一种使植物器官变小的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102586265 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586265 A *CN102586265A* (21)申请号 201110001705.1 (22)申请日 2011.01.06 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C07K 14/415(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 李云海 徐冉 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 1124。

2、5 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种使植物器官变小的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种使植物器官变小的方法。 该方法是向出发植物中导入 SEQ IDNO ： 1 所示蛋 白的编码基因， 得到目的转基因植物， 所述目的转 基因植物的器官小于所述出发植物的器官。本发 明方法为改变作物产量、 优化改良作物农艺性状 及植物的遗传育种奠定了坚实基础， 提供了有利 工具， 具有重要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 11 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 11 页 附图。

3、 1 页 1/1 页 2 1. 一种使植物器官变小的方法， 包括如下步骤 ： 向出发植物中导入 SEQ ID NO ： 1 所示 蛋白的编码基因， 得到目的转基因植物， 所述目的转基因植物的器官小于所述出发植物的 器官。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述编码基因是通过重组表达载体导入 的。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述重组表达载体是向质粒 pGreen-35S 的多克隆位点间插入所述编码基因得到的。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述多克隆位点为 EcoRI 酶切 位点。 5. 根据权利要求 1-。

4、4 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白的 编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 6. 根据权利要求 1-5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述出发植物为双子叶植物。 7. 根据权利要求 1-6 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述双子叶植物为拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。 8. 根据权利要求 1-7 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述器官变小为花变小和 / 或 叶片变小。 9. 根据权利要求 1-8 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述花器官变小为花瓣面积变 小、 花瓣细胞面积变小和 。

5、/ 或花瓣细胞的数目减少， 所述叶片变小为叶片面积变小、 叶片细 胞面积变小和 / 或叶片细胞数目减少。 10.SEQ ID NO ： 1 所示蛋白和 / 或 SEQ ID NO ： 2 所示编码基因在使植物器官变小中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 102586265 A 2 1/5 页 3 一种使植物器官变小的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种使植物器官变小的方法。 背景技术 0002 随着人口的不断增加， 耕地的逐渐减少， 如何提高作物产量已经成为一个世界性 的、 汲待解决的重大问题。植物器官大小直接关系到植物的产量。器官大小不仅受环境因 素影响， 而且受内源基因的调控。 所以。

6、， 研究植物体如何实现自身对器官大小的控制已经成 为提高作物产量的重要策略之一。 0003 转录中介体是存在与所有真核生物中的一个多亚基蛋白复合体， 是介于转录因子 和基础转录机器之间的桥梁。几乎所有基因的表达都需要转录中介体的调节。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供一种使植物器官变小的方法。 0005 本发明所提供的使植物器官变小的方法， 包括如下步骤 ： 向出发植物中导入 SEQ IDNO ： 1 所示蛋白的编码基因， 得到目的转基因植物， 所述目的转基因植物的器官小于所述 出发植物的器官。 0006 上述方法中， 所述基因是通过重组表达载体导入的。 0007 上述方法中， 所述。

7、重组表达载体是向质粒 pGreen-35S 的多克隆位点间插入所述 编码基因得到的。 0008 上述方法中， 所述多克隆位点为 EcoRI 酶切位点。 0009 上述方法中， 所述 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0010 上述方法中， 所述出发植物为双子叶植物。 0011 上述方法中， 所述双子叶植物为拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。 0012 上述方法中， 所述器官变小为花变小和 / 或叶片变小。 0013 上述方法中， 所述花器官变小为花瓣面积变小、 花瓣细胞面积变小和 / 或花瓣细 胞的数目减少， 。

8、所述叶片变小为叶片面积变小、 叶片细胞面积变小和 / 或叶片细胞数目减 少。 0014 SEQ ID NO ： 1 所示蛋白在使植物器官变小中的应用也属于本发明的保护范围。 0015 SEQ ID NO ： 2 所示编码基因在使植物器官变小中的应用也属于本发明的保护范 围。 0016 上述应用中， 所述出发植物为双子叶植物。 0017 上述应用中， 所述双子叶植物为拟南芥 (Arabidopsis thaliana)。 0018 上述应用中， 所述器官变小为花变小和 / 或叶片变小。 0019 上述应用中， 所述花器官变小为花瓣面积变小、 花瓣细胞面积变小和 / 或花瓣细 胞的数目减少， 所述。

