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1、(10)申请公布号 CN 102659859 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102659859 A *CN102659859A* (21)申请号 201210103572.3 (22)申请日 2012.04.11 C07H 15/04(2006.01) C07H 1/06(2006.01) (71)申请人 苏州纳微生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区星 湖街 218 号生物纳米园 c1 组团 A 栋 (72)发明人 江必旺 陈荣姬 吴俊成 林生跃 肖书霞 (74)专利代理机构 苏州华博知识产权代理有限 公司 32232 代理人 傅靖 (54) 发。
2、明名称 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在 磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用 (57) 摘要 本发明公开了单分散聚甲基丙烯酸酯离子交 换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用， 采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质为 填料的色谱柱进行柱层析。本发明不但利于以水 溶液做流动相分离纯化磺达肝癸钠粗品， 达到高 纯度和高回收率， 而且柱层析不会随着盐浓度和 流速的变化而发生变化， 层析填料可耐高压和高 流速， 同时可使用低盐浓度将吸附在层析柱上的 磺达肝癸钠洗脱下来。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。
3、申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用， 其特 征在于， 采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质为填料的色谱柱进行柱层析。 2. 如权利要求 1 所述的单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层 析纯化中的应用， 其特征在于， 用所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质作为色谱 柱的固定相， 将含磺达肝癸钠的样品上样于该色谱柱上， 用盐的水溶液作为流动相洗脱吸 附在固定相上的磺达肝癸钠。 3. 如权利要求 2 所述的单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱层 析纯化中。
4、的应用， 其特征在于， 所述盐的水溶液是 NaCl 的水溶液。 权 利 要 求 书 CN 102659859 A 2 1/4 页 3 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质在磺达肝癸钠柱 层析纯化中的应用 技术领域 0001 本发明涉及药物纯化领域， 具体涉及磺达肝癸钠的柱层析纯化领域。 背景技术 0002 磺达肝癸钠 （Fondaparinux sodium） 是戊聚糖钠最小重复片段的五糖物质， 它是 一种活化凝血因子 a 的特异性抑制剂， 主要用于血栓栓塞疾病防治， 它的应用在很大程 度上解决了抗凝药物一直以来困扰医师的两难问题在抗凝强度和出血风险中找到一 个平衡支点。 0003 磺达肝癸钠。
5、由人工合成， 一般合成方法都需要经历 50 个以上步骤， 因此最后的粗 品中杂质含量复杂， 且磺达肝癸钠有效含量较低 （一般为 60-80%） ， 经过一步提取到高纯度 （98% 以上） 较困难。 0004 离子交换层析介质是生物分子分离纯化中最常用的方法之一， 广泛应用于抗生 素、 核酸、 多肽、 蛋白质、 以及天然产物的分离纯化。其主要由三部分组成， 第一部分是骨架 结构， 即载体 ； 第二部分是固定在母体结构上的带电功能基团 ； 第三部分是与功能基团带 相反电荷的离子对。与传统的离子交换树脂相比， 用于生物大分子分离的离子交换层析介 质除了具备高的离子密度、 具有一定的耐压、 耐酸碱性能。
6、外， 还要求母体结构足够亲水以消 除其与生物分子的非特异性吸附， 并且要具备均匀的粒径。目前用于生物大分子分离的介 质大多数不具备所有的以上特点， 在实际应用中具有缺陷。 0005 J.Hradil 等 （Reactive Polymers, 1990,13,43-53） 分别使用甲基丙烯酸环氧丙 酯 / 乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物 (GMA/EDMA) 和甲基丙烯酸羟乙酯 / 乙二醇二甲基丙烯 酸酯共聚物 (HEMA/EDMA) 为基质， 合成粒径分别为 250-400m 和 100-200m 强阴离子交 换树脂， 相比聚苯乙烯 / 二乙烯基苯基质， 该方法后续修饰使用的试剂对环境的危害较小。
