发明领域
本发明涉及提供新的免疫原，其包含优选与免疫原性载体连接的抗原 性PCSK9肽，用于预防、治疗或者减轻PCSK9相关疾病。本发明进一步 涉及这些药物、其免疫原性组合物及药物组合物的生产方法以及它们在医 药学中的应用。
背景
前蛋白转换酶(Proprotein convertase)枯草杆菌蛋白酶-kexin 9型(后文 称作PCSK9)，也称作神经细胞凋亡调节转换酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-I)，其是一种蛋白酶K样subtilase，被鉴别为哺乳动物 PCSK家族第9个成员，见Seidah et al，2003PNAS 100：928-933所述。PCSK9 基因位于人染色体1p33-p34.3。PCSK9在能增殖和分化的细胞中表达，包 括例如肝细胞、肾间充质细胞、回肠和结肠上皮细胞以及胚胎端脑神经元。
PCSK9最初的合成是～72-kDa的无活性酶前体形式或者酶原形式，其 在内质网(ER)中经历自身催化、分子内加工以激活其功能性。人PCSK9的 基因序列的长度为～22-kb，具有12个外显子，编码692个氨基酸的蛋白质， 所述基因序列可见于例如Deposit No.NP_777596.2。人、小鼠和大鼠PCSK9 核酸序列已经保藏，参见例如分别为GenBank Accession No：AX127530(也 称作AX207686)、AX207688和AX207690。
人PCSK9是一种分泌蛋白，主要在肾、肝和肠中表达。其具有三个结 构域：抑制性前结构域(pro-domain)(第1-152位氨基酸，包括在第1-30位 氨基酸的信号序列)、催化结构域(第153-448位氨基酸)以及长度为210个残 基的富含半胱氨酸残基的C末端结构域(第449-692位氨基酸)。PCSK9作 为酶原被合成，在内质网中经历在前结构域与催化结构域之间的自身催化 裂解。所述前结构域在裂解后保持与成熟蛋白质结合，分泌复合物。富含 半胱氨酸的结构域可能发挥与其它弗林蛋白酶/Kexin/枯草杆菌蛋白酶样丝 氨酸蛋白酶的P-(加工)结构域相似的作用，其似乎是激活的蛋白酶的折叠和 调节所必需的。PCSK9中的突变与血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)的异 常水平相关(Horton et al.，2006Trends.Biochem.Sci.32(2)：71-77)。
PCSK9在肝细胞和神经元细胞的分化中起作用(Seidah et al，如前)，在 胚胎肝中高表达，且明显参与胆固醇稳态。
鉴别有效治疗心血管疾病的化合物和/或药剂是高度期望的。在临床实 验中已经证实LDL胆固醇水平的降低与冠状动脉病症的比率直接相关，见 Law et al，2003BMJ 326：1423-1427。此外，近来已经示出血浆LDL胆固醇 水平中等程度终生降低与冠状动脉病症发生率的实质降低实质相关，见 Cohen et al，如前所述。甚至在具有非脂质相关心血管风险因子的高流行性 群体中也见到如此状况，见如前所述。
因此，很重要的是鉴别可以控制LDL胆固醇水平的治疗剂。
因此，很重要的是产生抑制或者拮抗PCSK9活性及PCSK9在各种治 疗病症中发挥的相应作用的药物。
PCSK9的表达或上调与增高的血浆LDL胆固醇水平相关，PCSK9的 抑制或者表达缺失与低LDL胆固醇血浆水平相关。显然，与PCSK9中序 列变异相关的较低水平的LDL胆固醇赋予针对冠心病的保护作用，见 Cohen，2006N.Engl.J.Med.354：1264-1272。
发明概述
本发明涉及免疫原，其包含抗原性PCSK9肽及任选存在的免疫原性载 体。
本发明还涉及产生任选地与免疫原性载体连接的这种抗原性PCSK9肽 的方法。
本发明还涉及免疫原性组合物，其包含任选地与免疫原性载体连接的 这种抗原性PCSK9肽，任选地包含一或多种佐剂，优选一或两种佐剂。
本发明另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的抗原性PCSK9肽或 者其免疫原性组合物，以及涉及这种组合物的医学应用。
本发明特别涉及本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或药 物组合物用作药物，优选用于治疗、减轻或预防PCSK9相关疾病。
本发明特别涉及本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或药 物组合物用作药物，优选用于治疗、减轻或预防与胆固醇水平增高相关的 疾病。
本发明的抗原性PCSK9肽特别适于治疗患有增高的LDL-胆固醇或者 与增高的LDL-胆固醇相关的病症的病人或者处于增高的LDL-胆固醇或者 与增高的LDL-胆固醇相关的病症的风险中的病人，所述病症如脂质失调(如 高脂血症，I型、II型、III型、IV型或者V型高脂血症，继发高甘油三酯 血症，高胆固醇血症，家族性高胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶 缺陷)。本发明的抗原性PCSK9肽也适于治疗患有动脉硬化病症(如动脉硬 化)、冠状动脉疾病、心血管疾病的病人，以及处于这些病症风险中的病人， 例如由于存在一或多个风险因子(如高血压、吸烟、糖尿病、肥胖或者高同 型半胱氨酸血症)所致。
再一方面，本发明提供了本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组 合物或药物组合物在制备治疗阿尔兹海默病的药物中的应用。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或药 物组合物与另一种药剂一起施用。
附图简述
图1：与LDL-R(3BPS)的EGF-A结构域结合的人PCSK9的PDB结 构，示出PCSK9中的5个肽序列(肽1-5)，它们被选择是因为参与这两个 蛋白质之间的相互作用。
图2：使用明矾加CpG作为佐剂，小鼠用缀合于VLP的肽VR_9.1至 VR_9.9免疫，针对全长重组人PCSK9的抗体应答通过在ELISA测定中滴 定血清而测量。结果显示为每组6只小鼠每一个的效价倒数，效价倒数测 量为给出0.5的光密度读数的血清稀释度。
图3：如图2所述的针对全长重组小鼠PCSK9蛋白的抗体应答。
图4：在接种小鼠的血清中测量的血浆胆固醇水平(与用于图2和图3 中抗体测定相同的样品)。
图5：在不同稀释度测试了图2和图4中使用的血浆样品的抑制重组 PCSK9和LDL受体的胞外结构域之间的相互作用的能力，由FRET测定测 量。
图6：在FRET测定中来自肽VR_9.5和VR_9.6免疫接种的血浆样品的 稀释度，显示出对PCSK9和LDL受体之间的相互作用的剂量应答性抑制。
图7：来自PDB:3BPS的PCSK9(条带(ribbon))和EGF-A(空间填充) 的复合物。PCSK9的可能与除EGF-A之外的LDLR结构域相互作用的潜在 区域由椭圆形示出。
图8：PCSK9(条带)和EGF-A(空间填充)的复合物，显示了相应于肽 VR_13/14(A)和VR_15/16(B)和VR_9.5(C)的氨基酸。
图9和图10：用肽VR_9.5和VR_9.10至VR_9.16免疫接种的小鼠的 血浆抗体应答。针对小鼠PCSK9的抗体通过使用全长小鼠PCSK9蛋白进 行的系列血浆稀释液的ELISA测定而测量。显示了每组8只小鼠的个体效 价曲线，以来自用未缀合的VLP免疫接种小鼠血浆的ELISA应答作为对照。
图11：在用缀合于VLP(使用明矾+/-CpG作为佐剂)或者CRM197 (使用TiterMax作为佐剂)的肽VR_9.5或VR_9.10免疫接种的BALB/c和 C57BL/6小鼠中诱导的针对全长人PCSK9蛋白的血清抗体应答。针对人 PCSK9的抗体通过在ELISA测定中滴定血清而测量。结果显示为对每组8 只小鼠的每一个在1.0光密度确定的效价倒数的对数值。
图12：在如图11所述免疫接种的BALB/c和C57BL/6小鼠中诱导的针 对全长小鼠PCSK9蛋白的血清抗体应答。结果显示为对每组8只小鼠的每 一个在0.5光密度确定的效价倒数的对数值。
图13：在取自BALB/c免疫接种小鼠的血清样品中测量的总胆固醇水 平(与用于图11和12中抗体测定相同的样品)。
图14：在取自C57BL/6免疫接种小鼠的血清样品中测量的总胆固醇水 平(与用于图11和12中抗体测定相同的样品)。
图15：在用明矾加CpG作为佐剂用缀合于VLP的肽VR_9.5或VR_9.17 至VR_9.35免疫接种的BALB/c小鼠中诱导的针对全长人PCSK9的抗体应 答。针对人PCSK9的抗体通过在ELISA测定中滴定血清而测量。结果显示 为对每组8只小鼠的每一个在1.0光密度确定的效价倒数的对数值。
图16：在如图15所述免疫接种的BALB/c小鼠中诱导的针对全长小鼠 PCSK9的抗体应答。针对小鼠PCSK9的抗体通过在ELISA测定中滴定血 清而测量。结果显示为对每组8只小鼠的每一个在0.5光密度确定的效价倒 数的对数值。
图17：在取自BALB/c免疫接种小鼠的血清样品中测量的总胆固醇水 平(与用于图15和16中抗体测定相同的样品)。
图18：PCSK9(条带)和EGF-A(空间填充)的复合物，含有功能获得或功 能丧失性突变相关的氨基酸序列和/或蛋白质表面暴露表位的PCSK9区域 由椭圆形示出。
发明详述
本发明的抗原性PCSK9肽
本发明涉及免疫原，其包含任选地与免疫原性载体连接的抗原性 PCSK9肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的包含4-20个氨 基酸的一部分，当将其施用给对象时能降低所述对象血液中LDL-胆固醇水 平。优选地，所述对象是哺乳动物，优选人。优选地，所述抗原性PCSK9 肽能使LDL-胆固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的参与PCSK9与 LDL受体相互作用的部分。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的参与PCSK9与 LDL受体相互作用的部分，其包含4-20个氨基酸，且当施用给对象时能降 低所述对象血液中LDL-胆固醇水平。优选地，所述对象是哺乳动物，优选 是人。优选地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-胆固醇水平降低至少2％、 5％、10％、20％、30％或者50％。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、 129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、 207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、 233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、 246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、 259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、 272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、 285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、 311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、 341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、 367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、 380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、 393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、 427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、 440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、 453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、 466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、 479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、 492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、 505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、 518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、 531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、 544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、 557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、 570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、 583、584、585、586、587和588。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：1-312、 330-398、421、423、424、426及428-588。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、 129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、 207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、 220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、 233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、 246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、 259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、 272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、 285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、 311、312、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、 341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、 367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、 380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、 393、394、395、396、397和398。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能参与LDL 受体的EGF-A结构域的相互作用的部分。这部分的实例在图1中示出。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能参与与LDL 受体的结构域EGF-A的相互作用的部分，包含4-20个氨基酸，且当将其施 用给对象时能降低所述对象血液中LDL-胆固醇水平。优选地，所述对象是 哺乳动物，优选是人。优选地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-胆固醇水 平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：1所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自：SEQ ID No：1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44和45。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：46所示 PCSK9片段的5-15个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100和101。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：102所示 PCSK9片段的5-14个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：102、103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145和146。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：147所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、 162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、 175、176、177、178、179、180和181。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：182所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、 197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、 223、224、225和226。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：330所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：330、331、 332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、 345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、 358和359。
