6中删除了普鲁兰和氯化钠；对照例7将丙酮酸钠替换为IL-2、将GDNF替换为丙古二肽；对照例8将普鲁兰替换为新生牛血清、将生物素替换为磷酸钠。
实施例1-3的扩增倍数远高于对照例1-9，表明本发明提供的人原代肿瘤细胞分离制备方法制备的细胞获得率高，增殖快；相对于实施例1和实施例3，实施例2的扩增倍数更高，在不同的培养阶段，加入不同量的0.1％I型胶原酶、0.1mg/ml的透明质酸酶和10μl/mlDNA酶，对扩增细胞的数量是有影响的；相对于对照例9，实施例1-3的扩增倍数更高，选择合适的培养基，可以进一步提高人原代肿瘤细胞的扩增倍数，获得更多的细胞。
本发明所提供的人原代肿瘤细胞分离制备方法，在培养方法的细节上和培养基的方法上，不是对现有的技术进行简单的常规替换或增加而得来的，对其中的影响因素进行微小的替换，均会导致细胞的获得率和增殖速度大大降低，且影响因素众多，多个因素共同协同作用，互相配合形成本发明所提供的制备方法，任一单一因素的更替或改变均会对整个制备方法造成较大影响，本发明的人原代肿瘤细胞制备方法，通过简单的步骤，提高人原代肿瘤细胞的增殖能力和增殖速度，大大提高增殖数量，同时减少培养周期，具有显著的进步。
试验2：使用不同冻存液时对人原代肿瘤细胞冻存时间的考察
使用实施例1、实施例6、实施例7和对照例10-13的冻存液冻存人原代肿瘤细胞，检测不同时间点冻存细胞的存活数量，计算细胞的存活率，结果见表3。
表3不同冻存液作用下不同时间点的人原代肿瘤细胞存活率(％)
由上述试验结果可知，对照例10-13是在本发明所提供的冻存液配方的基础上进行常规的增加、删除或替换，实施例1、6、7的冻存液对人原代肿瘤细胞的冻存效果明显好于对照例10-13，证明本发明提供的冻存液配方对人原代肿瘤细胞的冻存效果较好。
结论
由上述试验可知，使用本发明所述的人原代肿瘤细胞分离制备方法及其专用培养基，可以有效的体外培养人原代肿瘤细胞，而本发明所提供的人原代肿瘤细胞专用培养基对人原代肿瘤细胞的扩增培养非常高效，且本发明所提供的冻存液对人原代肿瘤细胞的冻存效果较好。