9、叶片变小为叶片面积变小、 叶片细胞面积变小和 / 或叶片细胞数目减 说 明 书 CN 102586265 A 3 2/5 页 4 少。 0020 本发明方法可以实现对作物器官的定向控制。通过本发明方法， 可以根据实际需 要来控制植物器官大小， 为改变作物产量、 优化改良作物农艺性状及植物的遗传育种奠定 了坚实基础， 提供了有利工具， 具有重要意义。 附图说明 0021 图 1 为转基因植株的表型。 0022 图 2 为转基因植株的 PCR 鉴定。 具体实施方式 0023 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0024 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均。

10、可从商业途径得到。 0025 实施例 1、 使植物器官变小的方法 0026 一、 RNA 提取及反转录 0027 新鲜的野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana)(Col-0) 幼苗 ( 萌发后 14 天 ) 在 液氮中研碎。取 100mg 研碎的材料， 用植物总 RNA 提取试剂盒 (TIANGEN) 提取总 RNA。提取 完成后， 用分光光度计检测总 RNA 的浓度。取 5g 总 RNA， 用反转录试剂盒 (INVITROGEN) 进行反转录， 得到 cDNA。 0028 二、 EOD8 编码基因的获得 0029 以 cDNA 为模板， 用如下引物进行 PCR 扩增。PCR。

11、 反应使用高保真 DNA 聚合酶试剂 盒 (TOYOBO)， PCR 延伸时间为 2.5 分钟， 32 个循环。反应完成后用 rTaq(TAKALA) 加 A。 0030 EOD8-F ： ATGTCGTCGGAGGTGAAACAG 0031 EOD8-R ： TTTATCCCATGAAGCCAGCTC 0032 PCR 扩增后， DNA 琼脂糖凝胶电泳， 得到约 2.5kb 的 DNA 条带。用凝胶回收试剂盒 (TIANGEN) 回收该片段。 0033 回收的片段连入 T 载体 pGEM-T(PROMEGA) 中， 得到质粒 pGEM-EOD8。然后测序 ( 北 京擎科生物技术公司 )。测序。

12、结果标明， 该片段大小为 2511bp， 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示， 是 EOD8 的编码序列 (CDS)。该基因编码的蛋白如 SEQ ID NO ： 1 所示 . 0034 三、 植物表达载体构建 0035 质粒 pGreen-35S 和农杆菌 GV3101 均在文献 “Li， Y.， Zheng， L.， Corke， F.， Smith， C.， and Bevan， M.W.(2008).Control of f final seed and organ size by theDA1 gene family in Arabidopsis thaliana.Gene。

13、s Dev 22， 1331-1336” 中公开过， 公众可从中国科 学院遗传与发育生物学研究所获得。 0036 EcoRI 酶切质粒 pGEM-EOD8， 回收 2511bp 的 EOD8 编码序列片段， 插入到 EcoRI 酶 切并去磷酸化的质粒 pGreen-35S 上。然后用 HindIII 鉴定片段出入方向。正向插入可以 切出 2kb 和 0.5kb 的条带 ( 不包括骨架条带 )。反向插入可以切出 0.2kp 和 0.5kp 的条带 ( 不包括骨架条带 )。 0037 正向插入得到的重组质粒命名为 35SpGreen-EOD8-S， 用于过表达 EOD8。 0038 再将质粒 35。

14、SpGreen-EOD8-S 进行测序验证， 结果在 pGreen-35S 的 EcoRI 位点间 说 明 书 CN 102586265 A 4 3/5 页 5 插入的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0039 重 组 质 粒 中 EOD8 基 因 受 35S 启 动 子 控 制，终 止 子 为 CaMV 35S poly-A terminator。 0040 将 35SpGreen-EOD8-S 导入农杆菌 GV3101， 得到含有 35SpGreen-EOD8-S 的农杆菌 菌株， 将该菌株命名为 GV3101-EOD8-S。 0041 四、 转基因植株的获得 0042 用。

15、GV3101-EOD8-S农杆菌转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)， 以获得转EOD8基 因植株。具体操作如下 ： 0043 YEP培养基配制 ： 酵母提取物(OXOID)10g/L， 大豆蛋白胨(北京双旋微生物生物培 养基制品厂 )10g/L， NaCl 5g/L， 其余为水 ； 调 PH 值到 7.0。 0044 侵染农杆菌菌液制备 ： 用 YEP 培养基 28 摄氏度摇床培养农杆菌， 直到 OD600 2.0-3.0。 然后， 14摄氏度， 4000转离心10分钟收集菌体， 以等体积的悬浮液(0.5g/L MES， 2.2g/L MS， 5蔗糖， 其余为水 ) 悬浮菌。