在一优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：19、56、 63、109、153、165、184、186、187、188、332和424。
在一优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：19、56、 63、109、153和184。
在一优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：56、184、 186、187、188和332。
在一最优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No：56所 示序列的肽。
在更优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No：184或 187所示序列的肽。
在一最优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No：184所 示序列的肽。
在一最优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No：332所 示序列的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9的可能参与与除 了EGF-A结构域之外的LDL受体区域相互作用的区域中选择。这部分的实 例在图7和8中示出。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能参与与除 了EGF-A结构域之外的LDL受体区域相互作用的部分，包含4-20个氨基 酸，且当将其施用给对象时能降低所述对象血液中LDL-胆固醇水平。优选 地，所述对象是哺乳动物，优选是人。优选地，所述抗原性PCSK9肽能使 LDL-胆固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、30％或者50％。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：227所示 PCSK9片段的5-12个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：227、228、 229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、 255、256、257、258、259、260、261和262。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：263所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：263、264、 265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、 278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、 291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、 304、305、306和307。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：360所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：360、361、 362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、 375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、 388、389、390、391、392、393、394、395、396、397和398。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9前结构域的区域 (SEQ ID No：329)中选择。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9前结构域的一部 分，包含4-20个氨基酸，且当将其施用给对象时能降低所述对象血液中 LDL-胆固醇水平。优选地，所述对象是哺乳动物，优选是人。优选地，所 述抗原性PCSK9肽能使LDL-胆固醇水平降低至少2％、5％、10％、20％、 30％或者50％。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：308、309、 310、311和312。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：309所示 PCSK9片段的5-12个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：309、429、 430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、 443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、 456、457、458、459、460、461、462和463。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：508所示 PCSK9片段的5-12个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：508、509、 510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、 523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、 536、537、538、539、540、541、542和543。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：310所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：310、464、 465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、 478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、 491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、 504、505、506和507。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No：544所示 PCSK9片段的5-13个、优选6-8个连续氨基酸的肽。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：544、545、 546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、 559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、 572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、 585、586、587和588。
在一优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：312、 421、422、423、426、427、428、445、482、525和563。
在一更优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽选自SEQ ID No：445、 482、525和563。
在一最优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No：445所 示序列的肽。
这种抗原性PCSK9肽可以单独使用或者组合使用，优选当与免疫原性 载体结合时，以诱导对象体内自身抗-PCSK9抗体，用以治疗、预防或者减 轻PCSK9-相关疾病。
本领域技术人员显然已知哪种技术可用于证实某特定构建体是否落入 本发明范围内。这种技术包括但不限于在本申请实施例章节描述的技术及 下文所述技术。
本发明的抗原性PCSK9肽诱导自身抗-PCSK9抗体的能力可以使用本 申请实施例3所述测试在小鼠中测量。由本发明抗原性PCSK9肽诱导的自 身抗体降低循环血浆胆固醇水平的能力可以使用实施例3所述测试在小鼠 中测量。本发明抗原性PCSK9肽诱导的自身抗体抑制PCSK9与LDL受体 之间相互作用的能力可以通过使用实施例3所述测试(FRET测定)直接测 量，或者通过测量细胞表面LDL受体的上调而间接测量(如相关文献中所 述，使用体外细胞系或者通过测量(例如通过Western印迹)抗体表达动物的 肝活检组织中的LDL受体水平进行)，所述细胞表面LDL受体的上调是阻 断PCSK9介导的下调的结果。
术语“抗原性PCSK9肽生物学活性”当在本文使用时是指本发明的抗 原性PCSK9肽在患者体内诱导自身抗PCSK9抗体的能力。
优选地，当将所述抗原性PCSK9肽施用给对象时，其能降低所述对象 血液中的LDL-胆固醇水平。优选地，所述对象是哺乳动物，优选是人。优 选地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-胆固醇水平降低至少2％、5％、10％、 20％、30％或者50％。
在一个实施方案中，本发明的抗原性PCSK9肽是这样的大小，由此其 模拟选自其中发现天然表位的整个PCSK9结构域的区域。在一特定实施方 案中，本发明的抗原性PCSK9肽长度少于100个氨基酸，优选少于75个 氨基酸，更优选少于50个氨基酸，甚至更优选少于40个氨基酸。本发明 的抗原性PCSK9肽的长度典型为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30 个氨基酸，优选4-20个氨基酸，例如6-12个、6-8个或者9-12个氨基酸。
本发明抗原性PCSK9肽的具体实例在序列表中提供，包括长度范围为 5-17个氨基酸的肽。
本发明的抗原性肽包括衍生自哺乳动物PCSK9、优选人PCSK9(SEQ ID No：399)或小鼠PCSK9(SEQ ID No：400)、更优选人PCSK9的一部分的氨 基酸序列，这种衍生的PCSK9部分相应于天然发生的PCSK9的氨基酸序 列或者相应于变体PCSK9的氨基酸序列，即其中取代、添加或缺失少数氨 基酸但基本保留相同免疫学性质的天然发生的PCSK9的氨基酸序列。此外， 这种衍生的PCSK9部分可以通过氨基酸、特别是N末端和C末端氨基酸进 一步修饰，以使得所述抗原性PCSK9肽是构象限制的和/或使得所述抗原性 PCSK9肽在进行适当化学处理后能偶联免疫原性载体。
本文揭示的抗原性PCSK9肽涵盖了衍生自PCSK9氨基酸序列的功能 活性变体肽，其中一些氨基酸被缺失、插入或者取代，同时基本上不降低 其免疫学性质，即这种功能活性变体肽保留实质的抗原性PCSK9肽生物学 活性。典型地，这种功能变体肽与选自SEQ ID No：1-312、330-398及420-588 的氨基酸序列具有氨基酸序列同源性，优选高度同源。
在一个实施方案中，这种功能活性变体肽与选自SEQ ID No：1-312、 330-398及420-588的氨基酸序列呈现至少60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％或者95％相同性。
多肽序列相似性也称作序列相同性典型是使用序列分析软件测量的。 蛋白质分析软件使用赋予各种取代、缺失及其它修饰包括保守氨基选取代 的相似性测量而匹配相似序列。例如，GCG含有程序如“Gap”和“Bestfit”， 其可以使用默认参数确定密切相关多肽如来自不同物种生物体的同源多肽 之间或者野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或者序列相同性。 见例如GCG Version 6.1。多肽序列也可以使用利用默认参数或者推荐参数 的FASTA进行对比，GCG Version 6.1.FASTA(如FASTA2和FASTA3)中的 一个程序提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的排列对比和序列 相同性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物 体的序列的数据库进行对比时，另一种算法是使用默认参数的计算机程序 BLAST，特别是blastp或tblastn。见例如Altschul et al.，J.Mol.Biol. 215：403-410(1990)、Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)所 述。
功能活性变体包含天然发生的功能活性变体，如等位基因变体和种变 体以及可通过例如诱变技术或者通过直接合成方法产生的非天然发生的功 能活性变体。
功能活性变体与SEQ ID No：1-312、330-398和420-588所示任何肽具 有大约如1、2、3、4或5个氨基酸残基不同，且仍保留抗原性PCSK9生 物学活性。在这种对比需要排列对比时，以最大同源性排列对比所述序列。 变异的位点可以发生在所述肽中的任何位置，只要所述生物学活性与SEQ ID No：1-312、330-398和420-588所示肽基本上相似即可。
关于怎样产生表型沉默氨基酸取代的指导在Bowie et al.，Science，247： 1306-1310(1990)中提供，其教导有两种主要策略研究氨基酸序列对改变的 耐受性。
第一种策略采用在进化过程期间通过天然选择的氨基酸取代的耐受 性。通过在不同物种中对比氨基酸序列，可以鉴别在物种之间保守的氨基 酸位置。这些保守的氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相反，其中取 代已经被天然选择耐受的氨基酸位置表示对于蛋白质功能不是关键的位 置。因此，可以修饰耐受氨基酸取代的位置，同时仍保留所述修饰的肽的 特异性免疫原性活性。
第二种策略使用遗传工程以在克隆的基因的特定位置导入氨基酸改变 以鉴别对于蛋白质功能关键的区域。例如，可以使用位点定向诱变或者丙 氨酸扫描诱变技术(Cunningham et al.，Science，244：1081-1085(1989))。然后 可以检测所得变体肽的特异性抗原性PCSK9生物学活性。
根据Bowie et al.所述，这两种策略已经揭示了蛋白质对于氨基酸取代 是令人惊奇地耐受。该作者进一步指出哪些氨基酸改变在该蛋白质某些氨 基酸位置可能是容许的。例如，最深藏或内部(在蛋白质的三级结构内)的氨 基酸残基需要非极性侧链，而少数表面或外部侧链的特征通常是保守的。
在蛋白质的氨基酸中导入突变的方法为本领域技术人员熟知。见例如 Ausubel(ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons， Inc.(1994)、T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989))所述。
突变也可以通过使用可商购试剂盒如QuikChangeTM位点定向诱变试剂 盒(Stratagene)或者直接通过肽合成方法导入。通过置换不显著影响抗原性 PCSK9肽功能的氨基酸而产生所述抗原性PCSK9肽的功能活性变体可以由 本领域技术人员完成。
可以在本发明的肽之一中进行的氨基酸取代的类型是保守氨基酸取 代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似化学性质(如电荷或疏 水性)的侧链R基团的另一氨基酸残基取代。通常，保守氨基酸取代基本上 不改变蛋白质的功能性质。在两或多个氨基酸序列由于保守取代而彼此不 同的情况中，序列相同性百分比或者相似性程度可以向上调整以校正取代 的保守性质。进行这种调整的方式为本领域技术人员熟知。见例如Pearson， Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
具有相似化学性质侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨 酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪 氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬 氨酸和谷氨酸；及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸 取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸， 丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
或者，保守置换是在PAM250log似然矩阵(likelihood matrix)中具有 正值的任何改变，见Gonnet et al.，Science 256：1443-45(1992)揭示。“中等保 守”置换是在PAM250log似然矩阵中具有非负值的任何改变。
功能活性变体肽也可以通过使用杂交技术分离。简而言之，使用与编 码感兴趣肽如SEQ ID No：1-312、330-398和420-588的完整或部分核酸序 列具有高度同源性的DNA制备功能活性肽。因此，本发明的抗原性PCSK9 肽还包括这样的肽，其与SEQ ID No：1-312、330-398及420-588所示一或 多个肽功能等价且由与编码SEQ ID No：1-312、330-398及420-588任一的 核酸或者其互补体杂交的核酸分子编码。本领域技术人员可以使用易于获 得的密码子表而容易地确定编码本发明肽的核酸序列。如此，这些核酸序 列在本文未示出。
编码是功能活性变体的肽、多肽或蛋白质的核酸的杂交严格性是例如 10％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶液和1×鲑精DNA(低严格条件)。 更优选的条件是25％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶液和1×鲑精DNA (中等严格条件)，更优选的条件是50％甲酰胺、5×SSPE、1×Denhart’s溶 液及1×鲑精DNA(高严格条件)。然而，除了上述甲酰胺浓度之外还有一 些因素影响杂交严格性，本领域技术人员可适当地选择这些因素实现相似 严格性。
