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1、(10)申请公布号 CN 102586120 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586120 A *CN102586120A* (21)申请号 201210021045.8 (22)申请日 2012.01.31 CGMCC No.5610 2011.12.29 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院棉花研究所 地址 455000 河南省安阳市开发区黄河大道 38 号 (72)发明人 朱荷琴 冯自力 李志芳 师勇强 赵丽红 (。
2、74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人 高宇 (54) 发明名称 棉花内生真菌 CEF08111 及其在棉花黄萎病 防治中的应用 (57) 摘要 本发明涉及植物病理学， 具体地涉及棉 花 的 内 生 真 菌 CEF08111 及 其 在 棉 花 黄 萎 病 防治中的应用。本发明从棉花的内生真菌入 手， 通过分离、 筛选、 鉴定、 温室的生物测定， 获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株 CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)， 其保藏 编号为 ： CGMCC No.5610。CEF08111 能够在人工 培养基上培养， 容易获得和。
3、培养， 以利于工厂化 生产和推广应用。对黄萎病控制效果好， 先接种 CEF08111， 4 天后接种大丽轮枝菌， 对棉花黄萎病 的防治效果达到 97.2， 对黄萎病有显著的控制 作用， 与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比， 防 治效果提高 50左右， 对人畜、 昆虫和作物安全， 环境友好。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 棉花的内生真菌 CEF08111， 其特征在于，。
4、 其保藏编号为 ： CGMCC No.5610。 2. 权利要求 1 所述内生真菌 CEF08111 的应用。 3.一种培养权利要求1所述内生真菌CEF08111的方法， 其特征在于， 在PDA培养基、 查 彼液体培养基或棉籽培养基 28黑暗培养 15 天。 权 利 要 求 书 CN 102586120 A 2 1/5 页 3 棉花内生真菌 CEF08111 及其在棉花黄萎病防治中的应用 技术领域 0001 本发明涉及植物病理学， 具体地涉及棉花的内生真菌 CEF08111 及其在棉花黄萎 病防治中的应用。 背景技术 0002 由大丽轮枝菌引起的黄萎病是世界性的棉花重要病害之一， 由于缺乏真正。
5、有效的 抗病品种或者是抗病品种的抗病性极易丧失， 使得最经济有效的防治措施不能发挥其主导 作用。90 年代以来， 该病在我国各大棉区爆发成灾， 年发生面积为 300 万公顷左右， 产量损 失约 1 亿公斤皮棉， 成为发展棉花生产的主要限制因子之一。由于轮作倒茬难， 缺乏抗病品 种， 化学药剂防治效果差， 缺乏具有较好防治效果的农药， 致使目前生产上对黄萎病的防治 几乎是空白。 0003 利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、 环境友好的特点。目前利用 拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌， 作用机理是产生杆菌肽等多种抗 菌物质来抑制病原菌， 对黄萎病的防治具有一定的效果， 。
6、但是在生产应用中存在不少问题， 其中最主要的问题是防治效果较低， 国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效 果在50左右， 且在不同年份效果不稳定。 例如2008年和2009年， 由中国农业科学院棉花 研究所承担国家农药登记试验中 ( 任务来源于农业部农药鉴定所 )， 黑龙江强尔生化技术 开发区有限公司生产的 1000 亿活芽孢 / 克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的防治 效果为 46.0-52.9， 但在 2010 年大面积试验中防治效果只有 32.7。 0004 植物内生真菌资源是个巨大的宝库， 目前对内生真菌的研究还处于早期阶段， 所 研究的植物类群不过数百种， 仅涉及到很小的。