7、 ； 但是， 其合成的树脂颗粒较大， 不均匀， 很难做到高分辨率分离， 而且， 该基质虽然较为亲 水， 但应用在生物分子分离上， 其亲水性还无法满足要求， 限制了其在生物分离上的应用。 0006 Hongdeng Qiu 等 （Journal of Chromatography A, 2006, 1103,265270） 使用 硅胶为基质键合上了含强阴基团的硅烷偶联剂， 合成的强阴型离子交换层析介质用于小分 子的分离纯化。 该介质具备很好的机械强度， 对混合物的分离效果较好， 但是硅胶基质的离 子交换层析介质不耐碱性， 在很大程度上限制了它的应用范围。 0007 美国专利20050020536。
8、公开了一种以琼脂糖为基质的Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare) 分离纯化磺达肝癸钠的方法， 该方法以氯化钠水溶液为流动相， 得到 99% 的纯 度。 但是该方法使用的介质为琼脂糖骨架， 其在不同流速下柱体积会发生变化， 而且相对聚 丙烯酸酯基质， 其在较高压力条件下会发生变形， 这限制了其在高流速分离中的应用。 发明内容 0008 本发明的目的是针对上述问题， 提供一种能达到高纯度和高回收率， 而且柱层析 说 明 书 CN 102659859 A 3 2/4 页 4 不会随着盐浓度和流速的变化而发生变化， 层析填料可耐高压和高流速的层析介质。 0009 为实。
9、现上述目的， 本发明提供的技术方案是， 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层 析介质在磺达肝癸钠柱层析纯化中的应用， 采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质 为填料的色谱柱进行柱层析。 0010 优选的， 用所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质作为色谱柱的固定相， 将含磺达肝癸钠的样品上样于该色谱柱上， 用盐的水溶液作为流动相洗脱吸附在固定相上 的磺达肝癸钠。 0011 优选的， 所述盐的水溶液是 NaCl 的水溶液。 0012 优选的， 所述单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质是由苏州纳微生物科技有 限公司生产， 产品型号为 Uni Q-50S。 0013 将单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析。
10、介质Uni Q-50S作为填料转入色谱柱成为 固定相， 把含有待分离或分析含磺达肝癸钠的溶液流过该色谱柱， 然后用盐的水溶液作为 流动相流过色谱柱， 洗脱吸附在固定相Uni Q-50S上的待分离或分析的含磺达肝癸钠溶液。 0014 本发明的有益效果是 ： 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质 Uni Q-50S 不但 利于以水溶液做流动相分离纯化磺达肝癸钠粗品， 达到高纯度和高回收率， 而且柱层析不 会随着盐浓度和流速的变化而发生变化， 层析填料可耐高压和高流速， 同时可使用低盐浓 度将吸附在层析柱上的磺达肝癸钠洗脱下来。 附图说明 0015 图1是实施例1中使用的苏州纳微生物科技有限公司单分。
11、散聚甲基丙烯酸酯离子 交换层析介质 Uni Q-50S 扫描电镜照片。 0016 图2是实施例3、 实施例4中使用的填料Uni Q-50S(苏州纳微生物科技有限公司) 和 Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare) 的压力 - 压力曲线。 0017 图 3 是实施例 1 中提纯前的磺达肝癸钠粗品的 HPLC 分析图谱。 0018 图 4 是实施例 1 中提纯后的磺达肝癸钠的 HPLC 分析图谱。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明的内容之后。
12、， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范 围。 0020 实施例 1, 磺达肝癸钠的纯化 ： 采用 26310mm 玻璃色谱柱， Uni Q-50S( 苏州纳微生物科技有限公司生产 ) 为层析填 料装填层析柱， 装柱体积 164.5mL， 先用 1.5 个柱体积 （CV） 的 2M NaCl 活化色谱柱， 然后用 2.0CV 超纯水以 10mL/min 的流速平衡色谱柱。磺达肝癸钠粗品 （纯度 70%） 用超纯水溶解， 粗品浓度 4mg/mL， 上样体积 250mL。上样后， 先用超纯水冲洗 2.0BV， 然后用 0.3M NaCl。