编码功能活性变体的核酸分子也可以通过基因扩增方法如PCR方法分 离，使用编码感兴趣的肽、多肽或者蛋白质如SEQ ID No：1-312、330-398 和420-588所示任一肽的核酸分子的一部分作为探针。
在本发明的一个实施方案中，本发明的肽衍生自天然来源且分离自哺 乳动物如人、灵长类动物、猫、狗、马、小鼠或者大鼠，优选分离自人来 源。本发明的肽因此可通过使用标准蛋白质纯化技术分离自细胞或组织来 源。
或者，本发明的肽可以通过化学合成或者使用重组DNA技术产生。
例如，本发明的肽可以通过本领域熟知的固相方法合成。合适的合成 可以通过利用T-boc或F-moc程序进行。环肽可以通过固相方法合成，使 用本领域熟知的F-moc程序及在完全自动化设备中的聚酰胺树脂进行。或 者，本领域技术人员能获知手工进行这些方法必需的实验室程序。关于固 相合成方法的技术和程序在Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach’by E.Atherton and R.C.Sheppard，published by IRL at Oxford University Press(1989)及’Methods in Molecular Biology，Vol.35：Peptide Synthesis Protocols(ed.M.W.Pennington and B.M.Dunn)，chapter 7， pp91-171by D.Andreau et al中描述。
或者，可以使用本领域熟知的技术将编码本发明肽的多核苷酸导入可 以在合适的表达系统中表达的表达载体中，随后分离或者纯化感兴趣的表 达的肽、多肽或者蛋白质。本领域可获得许多细菌、酵母、植物、哺乳动 物和昆虫表达系统，可以使用任何这种表达系统。任选地，编码本发明肽 的多核苷酸可以在无细胞翻译系统中翻译。
本发明的抗原性PCSK9肽也可以包含由于存在多个基因、可变转录事 件、选择性RNA剪接事件及可变翻译和翻译后事件而产生的那些肽。肽可 以在这样的系统如培养的细胞中表达，所述系统导致与当所述肽在天然细 胞中表达时所存在的基本上相同的翻译后修饰，或者在这样的系统中表达， 所述系统导致当在天然细胞中表达时存在的翻译后修饰如糖基化或裂解的 改变或丧失。
本发明的抗原性PCSK9肽可以作为融合蛋白产生，其含有其它非- PCSK9或非-PCSK9-衍生氨基酸序列，如本文定义的氨基酸接头或者信号 序列或者免疫原性载体，以及可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转 移酶、组氨酸标签和葡萄球菌A蛋白。在融合蛋白中可存在一种以上本发 明的抗原性PCSK9肽。所述异源多肽可以融合于例如本发明肽的N末端或 C末端。本发明的肽也可以作为包含同源氨基酸序列即其它PCSK9或 PCSK9-衍生序列的融合蛋白而产生。
本发明的抗原性PCSK9肽可以是线性的或者是构象限制的。如本文在 提及肽时所用，术语“构象限制的(conformationally constrained)”是指这 样的肽，其中三维结构在一个空间排列中随着时间而基本上得以保持。构 象限制的分子可具有改良的性质，如增加的亲和性、代谢稳定性、膜通透 性或者溶解性。
此外，预期这种构象限制的肽以与其天然环状构象相似的构象呈递抗 原性PCSK9表位，从而诱导抗-PCSK9抗体更易于识别完整的天然自身 PCSK9分子或者具有识别自身PCSK9分子的增加的亲和性。构象限制的方 法为本领域熟知，包括但不限于桥连和环化。
现有技术领域已知在线性肽中导入构象限制的一些方法。例如，在肽 的两个相邻氨基酸之间的桥连导致局部构象修饰，其柔性与常规肽相比受 限。形成这种桥连的一些可能性包括掺入内酰胺和piperazinones(综述参见 Giannis and.Kolter，Angew.Chem.Int.Ed.，1993，32：1244)。
如本文在提及肽时所用，术语“环状”是指包括两个非相邻氨基酸或 氨基酸类似物之间的分子内键的结构。所述环化可以通过共价或非共价键 实现。分子内键包括但不限于主链-主链，侧链-主链，侧链-侧链，侧链-末 端基团，末端-末端键。环化方法包括但不限于在肽的N末端残基与C末端 残基之间形成酰胺键，在非相邻氨基酸或氨基酸类似物之间形成二硫键， 在Lys和Asp/Glu残基侧链之间形成酰胺键，在丝氨酸残基与Asp/Glu残基 之间形成酯键，在例如一个氨基酸或其类似物的侧链基团与氨基末端残基 的N末端胺之间形成内酰胺键，以及形成赖氨酸正亮氨酸和二酪氨酸键。 也可以使用二硫键的碳形式，如乙烯基或乙基键(J.Peptide Sc.，2008，14， 898-902)以及与适当多取代的亲电子试剂如二-、三-或四卤代烷进行烷化反 应(PNAS，2008，105(40)，15293-15298；ChemBioChem，2005，6，821-824)。各 种修饰的脯氨酸类似物也可用于在肽中掺入构象限制(Zhang et al.，J.Med Chem.，1996，39：2738-2744；Pfeifer and Robinson，Chem.Comm.，1998， 1977-1978)。可用于环化本发明肽的化学方法获得用包括但不限于内酰胺 键、腙键、肟键、噻唑烷键、硫醚键或锍键环化的肽。
设计构象限制肽的另一方法在US10/114918中描述，该方法是将感兴 趣的短氨基酸序列附着于模板，产生环状限制的肽。这种环状肽不仅通过 其模板而结构稳定化，并从而呈现出可以模拟天然蛋白质如病毒和寄生虫 上或者其自身蛋白质(自体同源哺乳动物蛋白质如PCSK9)上构象表位的三 维构象，而且其与线性肽相比对于在血清中的蛋白酶降解更具抗性。US 10/114918进一步揭示了构象限制的交联肽的合成方法，通过制备合成氨基 酸用于主链偶联至适当位置的氨基酸以稳定肽的超二级结构。交联可以通 过正交保护的(2S，3R)-3-氨基脯氨酸残基的伯胺基团与适当位置的谷氨酸 侧链羧基基团的酰胺偶联而实现。这种方法已被用于CS蛋白质的构象限制 的四肽重复序列的制备，其中至少一个脯氨酸被(2S，3R)-3-氨基脯氨酸置 换，以导入侧链羧基，谷氨酸已经掺入以置换丙氨酸。
交联策略还包括应用Grubbs闭环复分解反应，以形成设计为模拟α-螺 旋构象的stapled肽(Angew.Int.Ed.En Engl.，1998，37，3281；JACS，2000，122， 5891)；使用多功能化糖；使用氨基羧乙基硫色氨酸键(Chemistry Eu.J.，2008， 24，3404-3409)；使用叠氮化物与炔的“click’”反应，其可以作为侧链氨基 酸残基掺入或者位于肽序列的主链内(Drug Disc.Today，2003，8(24)， 1128-1137)。在文献中也已知金属离子通过隔离特定残基如组氨酸(其协同 金属阳离子)可稳定线性肽的限制的构象(Angew.Int.Ed.Engl.，2003，42， 421)。相似地，用非天然酸功能化线性肽序列及胺功能性或者多胺和多酸功 能性也可用于在激活及酰胺键形成之后实现环化结构。
根据一个实施方案，所述抗原性PCSK9肽是通过所述抗原性PCSK9 肽的两个非相邻氨基酸(例如N末端和C末端氨基酸)的彼此分子内共价键 而构象限制的。根据另一实施方案，本发明的抗原性PCSK9肽是通过共价 结合支架分子而构象限制的。根据进一步的实施方案，所述抗原性PCSK9 肽是简单限制的，即在任一末端(C或N末端)偶联于支架分子或者通过未位 于任一末端的另一氨基酸偶联于支架分子。根据另一实施方案，所述抗原 性PCSK9肽是双重限制的，即在C末端和N末端均偶联所述支架分子。根 据另一实施方案，所述抗原性肽是通过异手性二脯氨酸单位(D-Pro-L-Pro) 的模板作用环化而限制的(Spath et al，1998，Helvetica Chimica Acta 81， p1726-1738)。
所述支架(也称作平台)可以是能通过共价键降低所述抗原性PCSK9肽 可采取的构象数的任何分子。举例的构象限制支架包括蛋白质和肽，例如 脂笼蛋白相关分子，如含有硫氧还蛋白和硫氧还蛋白样蛋白的β-桶，核酸 酶(例如RNaseA)，蛋白酶(例如胰蛋白酶)，蛋白酶抑制剂(例如水蛭蛋白酶 抑制剂C)，抗体或其结构刚性片段，荧光蛋白如GFP或YFP，食鱼螺毒素， 纤连蛋白III型结构域的环状区域，CTL-A4，以及病毒样颗粒(VLP)。
其它合适的平台分子包括碳水化合物如琼脂糖。所述平台可以是线性 或环状分子，例如是闭合的以形成环。所述平台通常与所述抗原性PCSK9 肽是异源的。这种与平台连接的构象限制的肽与线性肽相比被认为对于蛋 白酶解更具抗性。
根据一个优选的实施方案，所述支架是如本申请中定义的免疫原性载 体。在进一步的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽在免疫原性载体上被简 单限制。在另一实施方案中，所述抗原性PCSK9肽在免疫原性载体上被双 重限制。在这种方式中，所述抗原性PCSK9肽形成构象限制的环结构，其 经证实是作为细胞内识别分子的特别合适的结构。
本发明的抗原性PCSK9肽可以被修饰以便于与平台缀合，例如通过在 一或两个末端加入末端半胱氨酸和/或通过加入接头序列如双甘氨酸头或尾 加末端半胱氨酸，用赖氨酸作为末端的接头，或者本领域技术人员已知的 进行这种功能的任何其它接头。关于这种接头的详细描述在后文揭示。也 可以使用生物正交化学(bioorthogonal chemistry)(如上述click反应)，其 使得全长肽序列与载体偶联，因此避免了任何区域化学(regiochemical)和 化学选择性问题。已知且可以使用刚性接头如Jones et al.Angew.Chem.Int. Ed.2002，41：4241-4244所述接头激发改良的免疫学应答。
在进一步的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽附着于多价模板，其自 身与载体偶联，因此增加抗原的密度(见下文)。所述多价模板可以是适当功 能化的聚合物或者寡聚物如(但不限于)寡谷氨酸或者寡壳聚糖(见图19)。
本发明的免疫原性载体
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原性PCSK9肽与免疫原性载 体分子连接，形成进行免疫接种的免疫原，优选其中所述载体分子与天然 PCSK9分子不相关。
本文所用术语“免疫原性载体”包括具有在宿主动物体内独立激发免 疫原性应答性质的那些材料，其能通过肽、多肽或蛋白质中游离羧基、氨 基或者羟基与所述免疫原性载体材料上相应基团之间的肽键或酯键的形成 而直接共价偶联于所述肽、多肽或者蛋白质，或者通过常规双功能连接基 团键合，或者是作为融合蛋白。
用于本发明免疫原中的载体的类型为本领域技术人员已知。举例的这 种免疫原性载体是：血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)；球蛋白；甲状腺 球蛋白；血红蛋白；血蓝蛋白(特别是匙孔血蓝蛋白[KLH])；聚赖氨酸；聚 谷氨酸；赖氨酸-谷氨酸共聚物；含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物；脂质体载 体；结核菌素的纯化蛋白质衍生物(PPD)；失活的细菌毒素或类毒素，如破 伤风或白喉毒素(TT和DT)或者TT的片段C，CRM197(白喉毒素的非毒性 但是抗原性等同变体)，其它DT点突变体，如CRM176、CRM228、CRM 45 (Uchida et al J.Biol.Chem.218；3838-3844，1973)；CRM 9、CRM 45、 CRM102、CRM 103和CRM107，及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins，Ed：Frankel，Maecel Dekker Inc，1992所述其它突变； Glu-148缺失或突变为Asp，Gln或Ser和/或Ala 158突变为Gly及在US 4709017或US 4950740中揭示的其它突变；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/ 或Lys 534中至少一或多个残基的突变及在US 5917017或US 6455673中揭 示的其它突变；或者在US 5843711中揭示的片段，肺炎球菌溶血素(Kuo et al(1995)Infect lmmun 63；2706-13)，包括以某种方式解毒的ply，例如 dPLY-GMBS(WO 04081515，PCT/EP2005/010258)或者dPLY-formol，PhtX， 包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(PhtA、PhtB、PhtD或PhtE的序列在WO 00/37105或WO 00/39299中揭示)以及Pht蛋白融合体，如PhtDE融合蛋白、 PhtBE融合蛋白、Pht A-E(WO 01/98334，WO 03/54007，WO2009/000826)， OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白-通常从脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清 组B中提取-EP0372501)，PorB(来自脑膜炎奈瑟氏菌)，PD(流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)蛋白D-见例如EP 0 594 610B)，或者其免疫学 功能等价物，合成肽(EP0378881，EP0427347)，热激蛋白(WO 93/17712， WO 94/03208)，百日咳蛋白(WO 98/58668，EP0471177)，细胞因子，淋巴 因子，生长因子或激素(WO 91/01146)，包含来自不同病原体衍生抗原的多 个人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(Falugi et al(2001)Eur J Immunol 31； 3816-3824)，如N19蛋白(Baraldoi et al(2004)Infect lmmun 72；4884-7)，肺 炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)，铁吸收蛋白(WO 01/72337)，艰难梭 菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)。
在一优选的实施方案中，本发明的免疫原性载体是CRM197。
在另一个实施方案中，所述免疫原性载体是病毒样颗粒(VLP)，优选重 组病毒样颗粒。
如本文所用，术语“病毒样颗粒”是指类似于病毒但是经证实是非病 原性的结构。通常，病毒样颗粒缺少至少一部分病毒基因组。病毒样颗粒 也可以通常通过异源表达而大量产生且是可易于纯化的。本发明的病毒样 颗粒可含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的典型及优选的 实施方案是病毒壳体，如相应病毒、噬菌体或者RNA-噬菌体的病毒壳体。
如本文所用，术语“噬菌体病毒样颗粒”是指这样的病毒样颗粒，其 类似噬菌体结构，是非复制性和非感染性的，且缺少至少编码噬菌体复制 机构的一或多个基因，及典型也缺少编码使病毒附着于或者进入宿主中的 一或多个蛋白质的一或多个基因。然而，这个定义应也涵盖这样的噬菌体 病毒样颗粒，其中前述一或多个基因仍存在，但是是失活的，且因此也产 生非复制性和非感染性噬菌体病毒样颗粒。
从RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚基自主装配形成的及任选地含有宿 主RNA的壳体结构在本文称作“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”。特定实例 是Qbeta、MS2、PP7或AP205外壳蛋白的VLP。例如在Qbeta外壳蛋白的 特定情况中，所述VLP可只从Qbeta CP亚基装配(通过表达含有例如TAA 终止密码子的Qbeta CP基因而产生，通过阻抑作用排除较长的A1蛋白的 任何表达，见Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 39：9-15(1996))，或者在 壳体装配中另外含有A1蛋白亚基。通常限制壳体装配中Qbeta A1蛋白相 对于Qbeta CP的百分比，以保证壳体形成。
适合作为本发明免疫原性载体的举例的VLP包括但不限于如下蛋白的 VLP，即Qbeta，MS2，PP7，AP205，及其它噬菌体外壳蛋白，如下病毒壳 体和核心蛋白，乙型肝炎病毒(Ulrich，et al.，Virus Res.50：141-182(1998))， 麻疹病毒(Warnes，et al.，Gene 160：173-178(1995))，Sindbis病毒，轮状病毒 (美国专利5,071,651和5,374,426)，口蹄疫病毒(Twomey，et al.，Vaccine 13： 1603-1610，(1995))，Norwalk病毒(Jiang，X.，et al.，Science 250：1580-1583 (1990)；Matsui，S.M.，et al.，J Clin.Invest.87：1456-1461(1991))，逆转录病毒 GAG蛋白(PCT专利申请WO 96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白pl，乙型肝 炎病毒的表面蛋白(WO 92/11291)，人乳头瘤病毒(WO 98/15631)，人多瘤病 毒(Sasnauskas K.，et al.，Biol.Chem.380(3)：381-386(1999)；Sasnauskas K.，et al.，Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast.3rd Interational Workshop″Virus-like particles as vaccines.″Berlin， September 26-29(2001))，RNA噬菌体，Ty，fr噬菌体，GA-噬菌体，AP 205- 噬菌体，及特别是Qbeta-噬菌体，豇豆褪绿斑驳病毒，豇豆花叶病毒，人 乳头瘤病毒(HPV)，牛乳头瘤病毒，猪细小病毒，细小病毒如B19，猪细小 病毒(PPV)和犬细小病毒(CPV)，杯状病毒(例如Norwalk病毒，兔出血病病 毒[RHDV])，动物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP，丝状/杆状植物病毒，包 括但不限于烟草花叶病毒(TMV)，马铃薯X病毒(PVX)，番木瓜花叶病毒 (PapMV)，苜蓿花叶病毒(AlMV)，及石茅高粱花叶病毒(JGMV)，昆虫病毒 如禽兽棚病毒(FHV)和四病毒，多瘤病毒如鼠多瘤病毒(MPyV)，鼠亲肺病 毒(MPtV)，BK病毒(BKV)，以及JC病毒(JCV)。