7、一部分。 近年来， 由于内生真菌在病虫害的生 物防治、 医药工业上的用途和范围逐渐增大， 因此有关内生真菌的研究逐渐受到重视。 0005 棉花黄萎病是一种土传维管束真菌病害， 从棉花的内生真菌入手， 分离筛选对黄 萎病菌具有抑制活性的菌株， 获得对该病控制效果好的生防菌株， 是值得探讨的棉花黄萎 病防治的新途径。 本发明的发明人经多年的研究， 从健康棉花的茎杆中获得一株内生真菌， 经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达 97.2， 对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜 能。 发明内容 0006 因此， 本发明的发明人为解决现有的利用拮抗微生物防治棉花黄萎病防治效果较 差的问题提出并完成本发明。 00。
8、07 本发明从棉花的内生真菌入手， 通过分离、 筛选、 鉴定、 温室的生物测定， 获得对棉 花黄萎病具有显著控制作用的菌株 CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)， 其保藏编号 为 ： CGMCC No.5610。 0008 该菌株是一株棉花的内生真菌， 由于其对棉花不致病、 无毒害作用。因此在分离 时， 首先要选择健康的棉株， 最重要的是， 在分离过程中， 一定要保证样品的表面消毒彻底， 说 明 书 CN 102586120 A 3 2/5 页 4 确保分离到的是棉花的内生真菌。 0009 该菌株经鉴定是一株变黑轮枝菌。从棉花中可以分离到丰富的内生真菌。由于微 。
9、生物的培养性状容易受培养条件的影响， 传统的以形态学为基础的分类鉴定有时候会受到 限制。 分子生物学的发展给微生物的分类鉴定提供了新的有效措施， 因此， 以传统的形态学 鉴定为基础， 结合分子生物学的手段， 对筛选到的菌株进行鉴定， 最后获得目的菌株。 0010 用于病害防治的菌株能否在植物根际定殖是生防菌株筛选的一个重要指标。棉 花黄萎病是一种维管束真菌病害， 病原菌从棉株的根尖侵染， 通过维管束向上运输、 扩展蔓 延， 危害棉花。 内生真菌是一类生活在植物体内， 对植物不致病、 无毒害作用、 与植物互惠共 生的真菌。 由于棉花黄萎病是一种土传维管束病害， 因此， 利用该生防菌株来控制棉花黄。
10、萎 病， 首先要选择合适的接种方法， 确保生防菌株能顺利在棉花植株内定殖， 以达到控制棉花 黄萎病的作用。 本发明获得的内生真菌来自棉株体内， 通过蘸根接种分生孢子悬浮液， 生防 菌株 CEF08111 易在棉花植株根际及植株内定殖， 且与黄萎病菌具有相同的微生态环境， 能 直接作用于棉花黄萎病菌。 0011 利用棉花的内生真菌 CEF08111 来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。 0012 1、 CEF08111 能够在人工培养基上培养， 容易获得和培养， 用于生物防治的菌株必 须能够在人工培养基上培养， 以利于工厂化生产和推广应用。CEF08111 是一株棉花的内生 真菌， 在土壤。
11、中广泛存在， 能侵染多种作物， 尤其是在南方高温高湿的夏季， 更容易从棉花 上分离获得。该菌株在 PDA、 查氏及棉籽培养基上生长良好， 有利于大量繁殖和推广应用。 0013 2、 CEF08111 对黄萎病控制效果好， 先接种 CEF08111， 4 天后接种大丽轮枝菌， 对棉 花黄萎病的防治效果达到 97.2， 对黄萎病有显著的控制作用， 与生产上应用较多的枯草 芽孢杆菌相比， 防治效果提高 50左右。 0014 3、 CEF08111 为环境友好型生防菌株， CEF08111 分离自棉花， 土壤中广泛存在， 对 多数的作物不致病， 对少数农作物具有极弱的致病性， 解决了具有生防潜力的微生。
12、物可能 转变为致病菌的问题， 因此对人畜、 昆虫和作物安全， 环境友好。 附图说明 0015 图 1 为 CEF08111 在 PDA 上的菌落形态、 厚壁孢子及分生孢子 ； 0016 图 2 为基于 CEF08111 的 ITS 核酸序列及来自 GeneBank 的轮枝孢属菌不同种的 ITS 序列构建的 N-J 系统发育树 ； 0017 图3CEF08111对棉花黄萎病的控制作用， 1-1， 冀棉11播种后18天接种CEF08111， 4 天后接种大丽轮枝菌强毒力菌株 CVd-AYb ； 1-2， 鲁棉研 21 播种后 18 天接种 CEF08111， 4 天后接种大丽轮枝菌强毒力菌株 CV。