16、体， 调 PH 值到 5.7 后， 加入万分之三体积的 Silwet L-77(LEHLE SEEDS， 货号 ： VIS-02) 溶液， 混匀后进行浸染 ( 花序在菌液中浸泡 2 分钟 )。 0045 将花序被菌液侵染后的拟南芥植株在温室中生长， 幼苗抽苔10cm左右时(约生长 4 周 )， 把主茎花絮去掉。二次抽苔 ( 约 1 周左右 ) 后， 用农杆菌侵染正在盛开的花序 ； 侵染 条件为 ： 遮光密闭 24 小时。再将花序被菌液侵染后的拟南芥植株在温室中生长 1 个月收 种。 0046 拟南芥培养条件为 ： 长光照 (16 小时光照 )， 强度为 4000Lux， 温度 22 摄氏度 1。

17、 摄氏度， 湿度 60-80。培养介质为按 2 1 体积混匀的蛭石和营养土。 0047 卡那霉素抗性培养基组成 ： 由葡萄糖、 卡那霉素和 1/2MS 固体培养基组成， 葡萄 糖、 卡那霉素和 1/2MS 固体培养基的配比为 10g 葡萄糖 ： 50g 卡那霉素 ： 1L 1/2MS 固体培 养基。 0048 所收种子在卡那霉素抗性培养基上筛选得到T1代转基因苗。 方法为 ： 异丙醇表面 消毒 1 分钟， 10次氯酸钠表面消毒 10 分钟， 无菌双蒸水冲洗 5 遍， 播种于卡那霉素抗性培 养基上， 4 摄氏度春花 3 天后置于正常培养间长光照培养， 约十天后将抗性苗移栽到蛭石和 营养土混合基质。

18、中， 常规培养， 10 周左右收种， 记为 T1 代结的种子。共得到 50 个株系的 T1 代转 EOD8 基因拟南芥。同时转入空载体 pGreen-35S 的拟南芥为转空载体对照。 0049 转EOD8基因拟南芥的鉴定 ： 得到的T1代转基因植株通过PCR来进一步鉴定。 以新 鲜的转基因植株叶片的基因组 DNA 为模板， 用引物对 At1g22540CAPS-F/At1g22540CAPS-R 进行 PCR 扩增。引物如下 ： 0050 At1g22540CAPS-F ： GAAAGCCCAATCAACAAAGTG 0051 At1g22540CAPS-R ： TTCACAGTAGCAGTT。

19、GGAACT。 0052 检测结果如图 2 所示。转基因植株可以扩增出两条带， 一条是基因组 DNA 中 EOD8 基因对应的条带， 一条是转基因中 EOD8 基因 cDNA 对应的条带。图中， 泳道 1-16 为转基因 拟南芥， 泳道 17 为野生型拟南芥 (Col-0)， 泳道 18 为质粒 35SpGreen-EOD8-S。转空载体对 照与野生型对照结果一样。 0053 五、 表型鉴定 0054 一、 方法 说 明 书 CN 102586265 A 5 4/5 页 6 0055 得到的转基因株系在正常条件下培养， 期间观察记录表型， 测量相应参数。 0056 花瓣和叶片面积的测量 ： 拍。

20、照后用 Image J 软件测量。 0057 细胞学分析 ： 首先用透明液 (8g 水合氯醛， 11ml 双蒸水， 1ml 甘油 ) 透明花瓣和 叶片。透明时间为 2 天。然后用差相显微镜 (DIC)(LEICA DM2500) 观察并通过 CCD(SPOT FLEX) 拍照。最后花瓣的内侧表皮细胞和叶子的叶肉细胞被测量和统计。细胞面积测量使 用 Image J 软件。 0058 表达量分析 ： 通过 real-time PCR(Lightcycler 480， ROCHE) 来分析转基因植 株表达量。荧光染料为 Lightcycler 480 SYBR Green|Master(ROCHE)。

21、。内参为 ACTIN2。 real-time PCR 引物如下 ： 0059 At1g22540CAPS-F ： GAAAGCCCAATCAACAAAGTG 0060 At1g22540CAPS-R ： TTCACAGTAGCAGTTGGAACT。 0061 ACTIN2F ： GAAATCACAGCACTTGCACC 0062 ACTIN2R ： AAGCCTTTGATCTTGAGAGC。 0063 二、 结果 ： 见图 1。 0064 图1A ： I为萌发后27天的野生型拟南芥植株(Col-0)， II为萌发后27天的转EOD8 基因拟南芥植株 (35S:EOD8#14)。表明， 转基因拟。