正如本领域技术人员所已知，用作本发明免疫原性载体的VLP不限于 任何特定形式。所述颗粒可以是化学合成的或者通过生物方法合成，其可 以是天然或者非天然的。例如，这种类型的实施方案包括病毒样颗粒或者 其重组形式。在更特别的实施方案中，所述VLP可包含或者由已知形成VLP 的任何病毒的重组多肽组成。所述病毒样颗粒可进一步包含或者另外由这 种多肽的一或多个片段以及这种多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型 相应物相比在氨基酸水平具有例如至少80％、85％、90％、95％、97％或者 99％相同性。适用于本发明中的变体VLP可衍生自任何生物体，只要其能 形成如本文定义的“病毒样颗粒”及可用作“免疫原性载体”即可。
本发明优选的VLP包括HBV的壳体蛋白或者表面抗原(分别为HBcAg 和HBsAg)或者其重组蛋白或片段，及RNA-噬菌体的外壳蛋白或者其重组 蛋白或片段，更优选Qbeta的外壳蛋白或者其重组蛋白或片段。
在一个实施方案中，与本发明的抗原性PCSK9肽组合使用的免疫原性 载体是HBcAg蛋白。可用于本发明中的举例的HBcAg蛋白可由本领域技 术人员容易地确定。例如包括但不限于HBV核心蛋白，如Yuan et al.，(J. Virol.73：10122-10128(1999))所述，及在WO00/198333、WO 00/177158、 WO 00/214478、WO00/32227、WO01/85208、WO02/056905、WO03/024480 和WO03/024481中描述。适用于本发明中的HBcAg可衍生自任何生物体， 只要其能形成如本文定义的“病毒样颗粒”及可用作“免疫原性载体”即 可。
可用于本发明中的特别感兴趣的HBcAg变体是其中一或多个天然存在 的半胱氨酸残基已经被缺失或取代的那些变体。本领域熟知游离半胱氨酸 残基可涉及许多化学副反应中，包括二硫化物置换，与例如在与其它物质 的组合治疗中注射的或形成的化学物质或代谢物反应，或者在暴露于UV 光时直接氧化反应及与核苷酸反应。因此可以产生毒性加合物，特别是考 虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向的事实。所述毒性加合物因此分布在 物种多样性之间，其可单独以低浓度存在，但是当总和在一起时达到毒性 水平。见于上述事实，在已经被修饰以除去天然存在的半胱氨酸残基的疫 苗组合物中使用HBcAg的一个优势是当抗原或抗原决定簇附着时毒性物质 可以结合的位点数目减少或者完全消除。
此外，本发明也可以使用加工形式的HBcAg，其缺少乙型肝炎核心抗 原前体蛋白的N末端前导序列，特别是当HBcAg是在未发生加工的条件下 产生的情况中(例如在细菌系统中表达)。
本发明的其它HBcAg变体包括：i)与野生型HBcAg氨基酸序列之一或 者其亚部分(subportion)具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相 同性的多肽序列，使用常规的已知计算机程序确定；ii)C-末端截短突变体， 包括其中从C末端已经除去1、5、10、15、20、25、30、34或35个氨基 酸的突变体；ii)N-末端截短突变体，包括其中从N末端已经除去1、2、5、 7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的突变体；iii)在N末端和C末端均 截短的突变体，包括其中在N末端已经除去1、2、5、7、9、10、12、14、 15或17个氨基酸及在C末端已经除去1、5、10、15、20、25、30、34或 35个氨基酸的HBcAg。
在本发明范围内的其它HBcAg变体蛋白是被修饰以增强外源表位的免 疫原性呈递的那些变体，其中缺失一或多个四精氨酸重复，但是其中C末 端半胱氨酸被保留(见例如WO01/98333)，以及嵌合C末端截短HBcAg，如 在WO02/14478、WO03/102165和WO04/053091中描述的那些。
在另一个实施方案中，与本发明的抗原性PCSK9肽组合使用的免疫原 性载体是HBsAg蛋白。可用于本发明中的HBsAg蛋白可易于由本领域技 术人员确定。例如包括但不限于在US5792463、WO02/10416和WO08/ 020331中描述的HBV表面蛋白。适用于本发明中的HBsAg可衍生自任何 生物体，只要其能形成如本文定义的“病毒样颗粒”及可用作“免疫原性 载体”即可。
在另一实施方案中，与本发明的抗原性PCSK9肽或多肽组合使用的免 疫原性载体是Qbeta外壳蛋白。
发现Qbeta外壳蛋白当在大肠杆菌中表达时自主装配为壳体(Kozlovska TM.et al.，GENE 137：133-137(1993))。获得的壳体或者病毒样颗粒示出二 十面噬菌体样壳体结构，直径为25nm及T＝3准对称。进一步地，噬菌体 Qss的晶体结构已经解决。所述壳体含有外壳蛋白的180个拷贝，其通过二 硫键在共价五聚物和六聚物中连接(Golmohammadi，R.et al.，Structure 4： 5435554(1996))，导致Qbeta外壳蛋白的壳体的显著稳定性。Qbeta壳体蛋 白也示出对于有机溶剂和变性剂的非同寻常的抗性。Qbeta外壳蛋白的壳体 的高度稳定性是一优势特征，特别是用于本发明哺乳动物和人的免疫和接 种中时。
可用于本发明中的举例的Qbeta外壳蛋白可易于由本领域技术人员确 定。例如在WO02/056905、WO03/024480、WO03/024481(以其全部内容援 引加入本文)中已经广泛描述，包括但不限于在PIR数据库中揭示的氨基酸 序列，登记号VCBPQbeta是指Qbeta CP，登记号AAA16663是指Qbeta A1 蛋白，及其变体，包括其中N末端甲硫氨酸被裂解的变体蛋白，缺失100、 150或180个氨基酸的C末端截短形式的Qbeta A1，已经通过缺失或取代 除去赖氨酸残基或者通过取代或插入添加赖氨酸残基而修饰的变体蛋白(见 例如在WO03/024481中揭示的Qbeta-240、Qbeta-243、Qbeta-250、Qbeta-251 和Qbeta-259，所述文献以其全部内容援引加入)，以及与上述任何Qbeta核 心蛋白显示至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同性的变体。适用 于本发明的变体Qbeta外壳蛋白可衍生自任何生物体，只要其能形成如本文 定义的“病毒样颗粒”及可用作“免疫原性载体”即可。
本发明的抗原性PCSK9肽可以通过化学缀合或者通过遗传工程化融合 配偶体的表达而与免疫原性载体偶联。所述偶联非必需是直接偶联，而是 可以通过接头序列偶联。更通常地，在抗原性肽融合、缀合或另外附着于 免疫原性载体的情况中，典型要在所述抗原性肽的一或两个末端加入间隔 或者接头序列。这种接头序列通常包含由细胞的内体或者其它小泡区室的 蛋白酶体、蛋白酶识别的序列。
在一个实施方案中，本发明的肽作为与免疫原性载体的融合蛋白被表 达。所述肽的融合可以通过插入在所述免疫原性载体一级序列中而实现， 或者通过与所述免疫原性载体的N或C末端融合而实现。在后文当提及肽 与免疫原性载体的融合蛋白时，涵盖与亚基序列任一端的融合或者在所述 载体序列内内部插入所述肽。在后文提及融合时，其可以通过所述抗原性 肽插入所述载体序列中、用所述抗原性肽取代所述载体的部分序列或者通 过组合缺失、取代或插入而实现。
当所述免疫原性载体是VLP时，嵌合抗原性肽-VLP亚基通常能自主装 配成VLP。展示与其亚基融合的表位的VLP在后文也称作嵌合VLP。例如， EP 0 421 635B描述了嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原颗粒在病毒样颗粒中呈 递外源肽序列的应用。
可以在所述抗原性肽序列任一端加入侧翼氨基酸残基，所述抗原性肽 序列与VLP亚基序列的任一端融合或者将这种肽序列内部插入VLP亚基序 列中。甘氨酸和丝氨酸残基是在融合的肽加入侧翼序列中特别优选使用的 氨基酸。甘氨酸残基赋予另外的柔性，其可以降低外源序列与VLP亚基序 列融合的潜在不稳定效应。
在本发明一特定实施方案中，所述免疫原性载体是HBcAg VLP。本领 域已经描述了所述抗原性肽与HBcAg的N末端的融合蛋白(Neyrinck，S.et al.，Nature Med.5：11571163(1999))或者插入在所谓的主要免疫显性区域 (MIR)中(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 44：98114(2001))，WO 01/ 98333)，这些是本发明的特异实施方案。在MIR中有缺失的HBcAg的天然 发生的变体也已经有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 44：98-114 (2001))，与N或C末端的融合以及插入在MIR的相应于与野生型HBcAg 相比是缺失位点的位置是本发明进一步的实施方案。与C末端的融合也已 经有描述(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 44：98-114(2001))。本领域 技术人员将易于发现关于怎样使用传统分子生物学技术构建融合蛋白的指 导。本领域已经描述了编码HBcAg和HBcAg融合蛋白及可用于表达HBcAg 和HBcAg融合蛋白的载体和质粒(Pumpens，P.and#38；Grens，E. Intervirology 44：98-114(2001)，Neyrinck，S.et al.，Nature Med.5：1157-1163 (1999))，其可用于实施本发明。优化自主装配效力及展示插入在HBcAg的 MIR中的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及在插入时从HBcAg 序列MIR内缺失的氨基酸数目(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 44： 98-114(2001)；EP 0 421 635；美国专利No.6,231,864)，或者换句话说， HBcAg的哪些氨基酸用新表位取代。例如，已经描述了用外源表位取代 HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或者80-81(Pumpens，P.and Grens， E.，Intervirology 44：98-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864，WO00/26385)。 HBcAg含有长精氨酸尾(Pumpens，P.and Grens，E.，Intervirology 44：98-114 (2001))，其对于壳体装配不是必须的并且能结合核酸(Pumpens，P.and Grens， E.，Intervirology 44：98-114(2001))。包含或者缺少这个精氨酸尾的HBcAg 是本发明的两个实施方案。
在本发明另一特异实施方案中，所述免疫原性载体是RNA噬菌体优选 Qbeta的VLP。RNA噬菌体的主要外壳蛋白当在细菌及特别是在大肠杆菌 中表达时自发装配成VLP。本领域已经描述了融合蛋白构建体，其中抗原 性肽与截短形式的Qbeta的A1蛋白C末端融合或者插入在所述A1蛋白中 (Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology，39：9-15(1996))。所述A1蛋白是通过 在UGA终止密码子的抑制作用产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考 虑到在N末端甲硫氨酸的裂解则为328个氨基酸。在丙氨酸(由Qbeta CP 基因编码的第二个氨基酸)之前的N末端甲硫氨酸的裂解通常发生在大肠杆 菌中，对于Qbeta外壳蛋白的N末端也是这种情况。所述A1基因的一部分， UGA琥珀密码子的3’部分编码所述CP延伸，其长度为195个氨基酸。所 述抗原性肽插入在CP延伸的第72与73位之间是本发明进一步的实施方案 (Kozlovska，T.M.，et al.，Intervirology 39：9-15(1996))。所述抗原性肽融合在 C末端截短的Qbeta A1蛋白的C末端是本发明进一步优选的实施方案。例 如，Kozlovska et al.，(Intervirology，39：9-15(1996))描述了Qbeta A1蛋白质 融合，其中所述表位融合在第19位截短的Qbeta CP延伸的C末端。
如Kozlovska et al.(Intervirology，39：9-15(1996))所述，展示融合的表位 的颗粒的装配典型需要存在A1蛋白-抗原融合体及野生型CP以形成嵌合颗 粒。然而，本发明也包括包含病毒样颗粒及从而特别包含RNA噬菌体Qbeta 外壳蛋白的VLP(其只是由具有与其融合的抗原性肽的VLP亚基组成)的实 施方案。
嵌合颗粒的产生可以通过多种方式实现。Kozlovska et al.，Intervirology， 39：9-15(1996)描述了三种方法，这三种方法均可用于实施本发明。在第一 种方法中，融合的表位在VLP上的有效展示通过质粒在大肠杆菌菌株中的 表达而实现，所述质粒编码在CP与CP延伸之间具有UGA终止密码子的 Qbeta All蛋白融合体，所述大肠杆菌菌株携带编码克隆的UGA阻抑物 tRNA的质粒，使得UGA密码子翻译成Trp(pISM3001质粒(Smiley B.K.，et al.，Gene 134：33-40(1993)))。在另一种方法中，所述CP基因终止密码子被 修饰为UAA，表达A1蛋白-抗原融合体的第二质粒被共转化。所述第二质 粒编码不同的抗生素抗性，及复制起点与第一质粒相容。在第三种方法中， CP和A1蛋白-抗原融合体以双顺反子形式编码，与启动子如Trp启动子可 操纵地连接，如Kozlovska et al.，Intervirology，39：9-15(1996)的图1所述。
适于抗原或者抗原决定簇的融合的其它VLP在WO03/024481中描述， 包括噬菌体fr、RNA phase MS-2、乳头瘤病毒的壳体蛋白、反转录转座子 Ty、酵母以及逆转录病毒样颗粒、HIV2Gag、豇豆花叶病毒、细小病毒VP2 VLP、HBsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。适于实施本发明的嵌合VLP 的实例也包括在Intervirology 39：1(1996)中描述的那些。预期用于本发明中 的VLP的其它实例是：HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、 HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒、SV-40的病毒样颗粒、 多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和Norwalk病毒。
对于与免疫原性载体偶联或者不偶联的本发明的任何重组表达的抗原 性PCSK9肽，编码所述肽或蛋白质的核酸也是本发明的一方面，包含所述 核酸的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞(自主或染色体插入的) 也是本发明的一方面。通过将其在上述宿主细胞中表达及从中分离免疫原 的重组产生所述肽或蛋白质的方法是本发明的另一方面。全长天然PCSK9 分子或者编码其的全长天然DNA序列不包含在本发明内。
在另一个实施方案中，本发明的肽使用本领域熟知的技术与免疫原性 载体化学偶联。通过单点缀合(例如N末端或C末端点)或者作为锁定的结 构(locked down structure)，其中肽的两端缀合于免疫原性载体蛋白或者缀 合于支架结构如VLP，可以发生缀合以使得肽自由运动。通过本领域技术 人员已知的缀合化学发生缀合，如通过半胱氨酸残基、赖氨酸残基或者通 常已知作为缀合点的其它羧基部分，如谷氨酸或者天冬氨酸。因此，例如 对于直接共价偶联而言，可以利用碳二亚胺、戊二醛或者(N- [y-malcimidobutyryloxy]琥珀酰亚胺酯，利用可商购的异双功能接头如CDA 和SPDP(根据厂商指导使用)。肽、特别是环化肽与蛋白质载体通过酰基肼 肽衍生物缀合的例子在WO03/092714中描述。在偶联反应之后，所述免疫 原可易于通过透析方法、凝胶过滤方法、分级分离方法等分离和纯化。以 半胱氨酸残基为末端的肽(优选在环化区域外面有接头)可以通过马来酰亚 胺化学与载体蛋白质便利地缀合。
当所述免疫原性载体是VLP时，具有相同氨基酸序列或者不同氨基酸 序列的一些抗原性肽可以与单一VLP分子偶联，优选获得以定向方式呈递 一些抗原决定簇的重复及有序结构，如WO00/32227、WO03/024481、WO02/ 056905和WO04/007538所述。
在优选的实施方案中，所述抗原性PCSK9肽通过化学交联、典型及优 选通过使用异双功能交联剂结合VLP。本领域已知一些异双功能交联剂。 在一些实施方案中，所述异双功能交联剂含有可与第一附着位点反应的官 能团，即与VLP或VLP亚基的赖氨酸残基的侧链氨基基团反应，另一官能 团可与优选的第二附着位点反应，即与所述抗原性肽融合的半胱氨酸残基 反应，任选地也通过还原用于反应。所述方法的第一个步骤典型被称作衍 生化，是VLP与交联剂的反应。这个反应的产物是激活的VLP，也称作激 活的载体。在第二个步骤中，使用常规方法如凝胶过滤或者透析方法，未 反应的交联剂被除去。在第三个步骤中，所述抗原性肽与激活的VLP反应， 这个步骤典型被称作偶联步骤。未反应的抗原性肽可以在第四个步骤中任 选地除去，例如通过透析。一些异双功能交联剂为本领域已知。这些包括 优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、 Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA及其它交联剂，例如 得自Pierce Chemical Company(Rockford，IL，USA)并具有一个与氨基反应 的官能团及一个与半胱氨酸残基反应的官能团。上述交联剂均导致硫醚键 形成。
适用于实施本发明的另一类交联剂特征在于在偶联时在所述抗原性肽 与VLP之间导入二硫键。属于这个类别的优选交联剂包括例如SPDP和 Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。VLP与交联剂的衍生化程度可以通过改变实验条 件而影响，所述实验条件如每种反应配偶体的浓度、一种试剂相对于另一 种的过量、pH、温度和离子强度。偶联度，即抗原性肽/VLP亚基的量可以 通过改变上述实验条件而调节，以符合疫苗的要求。
