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1、(10)申请公布号 CN 102586149 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586149 A *CN102586149A* (21)申请号 201210051551.1 (22)申请日 2012.03.01 CGMCC No.5693 2012.01.04 C12N 1/20(2006.01) A62D 3/02(2007.01) C12R 1/01(2006.01) A62D 101/22(2007.01) (71)申请人 黑龙江省科学院微生物研究所 地址 150010 黑龙江省哈尔滨市道里区兆麟 街 68 号 (72)发明人 曹亚彬 牛彦波 吴皓琼 甄涛 郭立姝。
2、 殷博 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 韩末洙 (54) 发明名称 一株降解二氯甲烷的甲基细菌 (57) 摘要 一株降解二氯甲烷的甲基细菌， 它涉及一株 降解二氯甲烷的甲基细菌， 本发明提供一株甲基 细菌菌株， 可高效降解二氯甲烷， 可在有氧条件下 降解二氯甲烷， 为以二氯甲烷为代表的卤代烃类 有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要基 础。本发明降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌 Met26， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏日期为2012年1月4日， 保藏 号为 CGMCC No.5693。本发明甲基细菌 Met26 能 够。
3、高效降解二氯甲烷， 甲基细菌 Met26 在以二氯 甲烷为唯一碳源、 二氯甲烷终浓度为 30mmol/L 的 培养基中， 培养10d后二氯甲烷浓度下降63.5， 15d 后二氯甲烷浓度下降 78.6。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一株降解二氯甲烷的甲基细菌， 其特征在于降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp.)Met26， 保藏在中国微。
4、生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2012 年 1 月 4 日， 保藏号为 CGMCC No.5693。 权 利 要 求 书 CN 102586149 A 2 1/3 页 3 一株降解二氯甲烷的甲基细菌 技术领域 0001 本发明涉及一株降解二氯甲烷的甲基细菌。 背景技术 0002 二氯甲烷， CH2Cl2， 为无色液体， 在制药工业中做反应介质， 用于制备氨苄青霉素、 羟苄青霉素和先锋霉素等 ； 还用作胶片生产中的溶剂、 脱脂剂， 气烟雾喷射剂、 聚氨酯发泡 剂等。二氯甲烷在中国用于胶片生产的消费量占总消费量的 50， 。
5、医药方面占总消费量的 20， 清洗剂及化工行业消费量占总消费量的 20， 其他方面占 10。 0003 二氯甲烷有麻醉作用， 主要损害中枢神经和呼吸系统。人类接触的主要途径是吸 入。据估计， 在二氯甲烷的世界产量中， 大约 80被释放到大气中去， 但是由于该化合物光 解的速率很快， 使之不可能在大气中蓄积。 其初始降解产物为光气和一氧化碳， 因此二氯甲 烷被认为是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质， 其广泛使用带来一系列环境污染问题， 严重危机人类健康， 并且破坏臭氧层。 0004 自从 1980 年 Rittman 等首次从工业废水中分离出能以二氯甲烷作为唯一碳源和 能源的甲基杆菌 (Meth。
6、ylobacterium sp.) 迄今为止包括假单胞菌、 丝微菌在内 10 多株分 解二氯甲烷的细菌中， 有关甲基细菌 (Methylobacter sp.) 以二氯甲烷作为碳源与能源的 生物降解国内未见报道。 发明内容 0005 本发明提供一株甲基细菌(Methylobacter sp.)菌株， 可高效降解二氯甲烷， 可在 有氧条件下降解二氯甲烷， 为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的 研究提供了重要基础。 0006 本发明降解二氯甲烷的甲基细菌为甲基细菌 (Methylobacter sp.)Met26， 保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC。
7、)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2012 年 1 月 4 日， 保藏号为 CGMCC No.5693 ； 本发明甲基细菌 Met26 为革兰氏阴性菌， 短杆状， 细胞大小为 (0.33m 0.4m)(0.39m 0.46m)， 无芽孢、 无鞭毛 ； 在 MNMS 培养基上 28培养 10d， 菌落直径 0.5-1mm， 圆形， 透明， 边缘整齐， 表面光滑。 0007 本发明甲基细菌 Met26 可在 MNMS 培养基上生长， 最适生长温度为 28， 最适生长 环境 pH 为 6.8。 0008 本发明的甲基细菌 (Methylobacter sp.)M。
8、et26 通过 16S rDNA 序列比对分析， 与 甲基细菌属 (Methylobacter sp.) 的亲缘关系最为接近， 保守区相似性为 99。通过结合 菌体形态特征、 生长条件确定甲基细菌 Met26 为甲基细菌属 (Methylobacter sp.) 的一株 新菌株， 命名为甲基细菌 Met26。 0009 本发明甲基细菌 Met26 能够高效降解二氯甲烷， 甲基细菌 Met26 在以二氯甲烷为 唯一碳源、 二氯甲烷终浓度为30mmol/L的培养基中， 培养10d后二氯甲烷浓度下降63.5， 说 明 书 CN 102586149 A 3 2/3 页 4 15d 后二氯甲烷浓度下降 。