22、南芥的叶子明显比野生型植株小。 0065 图 1B ： I 为萌发后 35 天的 Col-0， II 为萌发后 35 天的 35S:EOD8#14。此时植株 均已抽薹， 转基因拟南芥的植株及叶子明显比野生型植株小。 0066 图 1C ： I 为 Col-0 的花， II 为 35S:EOD8#14 的花。表明， 转基因拟南芥的花明显 比野生型花小。 0067 图 1D ： 第五片叶子面积的测量， I 为 Col-0， II 为 35S:EOD8#14。纵坐标指转基因 株系35S:EOD8#14相对于Col-0第五片叶子最终面积的百分数 ； 横坐标指第五片叶子长出 来的天数。表明， 转基因拟南。

23、芥的第五片叶子明显比野生型小。 0068 图 1E ： 第 5 片叶子的叶片细胞大小和细胞数目的测量。纵坐标指转基因株系 35S:EOD8#14 相对于 Col-0 第五片叶子的叶片细胞大小和细胞数目的百分数 ； CA， 细胞面 积 ； CN， 细胞数目。I 指 Col-0， II 指 35S:EOD8#14。 0069 转基因拟南芥的第 5 片叶子的叶片细胞面积平均为野生型的 30.94。 0070 转基因拟南芥的第 5 片叶子的叶片细胞数目平均为野生型的 62.59。 0071 图 1F-1G ： 1F 为 Col-0 第 5 片叶子的叶片细胞 ； 图 1G 为 35S:EOD8#14 第。

24、 5 片叶子 的叶片细胞。 0072 图 1H ： 花参数的测量。纵坐标指转基因株系相对 Col-0 的百分比。PA， 花瓣面积 ； CA， 花瓣细胞面积 ； CN in LD， 花瓣长向上的细胞数目 ； CN in WD ； 花瓣宽向上的细胞数目。 I 为 Col-0， II 为转基因拟南芥 35S:EOD8#14， III 为转基因拟南芥 35S:EOD8#6。 0073 花瓣长向上的细胞数目的解释 ： 沿花瓣的最长的方向上画一条直线， 该直线经过 的细胞的数目。 0074 花瓣宽向上的细胞数目的解释 ： 沿花瓣的最宽的方向上画一条直线， 该直线经过 的细胞的数目。 0075 结果 ： 0。

25、076 花瓣面积 ： 转基因拟南芥 35S:EOD8#14 平均为 Col-0 的 84.34 ； 转基因拟南芥 说 明 书 CN 102586265 A 6 5/5 页 7 35S:EOD8#6 平均为 Col-0 的 80.29。 0077 花瓣细胞面积 ： 转基因拟南芥 35S:EOD8#14 平均为 Col-0 的 86.52 ； 转基因拟 南芥 35S:EOD8#6 平均为 Col-0 的 80.21。 0078 花瓣长向上的细胞数目 ： 转基因拟南芥 35S:EOD8#14 平均为 Col-0 的 89.17 ； 转基因拟南芥 35S:EOD8#6 平均为 Col-0 的 82.6。

26、5。 0079 花瓣宽向上的细胞数目 ： 转基因拟南芥 35S:EOD8#14 平均为 Col-0 的 94.38 ； 转基因拟南芥 35S:EOD8#6 平均为为 Col-0 的 90.21。 0080 图 1I ： EOD8 基因在转基因植株中的表达量。纵坐标指转基因株系相对 Col-0 的百 分比。 0081 I 为 Col-0， II 为转基因拟南芥 35S:EOD8#14， III 为转基因拟南芥 35S:EOD8#6。 0082 转空载体对照与野生型对照结果相同。 0083 结果表明， 过表达 EOD8 基因使拟南芥整个植株变小， 包括花和叶子。而变小的原 因是数目的减少和细胞的变。

27、小共同作用的结果。 说 明 书 CN 102586265 A 7 1/11 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102586265 A 8 2/11 页 9 0003 序 列 表 CN 102586265 A 9 3/11 页 10 0004 序 列 表 CN 102586265 A 10 4/11 页 11 0005 序 列 表 CN 102586265 A 11 5/11 页 12 0006 序 列 表 CN 102586265 A 12 6/11 页 13 0007 序 列 表 CN 102586265 A 13 7/11 页 14 0008 序 列 表 CN 102586265 A 14 8/11 页 15 0009 序 列 表 CN 102586265 A 15 9/11 页 16 0010 序 列 表 CN 102586265 A 16 10/11 页 17 0011 序 列 表 CN 102586265 A 17 11/11 页 18 序 列 表 CN 102586265 A 18 1/1 页 19 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586265 A 19 。