抗原性肽与VLP结合的另一种方法是VLP表面上赖氨酸残基与抗原性 肽上半胱氨酸残基的连接。在一些实施方案中，可需要含有半胱氨酸残基 作为第二附着位点或者作为其一部分的氨基酸接头与抗原性肽融合以偶联 VLP。通常，优选柔性氨基酸接头。所述氨基酸接头的例子选自：(a)CGG； (b)N-末端γ1-接头；(c)N-末端γ3-接头；(d)Ig铰链区；(e)N-末端甘氨酸接 头；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12及k＝0-5；(g)N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h) (G)kC(G)m(S)i(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，i＝0-2；(i)GGC；(k) GGC-NH2；(l)C-末端γ1-接头；(m)C-末端γ3-接头；(n)C-末端甘氨酸接头； (o)(G)nC(G)k，n＝0-12及k＝0-5；(p)C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q) (G)m(S)t(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，1＝0-2及o＝0-8。 氨基酸接头的进一步实例是免疫球蛋白的铰链区，甘氨酸-丝氨酸接头 (GGGGS)n，及甘氨酸接头(G)n，所有均进一步含有半胱氨酸残基作为第二 附着位点及任选地含有进一步的甘氨酸残基。所述氨基酸接头的典型优选 实例是：N-末端γ1：CGDKTHTSPP，C-末端γ1：DKTHTSPPCG，N-末端γ3： CGGPKPSTPPGSSGGAP，C-末端γ3：PKPSTPPGSSGGAPGGCG，N-末端甘 氨酸接头：GCGGGG及C-末端甘氨酸接头：GGGGCG。
当疏水性抗原性肽与VLP结合时，特别适用于本发明中的其它氨基酸 接头是：对于N末端接头是CGKKGG或CGDEGG，对于C末端接头是 GGKKGC和GGEDGC。对于C末端接头，所述末端半胱氨酸任选地是C 末端酰胺化的。
在本发明的一些实施方案中，在所述肽C末端的GGCG、GGC或 GGC-NH2(NH2表示酰胺化)接头或者在N末端的CGG是优选的氨基酸接 头。通常，甘氨酸残基被插入在较大(bulky)氨基酸与用作第二附着位点 的半胱氨酸之间，以避免在偶联反应中所述较大氨基酸的潜在位阻现象。 在本发明的进一步实施方案中，氨基酸接头GGC-NH2与所述抗原性肽的C 末端融合。
抗原性肽上存在的半胱氨酸残基需要以其还原状态与激活的VLP上的 异双功能交联剂反应，即需要利用游离的半胱氨酸或者具有游离巯基的半 胱氨酸残基。在作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式的情况中，例如 其形成二硫键，需要用例如DTT、TCEP或者对-巯基乙醇还原这个二硫键。 低浓度的还原剂与偶联反应相容，如WO 02/05690所述，而较高浓度则抑 制偶联反应，如本领域技术人员已知，在这种情况中，在偶联之前需要除 去还原剂或者降低其浓度，例如通过透析、凝胶过滤或者反相HPLC进行。
通过使用上述方法的异-双功能交联剂使所述抗原性肽与VLP结合，使 得所述抗原性肽与VLP以定向方式偶联。使所述抗原性肽与VLP结合的其 它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS使所述抗原性肽与VLP交联的方法。
在其它方法中，使用同-双功能交联剂如戊二醛、DSGBM[PEO]4、 BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或者具有与VLP的胺基 或羧基反应的官能团的其它已知的同-双功能交联剂使所述抗原性肽附着于 VLP。
VLP与抗原性肽结合的其它方法包括其中VLP是生物素化的及所述抗 原性肽作为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白表达的方法，或者其中抗原性肽与 VLP均是生物素化的方法，例如WO 00/23955所述。在这种情况中，通过 调节抗原性肽与链霉抗生物素蛋白的比率而使所述抗原性肽可以首先结合 链霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白，以便仍有游离结合位点可用于与在 下一步骤中加入的VLP结合。或者，所有成分可以在“一锅”反应中混合。 可以使用其它配体-受体对作为结合剂以使抗原性肽与VLP结合，其中利用 可溶形式的受体和配体，其能与VLP或抗原性肽交联。或者，所述配体或 受体可以与抗原性肽融合，由此介导与分别与所述受体或配体化学结合或 者融合的VLP的结合。融合也可以通过插入或取代而实现。
如果空间排列允许，一或几个抗原分子可以附着于RNA噬菌体外壳蛋 白的壳体或VLP的一个亚基，优选通过RNA噬菌体的VLP的暴露的赖氨 酸残基进行。RNA噬菌体的外壳蛋白VLP及特别是QP外壳蛋白VLP的 一个特异特征因此是每个亚基可以偶联若干抗原。这样可以产生密度抗原 阵列。
Q外壳蛋白的VLP或者壳体在其表面上展示限定数目的赖氨酸残基， 具有限定拓扑结构，即三个赖氨酸残基指向壳体内部并与RNA相互作用， 以及四个其它赖氨酸残基暴露于壳体外面。这些限定性质有益于抗原附着 于其中赖氨酸残基与RNA相互作用的所述颗粒的外面而不是所述颗粒的内 部。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面上也具有限定数目的赖氨 酸残基以及这些赖氨酸残基的限定拓扑结构。
在本发明的进一步实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基和/或第二 附着位点包含巯基或者半胱氨酸残基。在本发明的更进一步的实施方案中， 第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在本发明的 进一步实施方案中，所述抗原或抗原决定簇通过半胱氨酸残基与RNA噬菌 体外壳蛋白VLP的赖氨酸残基结合，特别是与Qbeta外壳蛋白的VLP结合。
衍生自RNA噬菌体的VLP的另一优势是其在细菌中的高表达产量， 使得可以低成本产生大量材料。此外，VLP作为载体的使用使得可以形成 具有可变抗原密度的大型抗原阵列和缀合物。特别地，RNA噬菌体的VLP 的使用及从而RNA噬菌体Qbeta外壳蛋白的VLP的使用可以实现非常高的 表位密度。
根据本发明的一个实施方案，本文揭示的抗原性PCSK9肽与CRM197 直接或者通过本文揭示的肽接头之一连接，优选化学交联，以产生免疫原。 在一个实施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽与CRM197通过如本文所 述化学交联方式及优选通过使用如上述异双功能交联剂连接。
与CRM197一起使用的优选的异双功能交联剂是BAANS(溴乙酸N-羟 基琥珀酰亚胺酯)、SMPH(琥珀酰亚氨基-6-[β-马来酰亚氨基丙酰氨基]己酸 酯)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、 Sulfo-SMCC、SVSB、SIA以及得自例如Pierce Chemical Company(Rockford， IL，USA)的其它交联剂。在本发明优选的实施方案中，所述异双功能交联剂 是BAANS或SMPH。
或者，在本发明中也可以使用适合在所述抗原性肽与CRM197之间导 入二硫键的交联剂。属于这个类别的优选交联剂包括例如SPDP和 Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在一个具体的实施方案中，当本文揭示的抗原性PCSK9肽序列包含半 胱氨酸时，所述抗原性PCSK9肽可以通过所述半胱氨酸直接与CRM197共 价连接。
在本发明的一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物可包含免疫原 性缀合物的混合物，即偶联于一或若干个本发明的抗原性PCSK9肽的免疫 原性载体。因此，这些免疫原性组合物可以由氨基酸序列不同的免疫原性 载体组成。例如，可以制备这样的疫苗组合物，其包含“野生型”VLP和 其中一或多个氨基酸残基已经被改变(例如缺失、插入或取代)的修饰的VLP 蛋白。或者，可以使用相同免疫原性载体，但是偶联于不同氨基酸序列的 抗原性PCSK9肽。
本发明因此还涉及产生本发明的免疫原的方法，所述方法包括：i)提 供本发明的抗原性PCSK9肽，ii)提供本发明的免疫原性载体，优选VLP， 及iii)组合所述抗原性PCSK9肽及所述免疫原性载体。在一个实施方案中， 所述组合步骤通过化学交联、优选通过异双功能交联剂进行。
在本发明的一个实施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽与免疫原性 载体分子连接。在一个实施方案中，所述免疫原性载体选自本文所述任何 免疫原性载体。在另一实施方案中，所述免疫原性载体选自：血清白蛋白， 如牛血清白蛋白(BSA)，球蛋白，甲状腺球蛋白，血红蛋白，血蓝蛋白(特 别是匙孔血蓝蛋白[KLH])以及病毒样颗粒(VLP)。在优选的实施方案中，所 述免疫原性载体是白喉类毒素，白喉毒素的CRM197突变体，破伤风类毒 素，匙孔血蓝蛋白或者病毒样颗粒(VLP)。在更优选的实施方案中，所述免 疫原性载体是DT、CRM197或者VLP，所述VLP选自HBcAg VLP、HBsAg VLP、Qbeta VLP、PP7VLP、PPV VLP、Norwalk病毒VLP或者本文揭示 的任何变体。在更优选的实施方案中，所述免疫原性载体是噬菌体VLP， 如Qbeta VLP，选自Qbeta CP；Qbeta A1，Qbeta-240，Qbeta-243，Qbeta-250， Qbeta-251及Qbeta-259(在WO03/024481中揭示)或者PP7。
在另一优选的实施方案中，所述免疫原性载体是CRM197。
在一个实施方案中，所述免疫原性载体与本文揭示的抗原性PCSK9肽 直接或者通过接头共价连接。在一个实施方案中，所述免疫原性载体通过 如本文所述表达融合蛋白与本文揭示的所述抗原性PCSK9肽连接。在另一 个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽通过如本文所述化学交联方式及优选 通过使用异双功能交联剂与免疫原性载体优选VLP连接。本领域已知一些 异双功能交联剂。在一些实施方案中，所述异双功能交联剂含有可以与第 一附着位点反应的官能团，即与VLP或VLP亚基的赖氨酸残基的侧链氨基 反应，以及含有另一个官能团，该官能团可与优选的第二附着位点反应， 即与所述抗原性肽融合的半胱氨酸残基反应，所述半胱氨酸残基经还原反 应而可用于反应。
包含接头的本发明抗原性PCSK9肽
在本发明的一个实施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽进一步包含 在其N末端或者在其C末端或者在N和C两个末端的接头，所述接头在化 学交联反应中能与所述免疫原性载体的附着位点反应。在一个实施方案中， 本文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其C末端的接头，所述接头 化学式为(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，优选(G)nC，其中n是选自0、1、2、3、 4、5、6、7、8、9和10的整数，优选选自0、1、2、3、4和5，更优选选 自0、1、2和3，最优选n是0或1(在n等于0时，该化学式代表半胱氨酸)。 优选本文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其C末端的具有化学式 GGGC、GGC、GC或C的接头。
在本发明另一实施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包 含在其N末端的接头，所述接头的化学式是C(G)n、CS(G)n或者K(G)n，优 选C(G)n，其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，优 选选自0、1、2、3、4和5，更优选选自0、1、2和3，最优选n是0或1(在 n等于0时，该化学式代表半胱氨酸)。优选本文揭示的所述抗原性PCSK9 肽进一步包含在其N末端的具有化学式CGGG、CGG、CG或C的接头。
在另一实施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其 C末端的接头，该接头的化学式是(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，优选(G)nC， 其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数，优选选自0、 1、2、3、4和5，更优选选自0、1、2和3，最优选n是0或1(在n等于0 时，该化学式代表半胱氨酸)以及包含在其N末端的接头，该接头的化学式 是C(G)n、CS(G)n或者K(G)n，优选C(G)n，其中n是选自0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9和10的整数，优选0、1、2、3、4和5，更优选0、1、2 和3，最优选n是0或1(在n等于0时，该化学式代表半胱氨酸)。优选本 文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其N末端的具有化学式 CGGG、CGG、CG或C的接头以及在其C末端的具有化学式GGGC、GGC、 GC或C的接头。优选地，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽进一步包含在 其N末端的半胱氨酸及在其C末端的半胱氨酸。
进一步包含这种接头的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQ ID NO：313、 314、315、316、317、322、323、324、325、326、327、328、401、402、 403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、 416、417、418和419所示。
进一步包含这种接头的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQ ID NO：313、 314、315、316、317、322、323、324、325、326、327和328所示。
优选的包含接头的抗原性PCSK9肽如SEQ ID No：317、322、323、324、 401、402、403、413、414、415和416所示。
优选的包含接头的抗原性PCSK9肽如SEQ ID No：317、322、323和324 所示。
最优选的包含接头的抗原性PCSK9肽如SEQ ID No：317、322、402和 413所示。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是环化的。在一个实施方案 中，所述环化的抗原性PCSK9肽附着于免疫原性载体。在一个实施方案中， 所述环化的抗原性PCSK9肽通过共价结合附着于免疫原性载体。在一个实 施方案中，所述环化的抗原性PCSK9肽通过其氨基酸侧链之一与载体的共 价结合而附着于免疫原性载体。在一个实施方案中，在环化的PCSK9肽中 加入包含可变数目甘氨酸残基和一个半胱氨酸残基的半胱氨酸、GC或CC 片段以使得可以通过加入的半胱氨酸与所述免疫原性载体共价结合。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽是环化的，且包含半胱氨酸、 (G)nC或C(G)n片段，其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 的整数，优选选自0、1、2、3、4和5，更优选选自0、1、2和3，最优选 n是0或1(在n等于0时，该化学式代表半胱氨酸)。
这种构象限制的抗原性PCSK9肽的非限制性实例是SEQ ID No：318、 319、320和321所示肽。优选的环化的肽是SEQ ID No：318所示肽。
使用各种接头使抗原性PCSK9肽与上述载体或支架缀合的实例均在本 发明范围内且组成了本发明的各个实施方案，这些实例在下文提供：
肽-GGGGGC-支架，肽-GGGGC-支架，肽-GGGC-支架，肽-GGC- 支架，肽-GC-支架，肽-C-支架，肽-GGGGGK-支架，肽-GGGGK-支架， 肽-GGGK-支架，肽-GGK-支架，肽-GK-支架，肽-K-支架，肽-GGGGSC- 支架，肽-GGGSC-支架，肽-GGSC-支架，肽-GSC-支架，肽-SC-支架， 支架-CSGGGG-肽，支架-CSGGG-肽，支架-CSGG-肽，支架-CSG-肽， 支架-CS-肽，支架-KGGGG-肽，支架-KGGG-肽，支架-KGG-肽，支架-KG- 肽，支架-K-肽。
在一个实施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽组成， 所述支架由本文揭示的任何免疫原性载体、优选VLP组成。
下文提供了使用各种接头与双重限制的(doubly constrained)肽的缀合 的组合的实例，其中所述载体可以是相同的载体单体或者不同的载体单体。 (在下文的实例中，所述GC接头可以由上文举例的任何GK接头或者GSC 接头或者本领域技术人员已知的任何其它接头取代)：
载体-CGGGGG-肽-GGGGGC-载体，载体-CGGGG-肽-GGGGC-载体， 载体-CGGGG-肽-GGGGC-载体，载体-CGGG-肽-GGGC-载体，载体 -CG-肽-GC-载体，载体-CG-肽-C-载体，载体-C-肽-C-载体。
在一个实施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽组成， 所述载体由本文揭示的任何免疫原性载体优选VLP组成。
在一个实施方案中，本发明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述 肽由选自SEQ ID No：1-312、330-398及420-588的氨基酸序列组成或者基 本上由其组成，其中所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其C末端或者在 其N末端的半胱氨酸，其通过硫醚键与免疫原性载体化学交联。在一优选 的实施方案中，所述免疫原性载体选自DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素) 或者TT的片段C、PD(流感嗜血杆菌蛋白D)、CRM197，其它DT点突变 体，如CRM176、CRM228、CRM 45、CRM 9、CRM102、CRM 103和CRM107。 优选所述免疫原性载体是CRM197。