13、d-AYb ； 2-1， 冀棉 11 播种后 22 天接种大丽轮枝菌强毒 力菌株 CVd-AYb ； 2-2， 鲁棉研 21 播种后 22 天接种大丽轮枝菌强毒力菌株 CVd-AYb ； 4-1， 冀 棉 11 播种后 22 天接种清水 ； 4-2， 鲁棉研 21 播种后 22 天接种清水。 0018 内生真菌CEF08111(Gibellulopsis nigrescens)， 于2011年12月29日保存于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国 科学院微生物研究所， 100101)， 其保藏编号是 ： CGMCC No.5610。 。
14、具体实施方式 说 明 书 CN 102586120 A 4 3/5 页 5 0019 实施例 1 菌株的分离 0020 ( 一 ) 样品采集 0021 于 7-8 月份， 在南方的湖北、 四川、 江苏等棉区， 最好在雨后， 选择健康棉株， 取主 茎的中上部及果枝 15cm。 0022 ( 二 ) 菌株的分离 0023 先将采集到的样品 ( 棉花茎杆 ) 用清水洗净， 去皮， 置于直径为 9cm 的灭菌的培养 皿中， 用 75的酒精消毒 1min。再用 5.0的次氯酸钠进行消毒 60s， 用灭菌水洗 3 次， 每 次时间不少于 3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分， 用消毒的剪刀剪成 0.。
15、4cm 长的 小段， 置于 9cm 的培养皿中， 25培养。用最后一遍清洗液为对照， 检查消毒是否彻底。每 天检查内生真菌的生长情况， 发现有菌落长出， 及时转移至直径为 6cm 的培养皿中培养， 然 后观察其菌落大小、 颜色、 表面特征、 质地。 0024 ( 三 )CEF08111 的特征 0025 1、 形态特征在PDA平板上， CEF08111的菌落起初为白色， 10天后， 随着厚壁孢子的 产生变为灰褐色， 边缘整齐， 表面致密， 气生菌丝不发达， 有同心轮文。显微镜下观察， 菌丝 宽约为 1.9m， 产生轮枝状分生孢子， 每轮 2-3 个分枝， 分生孢子为卵圆形， 大小为 ( 长 宽。
16、 )2.3-5.9m1.3-3.5m， 平均 4.012.13m( 长 宽 )。厚壁孢子褐色， 大小为 ( 长 宽 )4.4-7.0m3.4-5.8， 平均 5.9m4.9m( 图 1)。 0026 2、 生理特征 CEF08111 在 5-35条件下均能生长， 最适生长温度是 30。在 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35条件下的菌落直径分别为 0.0， 6.8， 9.7， 25.1， 46.9， 49.2 和 22.8mm。 30下， 菌落直径最大。 0027 3、 分子特征CEF08111的ITS序列见(SEQ ID No.1)， 将CEF08111的ITS序列与下 载轮枝。
17、孢属菌 rDNAITS 序列共同进行了比对， 利用 ClustalX 软件将序列匹配排列， 构建系 统发育树 ( 图 2)， 结果表明， CEF08111 菌株与变黑轮枝菌 DQ266224.1 和 EF543850.1 的同 源性为 100。 0028 依据 CEF08111 形态特征、 生理特征和分子鉴定结果， 将 CEF08111 归属为 Gibellulopsis nigrescens。 0029 SEQ ID No.1 0030 ccgagtacta taactcataa ccctttgtga acctttatac ctgttgcttc ggcggcgcgc 60 0031 ctcc。
18、cgggcg tgcccgccgg cattatcaga atctctgttc gaacccgacg atacatctga 120 0032 gtgttctaag cgaactgtta aaactttcaa caacggatct cttggctcca gcatcgatga 180 0033 agaacgcagc gaaacgcgat atgtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 240 0034 ttgaacgcac atggcgcctt ccagtatcct gggaggcatg cctgtccgag cgtcgtttca 300 0035 accc。