9、78.6。 0010 本发明的甲基细菌(Methylobacter sp.)Met26， 属于甲基细菌属(Methylobacter sp.)， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2012 年 1 月 4 日， 保藏号为 CGMCC No.5693。 附图说明 0011 图 1 为甲基细菌 Met26 和相近菌株的 16S rDNA 序列进行同源性比对构建的系统 发育树图。 具体实施方式 0012 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0013 具。
10、 体 实 施 方 式 一 ： 本 实 施 方 式 降 解 二 氯 甲 烷 的 甲 基 细 菌 为 甲 基 细 菌 (Methylobacter sp.)Met26， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2012 年 1 月 4 日， 保 藏号为 CGMCC No.5693。 0014 本实施方式甲基细菌 Met26 为革兰氏阴性菌， 短杆状， 细胞大小为 (0.33m 0.4m)(0.39m 0.46m)， 无芽孢、 无鞭毛 ； 在 MNMS 培养基上 28培养 10d， 菌落直 径 0.5-1mm。
11、， 圆形， 透明， 边缘整齐， 表面光滑。 0015 本实施方式甲基细菌 Met26 可在 MNMS 培养基上生长， 最适生长温度为 28， 最适 生长环境 pH 为 6.8。 0016 具体实施方式二 ： 本实施方式甲基细菌 (Methylobacter sp.)Met26 由 2010 年 8 月份采集于双鸭山宝山区新阳煤矿的 600m 煤层夹心岩中筛选得到。筛选按以下步骤进行 ： 称取已晾干、 粉碎好的夹心岩样品 10.0g， 装入加有玻璃珠无菌水的三角瓶中， 浸泡 30min 后， 在 180r/min 的振荡器上振荡 30mim， 然后静止， 取悬浊液在 10000r/min 离心 。
12、10-15min， 静止备用。用 2.5ml 医用注射器取 1ml 上清液加入到 100ml MNMS 液体培养基中， 再通入 100ml 甲烷气体， 每隔 2-3 天加一次甲烷气体， 每次 50-100ml。摇床培养 120r/min 28培 养 9-15 天， 以发酵液浑浊， 为第一次富集培养完成。再从第一次富集培养液中取 1ml 进行 第二次富集培养， 方法同上。连续富集培养不少于 3 次。得到单一纯菌后保藏， 对初筛菌株 进行二氯甲烷利用能力测定， 在 MNMS 固体培养基上以二氯甲烷为唯一碳源和能源， 提供纯 净空气方法进行选择性培养， 挑选单菌落， 转接 MNMS 培养基， 上摇床。
13、通过检测降解效率进 行复筛， 得到对二氯甲烷具有高效降解能力菌株甲基细菌 Met26。 0017 MNMS 培养基由 1.0g/L 的磷酸二氢钾、 2.9g/L 的十二水磷酸氢二钠、 0.32g/L 的七 水硫酸镁、 3.0g/L 的硫酸二铵、 10mL 微量元素溶液和 990mL 蒸馏水组成， pH 值为 6.8。其中 微量元素溶液组成 (mg/L) 如下 ： 0.287mg/L 七水硫酸锌、 0.223mg/L 七水硫酸锰、 0.062mg/ L 硼酸， 0.048mg/L 二水钼酸钠、 0.048mg/L 六水三氯化钴、 0.083mg/L 碘化钾、 3.5mg/L 二水 氯化钙和蒸馏水。
14、组成。 0018 MNMS 固体培养基由 1.0g/L 的磷酸二氢钾、 2.9g/L 的十二水磷酸氢二钠、 0.32g/ L 的七水硫酸镁、 3.0g/L 的硫酸二铵、 10mL 微量元素溶液和 990mL 蒸馏水组成， pH 值为 说 明 书 CN 102586149 A 4 3/3 页 5 6.8。其中微量元素溶液组成 (mg/L) 如下 ： 0.287mg/L 七水硫酸锌、 0.223mg/L 七水硫酸 锰、 0.062mg/L 硼酸， 0.048mg/L 二水钼酸钠、 0.048mg/L 六水三氯化钴、 0.083mg/L 碘化钾、 3.5mg/L 二水氯化钙、 琼脂和蒸馏水组成， 其。
15、中琼脂的质量浓度为 2。 0019 对筛选得到的甲基细菌 Met26 进行分子鉴定， 按以下步骤进行 ： 提取菌株的总 DNA， 采用细菌的 16S rDNA 通用引物， 以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增。然后利用胶回收 试剂盒 ( 购自于大连宝生物工程有限公司 ) 回收纯化 PCR 产物， 之后进行克隆、 转化， 筛选 阳性克隆子菌落， 经扩大培养后委托上海生工生物技术有限公司测序。 0020 甲基细菌 (Methylobacter sp.)Met26 的 16SrDNA 序列长度为 1498bp， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 测序结果与 GenBank 中的 1。
16、6S rDNA 序列进行同源性比对， 然后用软件 构建系统发育树 ( 如图 1 所示 )， 以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明， 该序列 与甲基细菌属 (Methylobacter sp.) 的亲缘关系最为接近， 保守区相似性为 99。命名 为甲基细菌 Met26。通过结合菌体形态特征、 生长条件确定甲基细菌 Met26 为甲基细菌属 (Methylobacter sp.) 的一株新菌株， 命名为甲基细菌 Met26。 0021 对本实施方式甲基细菌 Met26 降解二氯甲烷的降解率进行测定， 具体方法如下 ： 0022 取 106cfu/ml 的菌悬液 1ml， 加入 100mlMNM。
17、S 培养基中摇床培养， 以二氯甲烷为唯 一碳源的培养基， 即在 MNMS 培养基中添加二氯甲烷， 二氯甲烷终浓度为 30mmol/L， 分 4 次 加入。120r/min， 28培养。检测生物量、 pH、 二氯甲烷浓度变化， 每 12h 检测一次。结果 ： 10d 后二氯甲烷浓度下降 63.5， 15d 后二氯甲烷浓度下降 78.6。 说 明 书 CN 102586149 A 5 1/2 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 102586149 A 6 2/2 页 7 序 列 表 CN 102586149 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102586149 A 8 。