在一个实施方案中，本发明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述 肽由选自SEQ ID No：1-312、330-398及420-588的氨基酸序列组成或者基 本上由其组成，其中所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其C末端或者在其 N末端的半胱氨酸，其通过硫醚键与免疫原性载体化学交联，使用SMPH(琥 珀酰亚氨基-6-[β-马来酰亚氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS(溴乙酸N-羟 基琥珀酰亚胺酯)作为交联剂。在一优选的实施方案中，所述免疫原性载体 选自DT(白喉毒素)、TT(破伤风类毒素)或者TT的片段C、PD(流感嗜血杆 菌蛋白D、CRM197，其它DT点突变体，如CRM176、CRM228、CRM 45、 CRM 9、CRM102、CRM103及CRM107。优选所述免疫原性载体是CRM197。
在一个实施方案中，本发明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述 肽由选自SEQ ID No：1-312、330-398及420-588的氨基酸序列组成或者基 本上由其组成，其中所述抗原性PCSK9肽进一步包含在其C末端的半胱 氨酸，其通过硫醚键与免疫原性载体化学交联，使用SMPH(琥珀酰亚氨基 -6-[β-马来酰亚氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS(溴乙酸N-羟基琥珀酰亚 胺酯)作为交联剂，所述键在CRM197的赖氨酸残基与所述抗原性肽的半胱 氨酸残基之间。
包含本发明的抗原性PCSK9肽的组合物
本发明进一步涉及组合物，特别是免疫原性组合物，也称作“主题 (subject)免疫原性组合物”，其包含本发明的抗原性PCSK9肽，优选与免疫 原性载体连接，及任选地包含至少一种佐剂。这种免疫原性组合物，特别 是当作为药物组合物配制时，被认为可用于预防、治疗或者减轻PCSK9- 相关疾病。
在一些实施方案中，本发明的主题免疫原性组合物包含抗原性PCSK9 肽，任选地包含接头，所述肽包含选自SEQ ID No：1-328、330-398及401-588 的氨基酸序列及其功能活性变体。在一些实施方案中，所述抗原性PCSK9 肽与免疫原性载体连接，优选与DT、CRM197或VLP连接，更优选与 HBcAg、HBsAg、Qbeta、PP7、PPV或者Norwalk病毒VLP连接。
在优选的实施方案中，本发明的主题免疫原性组合物包含抗原性 PCSK9肽，任选地包含接头，所述肽包含与VLP、优选Qbeta VLP连接的 选自SEQ ID No：1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性变 体。
在优选的实施方案中，本发明的主题免疫原性组合物包含抗原性 PCSK9肽，任选地包含接头，所述肽包含与CRM197连接的选自SEQ ID No：1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性变体。
本发明的包含抗原性PCSK9肽的主题免疫原性组合物可以通过多种方 式制备，如在下文详细描述。
在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含单一物种的抗原性 PCSK9肽，如所述免疫原性组合物包含一群抗原性PCSK9肽，其基本上均 具有相同氨基酸序列。在其它实施方案中，主题免疫原性组合物包含两或 多个不同抗原性PCSK9肽，如所述免疫原性组合物包含一群抗原性PCSK9 肽，该群成员的氨基酸序列可不同。主题免疫原性组合物可包含2-大约20 个不同的抗原性PCSK9肽，如主题免疫原性组合物可包含2，3，4，5，6，7，8， 9，10，11-15或者15-20个不同的抗原性PCSK9肽，所述肽均具有与其它抗 原性PCSK9肽氨基酸序列不同的氨基酸序列。
在其它实施方案中，主题免疫原性组合物包含多聚体化的抗原性 PCSK9多肽。如本文所用，术语“包含抗原性PCSK9肽的免疫原性组合物” 或者“本发明的免疫原性组合物”或者“主题免疫原性组合物”是指包含 偶联或者不偶联于免疫原性载体的单一物种(多聚体化或否)或者多物种的 抗原性PCSK9肽的免疫原性组合物。在使用两或多种肽偶联载体的情况中， 所述肽可以偶联于相同载体分子或者各自偶联于载体分子，然后组合产生 免疫原性组合物。
本发明另一方面涉及产生本发明免疫原的方法，所述方法包括将抗原 性PCSK9肽与免疫原性载体偶联。在一个实施方案中，所述偶联是化学偶 联。
佐剂
在一些实施方案中，主题免疫原性组合物包含至少一种佐剂。合适的 佐剂包括适用于哺乳动物优选人的那些。可用于人的已知合适佐剂的例子 包括但不限于明矾，磷酸铝，氢氧化铝，MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v 聚山梨醇酯80(Tween 80)、0.5％w/v三油酸山梨坦(Span 85))，含有CpG的 核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)，QS21(皂苷佐剂)，MPL(单磷酰脂质A)， 3DMPL(3-O-去酰化MPL)，Aquilla提取物，ISCOMS(见例如et al. (1998)J.Leukocyte Biol.64：713；WO90/03184，WO96/11711，WO 00/48630， WO98/36772，WO00/41720，WO06/134423和WO07/026190)，LT/CT突变 体，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，Quil A，TiterMax classic，TiterMax Gold，白细胞介素等。对于包括但不限于动物实验的兽医应用，可以使用 弗氏佐剂，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正- 胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称作正-MDP)，N-乙酰胞壁酰 -L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷 酰氧)-乙胺(CGP 19835A，称作MTP-PE)及RIBI，其含有从细菌中提取的三 种成分，单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯以及细胞壁骨架 (MPL+TDM+CWS)，于2％角鲨烯/Tween 80乳状液中。
增强所述组合物效力的其它举例的佐剂包括但不限于：(1)水包油乳状 液配制物(有或无其它特定免疫刺激剂，如胞壁酰肽(见下文)或者细菌细胞 壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837，Vaccine design：the subunit and adjuvant approach第10章，eds.Powell & Newman，Plenum Press 1995)，含有 5％角鲨烯、0.5％Tween 80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)和0.5％Span 85(三油酸山梨坦)(任选地含有与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)共价连 接的胞壁酰三肽)，使用微流化仪(microfluidizer)配制成亚微米粒子，(b) SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％pluronic阻断聚合物 (pluronic-blocked polymer)L121及thr-MDP，微流体化为亚微米粒子或者 旋动以产生较大颗粒大小的乳状液，以及(c)RIBITM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含有2％角鲨烯，0.2％Tween 80及一或多种 细菌细胞壁成分如单磷酰脂质A(MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，以及细 胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOXTM)；(2)可以使用皂苷佐剂，如 QS21，STIMULONTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)， (Isconova，Sweden)，或者(Commonwealth Serum Laboratories，Australia)，或者从中产生的粒子如ISCOMs(免疫刺激复合物)， 所述ISCOMS可以不具有另外的洗涤剂，如WO00/07621所述；(3)完全弗 氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白细胞介素(例如 IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)，干扰素(例 如γ-干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)等；(5) 单磷酰脂质A(MPL)或者3-O-去酰化MPL(3dMPL)，例如GB-2220221， EP-A-0689454所述，当与肺炎球菌糖一起使用时任选地基本上没有明矾， 例如WO00/56358所述；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳状液的组合， 如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231所述；(7)包含CpG基序 的寡核苷酸[见Krieg Vaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr opin Mol Ther20013：15-24；Roman et al.，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner et αl.， PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis et al，J.Immunol，1998，160， 870-876；Chu et αi.，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford et al，Ear.J. Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveami e/al.，Vaccine，1988，16， 1216-1224，Krieg etal.，Nature，1995，374，546-549；Klinman et al.，PNAS USA， 1996，93，2879-2883；Ballas et al，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery et al，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern et al，Cell Immunol，1996，167， 72-78；Yamamoto et al，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey et al，J. Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina et al，J.Immunol，1991，147， 1759-1764；Yi et al，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi et al，J.Immunol， 1996，157，5394-5402；Yi et al，J.Immunol，1998，160，4755-4761及Yi et al，J. Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、 WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]， 即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的；(8)聚氧乙烯醚 或者聚氧乙烯酯，如WO99/52549所述；(9)聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性 剂组合辛苯昔醇(WO01/21207)或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂组合至 少一种额外的非离子表面活性剂如辛苯昔醇(WO01/21152)；(10)皂苷与免疫 刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂与金 属盐颗粒，如WO00/23105所述；(12)皂苷与水包油乳状液，如WO99/11241 所述；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+固醇)，如WO98/57659 所述；(14)发挥免疫刺激剂作用以增强组合物效力的其它物质，如胞壁酰肽， 包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-25-乙酰-正胞壁 酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰 胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺MTP-PE)； (15)toll-样受体(TLR)的配体，天然或者合成的(例如Kanzler et al 2007， Nature Medicine 13，p1552-9所述)，包括TLR3配体如polyI:C及相似的化合 物如Hiltonol和安普利更(Ampligen)。
在特定实施方案中，所述佐剂是免疫刺激性寡核苷酸，优选CpG寡核 苷酸。如本文所用，CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)，由此除非特别指出则这些术语可互换使用。免疫刺激性CpG寡脱氧 核苷酸含有一或多个免疫刺激性CpG基序，其是未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤 二核苷酸，任选地在某些优选的碱基中。CpG免疫刺激性基序的甲基化状 态通常是指二核苷酸内胞嘧啶残基。含有至少一个未甲基化CpG二核苷酸 的免疫刺激性寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其含有5’未甲基化胞嘧啶，通 过磷酸键与3’鸟嘌呤连接，其通过结合Toll-样受体9(TLR-9)激活免疫系统。 在另一实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多个甲基化CpG 二核苷酸，其通过TLR9激活免疫系统，但是不如在CpG是未甲基化的情 况的作用强。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多个回文结构，其反过 来可包含CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已经在许多授权的专利、公开的专 利申请及其它出版物中描述，包括美国专利6,194,388、6,207,646、6,214,806、 6,218,371、6,239,116和6,339,068。
已经鉴别了不同类别的CpG免疫刺激性寡核苷酸。这些类别被称作A、 B、C和P类，在下文更详细描述。本发明的方法包括这些不同类别的CpG 免疫刺激性寡核苷酸的应用。
任何类别均可进行E修饰，增强其效力。E修饰可以是用卤素取代5’ 末端核苷酸；举例的这种取代包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。E修 饰也可包括乙基-尿苷取代5’末端核苷酸。
“A类”CpG免疫刺激性寡核苷酸通过其从浆细胞样树突状细胞(pDC) 中诱导高水平干扰素-α(IFN-α)及诱导NK细胞激活同时对B细胞激活具有 最小作用的能力而功能性鉴定。从结构上说，这个类别在5’和3’末端典型 具有稳定的聚-G序列。其还具有至少6个核苷酸的含有回文结构的磷酸二 酯CpG二核苷酸序列，例如但非必需含有如下六聚体回文结构之一： GACGTC、AGCGCT或者AACGTT，由Yamamoto及同事所述，Yamamoto S et al.J.Immunol 148：4072-6(1992)。A类CpG免疫刺激性寡核苷酸及这 个类别的举例序列已经在美国非临时专利申请系列号09/672,126和公开的 PCT申请PCT/US00/26527(WO 01/22990)中描述，这两个专利均在2000年 9月27日提交。
在一个实施方案中，本发明的“A类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序 列：5’GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’。
A类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’，其中 “*”表示硫代磷酸酯键，“_”表示磷酸二酯键。
本发明的B类CpG寡核苷酸序列是在上文大体描述以及在公开的PCT 专利申请PCT/US95/01570和PCT/US97/19791及USP 6,194,388、6,207,646、 6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068中揭示的那些序列。举例的序 列包括但不限于在这些申请和专利中揭示的那些。
在一个实施方案中，本发明的“B类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序 列：
5’TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’(SEQ ID No：589)，或者
5’TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’(SEQ ID No：590)，或者
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID No：591)，或者
5’TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’(SEQ ID No：592)，或者