19、tcgagc ccccgtggcc cggcgttggg gatctgccca ggcagtcccc gaaaaccagt 360 0036 ggcggacccg ttgggccctt cctttgcgta gtaacatctg cctcgcatcg ggagctgcgg 420 0037 gctatccggc ctctaaaccc ccctcaagcc gctccggcgg caccagg 467 0038 ( 四 ) 培养基及培养条件 0039 1.PDA培养基 马铃薯200克， 葡萄糖20克， 琼脂15-20克， 水1升， 自然pH。 称取削 皮的 200g 马铃薯， 切成小块置于锅中加。
20、水煮烂 ( 煮沸 20-30 分钟 )， 用纱布过滤后， 滤液中 加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀， 稍冷却后再补水至 1L， 分装到锥形瓶， 加塞包扎后 120 说 明 书 CN 102586120 A 5 4/5 页 6 灭菌 20 分钟。 0040 2. 查彼 (Czapek) 液体培养基 KNO3， 2.00g ； K2HPO4， 1.00g ； KCI， 0.50g ； MgSO4.7H2O， 0.50g ； FeSO4.7H2O， 0.01g ； 蔗糖， 30.00g ； 加水至 1L， 分装到锥形瓶， 加塞包扎后 120灭菌 20 分钟。 0041 3.棉籽培养基将带短绒的棉籽煮5分。
21、钟， 浸泡6小时使棉籽吸足水分， 捞出淋干水 分， 放入克氏瓶中， 120灭菌 30 分钟。 0042 28， 黑暗培养 15d。液体培养需要置摇床 150rpm， 震荡培养。 0043 实施例 2 CEF08111 对棉花黄萎病的控制作用 0044 1.、 试验方法以耐病品种鲁棉研 28 和感病品种冀棉 11 为供试品种， 采用蛭石沙 土定量蘸菌液法。将灭菌后的蛭石和沙子按 6 4 混合， 做直径 6cm 的无底纸钵， 放置 45cm35cm 的塑料盘内， 每钵播种棉花种子 8 粒， 出苗后留苗 5 株， 每品种 15 个钵， 每 5 个 钵为一个重复， 3 次重复。棉花播种后， 将塑料盘置。
22、温室中， 待棉苗长一片真叶， 根据试验设 置接种孢子悬浮液 10ml， 孢子浓度为 1107个孢子 /ml。接种方法为， 将 10ml 孢子悬浮液 倒入直径 10cm 的培养皿中， 将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中 40s， 待孢子悬浮液被 吸干后， 将纸钵放回塑料盘中。棉苗置 18 -28的温室中， 按 5 级分级标准进行病害的分 级调查。计算病株率、 病情指数和防治效果。 0045 2、 试验结果先接种 CEF08111， 4 天后再接种强致病力的大丽轮枝菌菌株 CVd-AYb， 在冀棉11和鲁棉研28上平清指数分别为1.0和2.1， 极显著低于直接接种大丽轮枝菌强致 病力菌株 CVD0。
23、5(74.0 和 49.3)， 平均防治效果达 97.2。只接种 CEF08111 处理的棉苗， 没 有表现任何病状， 且由于显著减轻黄萎病的危害， 使棉苗的株高也较直接接种 CVd-AYb 处 理的棉苗显著高。表明 CEF08111 对棉花黄萎病有很好的防治效果 ( 图 3， 表 1a、 及 1b， 经 4 个不同处理的冀棉 11 及鲁棉研 21)。 0046 表 1a CEF08111 对棉花黄萎病的控制作用 0047 0048 表 1b CEF08111 对棉花黄萎病的控制作用 0049 说 明 书 CN 102586120 A 6 5/5 页 7 0050 0051 a ： 4 个不同。
24、的处理。1， 播种后 18 天接种 CEF08111， 4 天后接种大丽轮枝菌强毒 力菌株 CVd-AYb ； 2， 播种后 22 天接种大丽轮枝菌强毒力菌株 CVd-AYb ； 3， 播种后 22 天接种 CEF08111 ； 4， 播种后 22 天接种清水。 0052 b， c ： 棉花品种。 0053 d ： 病情指数和株高后面的不同字母， 表示不同处理之间差异达极显著水平 (LSD， P 0.01)。 说 明 书 CN 102586120 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 102586120 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102586120 A 9 。