13、 洗 脱 3.5BV 以除去杂质， 再用 0.44M NaCl 洗脱并分管收集洗脱液， 最后 1.0M NaCl 洗脱到无 紫外吸收。收集液经检测， 得到色谱纯度 99% 以上的回收率约 30%， 色谱纯度在 97% 以上的 说 明 书 CN 102659859 A 4 3/4 页 5 回收率约 60%。 0021 实施例 2， 磺达肝癸钠的纯化 ： 采用 26310mm 玻璃色谱柱， Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare， 粒径范围 45-165 微米 ) 为层析填料装填层析柱， 装柱体积 164.5mL， 先用 1.5 个柱体积 （CV）的 2M NaCl。
14、活化色谱柱， 然后用2.0CV超纯水以10mL/min的流速平衡色谱柱。 磺达肝癸钠粗品 （纯 度 70%） 用超纯水溶解， 粗品浓度 4mg/mL， 上样体积 250mL。上样后， 先用超纯水冲洗 2.0BV， 然后用0.36M NaCl洗脱5BV以除去杂质， 再用0.6M NaCl洗脱并分管收集洗脱液， 最后1.0M NaCl 洗脱到无紫外吸收。收集液经检测， 得到色谱纯度 99% 以上的回收率约 28%， 色谱纯度 在 97% 以上的回收率约 55%。 0022 实施例 3， 填料耐压性能测试 ： 采用10220mm玻璃色谱柱， Uni Q-50S (苏州纳微生物科技有限公司) 为层析填。
15、料， 装柱完毕后用3CV超纯水以1mL/min流速平衡色谱柱并测定色谱柱反压， 以此流速开始， 逐 渐增加流速， 每升高 1mL/min 流速测定色谱柱反压， 做成流速 - 压力曲线图， 如图 3 所示。 0023 实施例 4, 填料耐压性能测试 ： 采用 10220mm 玻璃色谱柱， Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare， 粒径范围 45-165 微米 ) 为层析填料， 装柱完毕后用 3CV 超纯水以 1mL/min 流速平衡色谱柱并测定 色谱柱反压， 以此流速开始， 逐渐增加流速， 每升高 1mL/min 流速测定色谱柱反压， 做成流 速 - 压力曲线图，。
16、 如图 3 所示。 0024 将实施例一、 三和实施例二、 四性能进行对比， 对比结果见表 1。 0025 表 1 介质 Uni Q-50S 和介质 Q Sepharose Fast Flow 结果比较表 注 ： 其中 “” 表示是，“” 表示否。 0026 从图1可见， 单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质Uni Q-50S粒径非常均一。 0027 从图 2 可见， 随着流速的加快 , 含 Uni Q-50S 的柱内压力平稳缓慢增加 , 而含 Q Sepharose Fast Flow 的柱内压力则突然急剧升高， 容易造成操作困难或必须停止。 0028 图 3 是提纯前的磺达肝癸钠， 可见杂。
17、峰多且高， 说明杂质多且浓度高， 图 4 是提纯 后的磺达肝癸钠， 杂峰非常少且低， 说明杂质已经非常少且浓度低， 磺达肝癸钠纯化效果很 好。 0029 本发明采用单分散聚甲基丙烯酸酯离子交换层析介质Uni Q-50S不但利于以水溶 液做流动相分离纯化磺达肝癸钠粗品， 达到高纯度和高回收率， 而且柱层析不会随着盐浓 说 明 书 CN 102659859 A 5 4/4 页 6 度和流速的变化而发生变化， 层析填料可耐高压和高流速， 同时可使用低盐浓度将吸附在 层析柱上的磺达肝癸钠洗脱下来。 0030 以上为对本发明实施例的描述， 通过对所公开的实施例的上述说明， 使本领域专 业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员 来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况 下， 在其它实施例中实现。因此， 本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符 合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。 说 明 书 CN 102659859 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102659859 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102659859 A 8 。