5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’(SEQ ID No：593)。
在任何这些序列中，所有键可以全是硫代磷酸酯键。在另一个实施方 案中，在任何这些序列中，一或多个键可以是磷酸二酯键，优选在CpG基 序的“C”和“G”之间，产生半软的CpG寡核苷酸。在任何这些序列中， 乙基-尿苷或者卤素可以取代5’T；举例的卤素取代包括但不限于溴-尿苷或 者碘-尿苷取代。
B类寡核苷酸的一些非限制性例子包括：
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’，
其中“*”是指硫代磷酸酯键。
“C类”CpG免疫刺激性寡核苷酸通过其激活B细胞和NK细胞及诱 导IFN-α的能力而功能性鉴定。在结构上，这个类别典型包括具有一或多 个B类免疫刺激性CpG基序的区域，及GC富集的回文或者近回文区域， 使得所述分子能形成二级(如茎环)或者三级(如二聚体)类型结构。一些这些 寡核苷酸具有传统的“刺激性”CpG序列以及“GC富集的”或者“B细胞 中和”基序。这些组合基序寡核苷酸具有免疫刺激作用处于传统的B类CpG 寡核苷酸相关的作用(即强力诱导B细胞激活和树突状细胞(DC)激活)与A 类CpG ODN(即强力诱导IFN-α和NK细胞激活，但相对弱诱导B细胞和 DC激活)相关的作用之间。Krieg AM et al.(1995)Nature 374：546-9；Ballas ZK et al.(1996)J Immunol 157：1840-5；Yamamoto S et al.(1992)J Immunol 148：4072-6。
所述C类组合基序免疫刺激性寡核苷酸可具有完全稳定的(如所有硫代 磷酸酯)、嵌合的(磷酸二酯中心区)或者半软(如CpG基序内磷酸二酯)主链。 这个类别已经在2002年8月19日提请的美国专利申请US 10/224,523中描 述。
C类CpG寡核苷酸的一个刺激性结构域或基序由如下化学式定义：5’ X1DCGHX23’。D是除了C之外的核苷酸。C是胞嘧啶。G是鸟嘌呤。H 是除了G之外的核苷酸。X1和X2是0-10个核苷酸长的任何核酸序列。X1可 包括CG，在这种情况中优选T就在这个CG的前面。在一些实施方案中， DCG是TCG。X1优选长度为0-6个核苷酸。在一些实施方案中，X2不含有 任何聚G或聚A基序。在其它实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸在5’ 末端或3’末端具有聚-T序列。如本文所用，“聚-A”或者“聚-T”应是指分 别具有4或更多个连续A或T的一段序列，如5’AAAA 3’或者5’TTTT 3’。 如本文所用，“聚-G末端”应是指在核酸的5’端或3’端具有4或更多个连 续G的一段序列，如5’GGGG 3’。如本文所用，“聚-G寡核苷酸”应是指 具有化学式5’X1X2GGGX3X43’的寡核苷酸，其中X1、X2、X3和X4是核苷 酸，优选X3和X4中至少一个是G。在此化学式基础上设计的一些优选的B 细胞刺激性结构域包含TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、 TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。
C类CpG寡核苷酸的第二个基序被称作P或N，其位于紧邻X1的5’ 端或者紧邻X2的3’端。
N是B细胞中和序列，其以CGG三核苷酸开始，长度为至少10个核 苷酸。B细胞中和基序包括至少一个CpG序列，其中CG前面是C或者后 面是G(Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sd USA 95：12631-12636)或者 CG是含有DNA序列的CG，其中CG的C是甲基化的。当存在于其它非 刺激性基序中时，中和基序或序列具有某些程度的免疫刺激能力，但是当 存在于其它免疫刺激性基序中时，其降低所述其它基序的免疫刺激潜力。
P是GC富集的回文结构，含有至少10个核苷酸长的序列。
如本文所用，“回文结构”和等同的“回文序列”应是指反向重复，即 序列如ABCDEE’D’C’B’A’，其中A和A’、B和B’等是能形成通常的 Watson-Crick碱基对的碱基。
如本文所用，“GC-富集的回文结构”应是指具有至少三分之二G和C 碱基组成的回文结构。在一些实施方案中，GC富集的结构域优选是“B细 胞刺激性结构域”的3’。在10个碱基长的GC富集的回文结构中，所述回 文结构因此含有至少8个G和C。在12个碱基长的GC富集的回文结构的 情况中，所述回文结构也含有至少8个G和C。在14聚体GC富集回文结 构的情况中，所述回文结构的至少10个碱基是G和C。在一些实施方案中， GC富集的回文结构只由G和C组成。
在一些实施方案中，GC富集的回文结构具有至少81％G和C的碱基组 成。在这种10个碱基长的GC富集的回文结构的情况中，所述回文结构因 此只由G和C组成。在这种12个碱基长的GC富集的回文结构的情况中， 优选所述回文结构的至少10个碱基(83％)是G和C。在一些优选的实施方 案中，12个碱基长的GC富集的回文结构只由G和C组成。在14聚体GC 富集的回文结构的情况中，所述回文结构的至少12个碱基(86％)是G和C。 在一些优选的实施方案中，14个碱基长的GC富集的回文结构只由G和C 组成。GC富集的回文结构的C可以是未甲基化的，或者其可以是甲基化的。
通常，这个结构域具有至少3个C和G，优选每种4个，更优选每种5 或更多个。这个结构域中C和G的数目不需要相同。优选C和G如此排列， 以便其能形成自身互补双链体或者回文结构，如CCGCGCGG。其可以由A 或T中断，但优选所述自身互补是至少部分保守的，如在基序 CGACGTTCGTCG或者CGGCGCCGTGCCG中。当互补不是保守的时，优 选非互补碱基对是TG。在优选的实施方案中，存在不超过3个的连续碱基 不是回文的一部分，优选不超过2个，最优选仅是1个。在一些实施方案 中，GC富集的回文结构包括至少一个CGG三联体，至少一个CCG三联体， 或者至少一个CGCG四联体。在其它实施方案中，GC富集的回文结构不 是CCCCCCGGGGGG或GGGGGGCCCCCC、CCCCCGGGGG或 GGGGGCCCCC。
GC富集区域的至少一个G可以用肌苷(I)取代。在一些实施方案中，P 包括一个以上的I。
在某些实施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸具有如下化学式之一：5’ NX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2N3’，5’PX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2P 3’， 5’X1DCGHX2PX33’，5’X1DCGHPX33’，5’DCGHX2PX33’，5’TCGHX2PX3 3’，5’DCGHPX33’或者5’DCGHP 3’。
本发明提供了其它免疫刺激性寡核苷酸，由化学式5’N1PyGN2P 3’定 义。N1是1-6个核苷酸长的任何序列。Py是嘧啶。G是鸟嘌呤。N2是0-30 个核苷酸长的任何序列。P是GC-富集的回文结构，含有至少10个核苷酸 长的序列。
N1和N2可含有50％以上的嘧啶，更优选50％以上的T。N1可包括CG， 在这种情况中优选T紧邻这个CG前面。在一些实施方案中，N1PyG是TCG， 最优选TCGN2，其中N2不是G。
N1PyGN2P可包括一或多个肌苷(I)核苷酸。N1中的C或G均可以由肌 苷置换，但是CpI比IpG优选。对于肌苷取代如IpG，最佳活性可以通过使 用“半软(semi-soft)”或者嵌合主链实现，其中IG或者CI之间的键是磷酸 二酯键。N1可包括至少一个CI、TCI、IG或者TIG基序。
在某些实施方案中，N1PyGN2是选自TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、 TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT和TCGTCGT的序列。
在一个实施方案中，本发明的“C类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序 列：
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：594)，或者
5’TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：595)，或者
5’TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：596)，或者
5’TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：597)，或者
5’TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：598)，或者
5’TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：599)，或者
5’TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：600)，或者
5’TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’(SEQ ID No：601)，或者
5’TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：602)，或者
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：603)，或者
5’TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’(SEQ ID No：604)，或者
5’TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’(SEQ ID No：605)，或者
5’TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’(SEQ ID No：606)。
在任何这些序列中，所有键可以全是硫代磷酸酯键。在另一个实施方 案中，在任何这些序列中，一或多个键可以是磷酸二酯键，优选在CpG基 序的“C”和“G”之间，产生半软CpG寡核苷酸。
C类寡核苷酸的一些非限制性实例包括：
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C*G*T*C G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’，或者
5’T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’，
其中“*”是指硫代磷酸酯键，“_”是指磷酸二酯键。
在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可以取代5’T，举例的卤素取 代包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。
“P类”CpG免疫刺激性寡核苷酸已经在WO2007/095316中描述，通 过其含有双链形成区的事实鉴定，如在5’和3’末端或者在其附近的完整或 不完整的回文结构，使其具有形成更高级别结构如多联体(concatamers)的潜 力。被称作P类寡核苷酸的这些寡核苷酸在一些情况中与C类寡核苷酸相 比具有诱导高得多水平的IFN-α分泌的能力。所述P-类寡核苷酸具有在体 外和/或在体内自发自主装配成多联体的能力。不受这些分子作用方法的任 何特定理论的限制，一个潜在的假说是这个性质使得P类寡核苷酸具有更 高地交联某些免疫细胞内TLR9的能力，诱导与先前所述类别的CpG寡核 苷酸相比不同的免疫激活模式。
在一个实施方案中，用于本发明中的CpG寡核苷酸是P类CpG寡核苷 酸，其含有5’TLR激活结构域及至少两个回文区，一个回文区是长度为至 少6个核苷酸的5’回文区，与长度为至少8个核苷酸的3’回文区直接连接 或者通过间隔基连接，其中所述寡核苷酸包括至少一个YpR二核苷酸。在 一个实施方案中，所述寡核苷酸不是 T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G。在一个实施 方案中，P类CpG寡核苷酸包括至少一个未甲基化CpG二核苷酸。在另一 实施方案中，所述TLR激活结构域是TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、 TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或者TTTT。在再一个实施方案 中，所述TLR激活结构域在5’回文区内。在另一实施方案中，所述TLR 激活结构域紧邻5’回文区的5’端。在再一个实施方案中，所述5’回文区长 度为至少8个核苷酸。在另一实施方案中，所述3’回文区长度为至少10个 核苷酸。在另一实施方案中，所述5’回文区长度为至少10个核苷酸。在再 一个实施方案中，所述3’回文区包括一个未甲基化的CpG二核苷酸。在另 一实施方案中，所述3’回文区包括两个未甲基化的CpG二核苷酸。在另一 实施方案中，所述5’回文区包括一个未甲基化的CpG二核苷酸。在再一个 实施方案中，所述5’回文区包括两个未甲基化的CpG二核苷酸。在另一实 施方案中，所述5’和3’回文区具有至少25的双链体稳定性值。在另一实施 方案中，所述5’和3’回文区具有至少30的双链体稳定性值。在另一实施方 案中，所述5’和3’回文区具有至少35的双链体稳定性值。在另一实施方案 中，所述5’和3’回文区具有至少40的双链体稳定性值。在另一实施方案中， 所述5’和3’回文区具有至少45的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所 述5’和3’回文区具有至少50的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述 5’和3’回文区具有至少55的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述5’ 和3’回文区具有至少60的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述5’ 和3’回文区具有至少65的双链体稳定性值。
在一个实施方案中，所述两个回文区是直接连接的。在另一实施方案 中，所述两个回文区是通过3’-3’键连接的。在另一实施方案中，所述两个 回文区重叠一个核苷酸。在再一个实施方案中，所述两个回文区重叠两个 核苷酸。在另一实施方案中，所述两个回文区不重叠。在另一实施方案中， 所述两个回文区通过间隔基连接。在一个实施方案中，所述间隔基是具有 长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，所述间隔基是具有长度 为1个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，所述间隔基是非核苷酸间隔基。 在一个实施方案中，所述非核苷酸间隔基是D-间隔基。在另一实施方案中， 所述非核苷酸间隔基是接头。在一个实施方案中，所述寡核苷酸具有化学 式5’XP1SP2T 3’，其中X是TLR激活结构域，P1是回文结构，S是间隔基， P2是回文结构，T是长度为0-100个核苷酸的3’尾部。在一个实施方案中， X是TCG、TTCG或TTTCG。在另一实施方案中，T是长度为5-50个核苷 酸。在再一个实施方案中，T是长度为5-10个核苷酸。在一个实施方案中， S是具有长度为1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S是具有长度 为1个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S是非核苷酸间隔基。在一个实 施方案中，所述非核苷酸间隔基是D-间隔基。在另一实施方案中，所述非 核苷酸间隔基是接头。在另一实施方案中，所述寡核苷酸不是反义寡核苷 酸或核酶。在一个实施方案中，P1是A和T富集的。在另一实施方案中， P1包括至少4个T。在另一实施方案中，P2是完整回文结构。在另一实施 方案中，P2是G-C富集的。在再一个实施方案中，P2是CGGCGCX1GCGCCG， 其中X1是T或没有。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。在另 一实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸间键均是硫代磷酸酯键。在另 一实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样键。在另一实施方 案中，所述磷酸二酯样键是磷酸二酯键。在另一实施方案中，亲脂性基团 与所述寡核苷酸缀合。在一个实施方案中，所述亲脂性基团是胆固醇。
在一个实施方案中，用于本发明中的TLR-9激动剂是P类CpG寡核苷 酸，具有5’TLR激活结构域和至少两个含有互补性的区域，即5’和3’含有 互补性的区域，每个含有互补性的区域的长度均为至少8个核苷酸且彼此 直接连接或者通过间隔基连接，其中所述寡核苷酸包括至少一个嘧啶-嘌呤 (YpR)二核苷酸，及其中至少一个含有互补性的区域不是完整回文结构。在 一个实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。 在另一实施方案中，所述TLR激活结构域是TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、 TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或者TTTT。在另一实 施方案中，所述TLR激活结构域在5’含有互补性的区域中。在另一实施方 案中，所述TLR激活结构域紧邻5’含有互补性的区域的5’端。在另一实施 方案中，所述3’含有互补性的区域的长度为至少10个核苷酸。在再一个实 施方案中，所述5’含有互补性的区域的长度为至少10个核苷酸。在一个实 施方案中，所述3’含有互补性的区域包括一个未甲基化的CpG二核苷酸。 在另一实施方案中，所述3’含有互补性的区域包括两个未甲基化的CpG 核苷酸。在再一个实施方案中，所述5’含有互补性的区域包括一个未甲基 化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，所述5’含有互补性的区域包括两 个未甲基化的CpG二核苷酸。在另一实施方案中，所述含有互补性的区域 包括至少一个核苷酸类似物。在另一实施方案中，所述含有互补性的区域 形成分子内双链体。在一个实施方案中，所述分子内双链体包括至少一个 非-Watson Crick碱基对。在另一实施方案中，所述非-Watson Crick碱基对 是G-T、G-A、G-G或者C-A。在一个实施方案中，所述含有互补性的区域 形成分子间双链体。在另一实施方案中，至少一个分子间双链体包括至少 一个非-Watson Crick碱基对。在另一实施方案中，所述非-Watson Crick碱 基对是G-T、G-A、G-G或者C-A。在再一个实施方案中，所述含有互补性 的区域含有一个错配。在又一个实施方案中，所述含有互补性的区域含有 两个错配。在另一实施方案中，所述含有互补性的区域含有间插核苷酸。 在另一实施方案中，所述含有互补性的区域含有两个间插核苷酸。
在一个实施方案中，所述5’和3’含有互补性的区域具有至少25的双链 体稳定性值。在另一实施方案中，所述5’和3’含有互补性的区域具有至少 30的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述5’和3’含有互补性的区域 具有至少35的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有互补性的区 域具有至少40的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有互补性的 区域具有至少45的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有互补性 的区域具有至少50的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有互补 性的区域具有至少55的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有互 补性的区域具有至少60的双链体稳定性值。在另一实施方案中，所述含有 互补性的区域具有至少65的双链体稳定性值。
在另一实施方案中，所述两个含有互补性的区域是直接连接的。在另 一实施方案中，所述两个回文区域通过3’-3’键连接。在另一实施方案中， 所述两个含有互补性的区域重叠一个核苷酸。在另一实施方案中，所述两 个含有互补性的区域重叠两个核苷酸。在另一实施方案中，所述两个含有 互补性的区域不重叠。在另一实施方案中，所述两个含有互补性的区域通 过间隔基连接。在另一实施方案中，所述间隔基是具有长度为1-50个核苷 酸的核酸。在另一实施方案中，所述间隔基是具有长度为1个核苷酸的核 酸。在一个实施方案中，所述间隔基是非核苷酸间隔基。在另一实施方案 中，所述非核苷酸间隔基是D-间隔基。在再一个实施方案中，所述非核苷 酸间隔基是接头。
在一个实施方案中，P类寡核苷酸具有化学式5’XNSPT 3’，其中X是 TLR激活结构域，N是不完整回文结构，P是回文结构，S是间隔基，T是 长度为0-100个核苷酸的3’尾部。在另一实施方案中，X是TCG、TTCG 或者TTTCG。在另一实施方案中，T是长度为5-50个核苷酸。在另一实施 方案中，T是长度为5-10个核苷酸。在另一实施方案中，S是具有长度为 1-50个核苷酸的核酸。在另一实施方案中，S是具有长度为1个核苷酸的核 酸。在另一实施方案中，S是非核苷酸间隔基。在另一实施方案中，所述非 核苷酸间隔基是D-间隔基。在另一实施方案中，所述非核苷酸间隔基是接 头。在另一实施方案中，所述寡核苷酸不是反义寡核苷酸或者核酶。在另 一实施方案中，N是A及T富集的。在另一实施方案中，N包括至少4个 T。在另一实施方案中，P是完整回文结构。在另一实施方案中，P是G-C 富集的。在另一实施方案中，P是CGGCGCX1GCGCCG，其中X1是T或 者没有。在另一实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。 在另一实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在 另一实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯样键。在另一实施 方案中，所述磷酸二酯样键是磷酸二酯键。在另一实施方案中，亲脂性基 团与所述寡核苷酸缀合。在一个实施方案中，所述亲脂性基团是胆固醇。
在一个实施方案中，本发明的“P类”CpG寡核苷酸具有如下核酸序 列：5’TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’(SEQ ID No：607)。
在所述序列中，所有键可以全是硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中， 一或多个键可以是磷酸二酯键，优选在CpG基序的“C”与“G”之间，产 生半软CpG寡核苷酸。在任何这些序列中，乙基-尿苷或者卤素可以取代5’ T；卤素取代的例子包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。
P类寡核苷酸的一个非限制性实例包括：
5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’
其中“*”表示硫代磷酸酯键，“_”表示磷酸二酯键。
在一个实施方案中，本文揭示的CpG寡核苷酸的所有核苷酸间键均是 磷酸二酯键(“软”寡核苷酸，如在PCT申请WO2007/026190中描述)。在 另一个实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸具有降解抗性(例如是稳定化 的)。“稳定化的寡核苷酸”是指对体内降解(例如由外切或者内切核酸酶降 解)相对抗性的寡核苷酸。核酸稳定化可以通过主链修饰实现。具有硫代磷 酸酯键的寡核苷酸提供了最大活性及保护该寡核苷酸免于细胞内外切和内 切核酸酶降解。
所述免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主链，其具有磷酸二酯键和硫代 磷酸酯键的组合。对于本发明，嵌合主链是指部分稳定化的主链，其中至 少一个核苷酸间键是磷酸二酯键或者磷酸二酯样键，及其中至少一个其它 核苷酸间键是稳定化的核苷酸间键，其中至少一个磷酸二酯键或磷酸二酯 样键及至少一个稳定化的键是不同的。当磷酸二酯键优先位于CpG基序内 时，这种分子被称作“半软”的，如PCT申请WO2007/026190所述。
其它修饰的寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基 硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或p-乙氧基键的组合。
由于已经报道了boranophosphonate键相对于磷酸二酯键是稳定的，因 此对于主链的嵌合性质而言，boranophosphonate键根据情况可以分类为磷 酸二酯样键或者稳定的键。例如，在一些实施方案中，本发明的嵌合主链 包括至少一个磷酸二酯键(磷酸二酯键或者磷酸二酯样键)及至少一个 boranophosphonate(稳定的)键。在其它实施方案中，本发明的嵌合主链可包 括boranophosphonate(磷酸二酯键或者磷酸二酯样键)及硫代磷酸酯键(稳定 的)。“稳定的核苷酸间键”应是指与核苷酸间磷酸二酯键相比对于体内降解 (如通过外切或内切核酸酶降解)相对抗性的核苷酸间键。优选的稳定的核苷 酸间键包括但不限于硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键以及 甲基硫代磷酸酯键。其它稳定的核苷酸间键包括但不限于肽、烷基、去磷 酸(dephospho)及如上述其它键。
修饰的主链如硫代磷酸酯可以是使用自动化技术利用氨基磷酸酯或者 H-磷酸酯化学合成的。芳基-和烷基-磷酸酯可以如美国专利4,469,863所述 制备，烷基磷酸三酯(其中带电荷的氧部分是烷化的，如美国专利5,023,243 和欧洲专利092,574所述)可以通过自动固相合成方法使用可商购试剂制备。 本领域已经描述了产生其他DNA主链修饰和取代的方法。Uhlmann E et al. (1990)Chem Rev 90：544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1：165。本领 域也已知制备嵌合寡核苷酸的方法。例如授予Uhlmann等的专利已经描述 了这种技术。
混合主链修饰的ODN可以如PCT申请WO2007/026190所述合成。
本发明的寡核苷酸也可以包括其它修饰。这些修饰包括非离子DNA类 似物，如烷基和芳基磷酸酯(其中带电荷的磷酸酯氧由烷基或芳基置换)，磷 酸二酯和烷基磷酸三酯，其中带电荷的氧部分是烷化的。在一端或者两个 末端含有二醇如四甘醇(tetraethyleneglycol)或者六甘醇(hexaethyleneglycol) 的核酸也已经示出是基本上对核酸酶降解具有抗性的。
所述CpG寡核苷酸的大小(即沿着寡核苷酸长度的核苷酸数目)也可能 有助于所述寡核苷酸的刺激活性。为了促进吸收进细胞中，本发明的CpG 寡核苷酸优选具有6个核苷酸残基的最小长度。如果存在足够的免疫刺激 性基序，任何大小超过6个核苷酸(甚至为很多kb长)的寡核苷酸均能诱导 免疫应答，因为较大的寡核苷酸在细胞内部被降解。在某些实施方案中， 所述CpG寡核苷酸为6-100个核苷酸长，优选8-30个核苷酸长。在重要的 实施方案中，本发明的核酸和寡核苷酸不是质粒或表达载体。
在一个实施方案中，本文揭示的CpG寡核苷酸包含取代或修饰，如在 WO2007/026190中第134-147段描述的碱基和/或糖中。
在一个实施方案中，本发明的CpG寡核苷酸是化学修饰的。化学修饰 的例子为本领域技术人员已知，在例如Uhlmann E.et al.(1990)，Chem.Rev. 90：543，S.Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke，S.T.et al. (1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129及Hunziker J.et al.，(1995)， Mod.Synth.Methods 7：331-417中描述。本发明的寡核苷酸可具有一或多个 修饰，其中与由天然DNA或RNA组成的相同序列的寡核苷酸相比，每个 修饰均位于特定的核苷间磷酸二酯键和/或位于特定的β-D-核糖单位和/或 位于特定的天然核苷碱基位置。
在本发明的一些实施方案中，可以根据本领域技术人员已知的方法将 含有CpG的核酸简单地与免疫原性载体混合(见例如WO03/024480)。
在本发明的特定实施方案中，本文揭示的任何疫苗均包含20μg-20mg 的CpG寡核苷酸，优选0.1mg-10mg CpG寡核苷酸，优选0.2mg-5mg CpG 寡核苷酸，优选0.3mg-3mg CpG寡核苷酸，更优选0.4-2mg CpG寡核苷 酸，更优选0.5-1.5mg CpG寡核苷酸。在优选的实施方案中，本文揭示的 任何疫苗均包含大约0.5-1mg CpG寡核苷酸。
用于本发明中的优选佐剂是明矾、QS21、CpG ODN、明矾组合CpG ODN、Iscomatrix及Iscomatrix组合CpG ODN。
本发明的药物组合物
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗原性PCSK9肽或者其 免疫原性组合物，与一或多种药物可接受的赋形剂及任选地组合一或多种 佐剂(如上述佐剂)一起配制。如本文所用，术语“赋形剂”描述了除了活性 成分即本发明的最终偶联免疫原性载体及任选组合一或多种佐剂的抗原性 PCSK9肽之外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上依赖于如特定施用 方式、赋形剂对于溶解性和稳定性的作用以及剂型性质等因素。如本文所 用，“药物可接受的赋形剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌 剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其是生理学相容的。一些药物可接 受的赋形剂的实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等， 以及其组合。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元 醇如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。药物可接受物质的其它实例是增湿剂或 者微量辅助物质如增湿剂或乳化剂、防腐剂或者缓冲剂，其增强所述活性 成分的贮存期或者效力。
本发明的药物组合物和制备其的方法为本领域技术人员显而易见。这 种组合物和制备其的方法可见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences， 19th Edition(Mack Publishing Company，1995)。药物组合物优选在GMP条 件下生产。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或者多个单一单位剂量形 式大批量制备、包装或者销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量 活性成分的药物组合物的个别量。所述活性成分的量通常等于施用给对象 的活性成分的剂量或者这种剂量的方便分数，例如这种剂量的一半或1/3。
本领域接受的施用肽或蛋白质的任何方法均可适用于本发明的肽或蛋 白质。
本发明的药物组合物典型适于肠胃外施用。如本文所用，药物组合物 的“肠胃外施用”包括特征在于物理性裂开(physical breaching)对象组织并 且通过组织裂口施用所述药物组合物的任何施用途径，因此通常导致直接 施用进入血流中、进入肌肉中或者进入内脏器官中。肠胃外施用因此包括 但不限于通过注射所述组合物施用药物组合物、通过手术切口应用所述组 合物、通过组织穿透非手术创口应用所述组合物等。特别地，肠胃外施用 包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心 室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或者输注；以及肾透析灌注技术。优选 的实施方案包括静脉内、皮下、皮内和肌内途径，更优选的实施方案是肌 内或皮下途径。
适于肠胃外施用的药物组合物的配制典型通常包含所述活性成分组合 药物可接受的载体，如无菌水或无菌等渗盐水。这种配制物可以适于推注 施用或者连续施用的形式制备、包装或者销售。注射用配制物可以单位剂 量形式如在含有防腐剂的安瓿或在多剂量容器中制备、包装或销售。肠胃 外施用的配制物包括但不限于悬浮液、溶液、在油或水性载体中的乳状液、 糊剂等。这种配制物可进一步包含一或多种其它成分，包括但不限于悬浮 剂、稳定剂或者分散剂。
在肠胃外施用的配制物的一个实施方案中，所述活性成分以干燥形式 提供(即粉末或颗粒)，在肠胃外施用之前用合适的载体(如无菌无热原水)重 建之后肠胃外施用所述重建的组合物。肠胃外施用的配制物也包括水溶液， 其可含有赋形剂如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3-9)，但是对于一 些应用而言，其可以更适当地配制为无菌非水溶液或者干燥形式，与合适 的载体如无菌无热原水联合使用。举例的肠胃外施用形式包括在无菌水溶 液中的溶液或者悬浮液，如在丙二醇水溶液或者葡萄糖水溶液中。如果需 要，这种剂量形式可适当地被缓冲。其它有用的可肠胃外施用的配制物包 括以微晶体形式、微粒或者在脂质体制备物中包含活性成分的那些。肠胃 外施用的配制物可以配制成立即和/或修饰的释放形式。修饰释放的配制物 包括缓释、持续、脉冲、控制、靶向以及程序化释放。
例如，一方面，无菌注射溶液可以通过将抗-PCSK9肽以需要量掺入在 具有上述成分之一或组合的合适的溶剂中、随后通过过滤灭菌而制备，所 述肽优选偶联免疫原性载体，任选地组合一或多种佐剂。通常，通过将所 述活性化合物掺入无菌载体中制备分散剂，所述无菌载体含有基本分散介 质和上述需要的其它成分。在制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优 选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其预先灭 菌过滤的溶液的任何另外的希望成分的粉末。可以通过例如使用包衣如卵 磷脂、通过在分散情况中维持需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂而 保持溶液的适当流动性。注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中 包含延迟吸收的物质如单硬脂酸盐和凝胶而实现。
一个举例的非限制性的本发明药物组合物是这样的配制物，其是无菌 水溶液，pH范围在大约5.0-6.5，包含大约0.1mg/mL至大约20mg/mL本 发明的肽、大约1毫摩尔至大约100毫摩尔的组氨酸缓冲液，大约0.01 mg/mL至大约10mg/mL聚山梨酯80、大约100毫摩尔至大约400毫摩尔 海藻糖，以及大约0.01毫摩尔至大约1.0毫摩尔的EDTA二钠二水合物。
本发明的抗原性PCSK9肽也可以通过鼻内或者通过吸入施用，典型是 置于干粉吸入器中的干粉形式(单独或者是混合物，或者是混合成分颗粒， 例如与合适的药物可接受的赋形剂混合)，或者是置于气压式容器、泵、喷 雾(spray)、喷雾器(atomiser)(优选使用电流体力学产生细雾的喷雾器)或 者雾化器中气雾喷雾剂形式，使用或不使用合适的推进剂，或者作为滴鼻 剂形式。
所述气压式容器、泵、喷雾、喷雾器或者雾化器通常含有本发明抗体 的溶液或悬浮液，包含例如适于分散、溶解或者延长活性成分释放的物质， 推进剂作为溶剂。
在干粉或悬浮液配制物使用之前，所述药物通常被微粉化为适合通过 吸入输送的大小(典型低于5微米)。这可以通过任何适当的粉碎方法如螺旋 喷射研磨、流化床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均质 或者喷雾干燥实现。
用于吸入器或者吹药器中的胶囊、泡罩(blister)和药筒(cartridge)可以配 制成含有本发明化合物、合适的粉末基质及性能修饰物的粉末混合物。
用于使用电流体力学产生细雾的喷雾器中的合适的溶液配制物可每活 化容积(actuation volume)含有合适剂量的本发明抗原性PCSK9肽，所述活 化容积可例如是1μL-100μL。
可以在用于吸入和/鼻内施用的本发明的这些配制物中加入合适的调味 剂如薄荷脑和左薄荷脑或者甜味剂如糖精或糖精钠。
用于吸入/鼻内施用的配制物可以配制成立即和/或修饰释放形式。修饰 释放的配制物包括缓释、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程 序化释放。
在干粉吸入和气雾剂的情况中，剂量单位通过计量输送的阀门确定。 本发明的剂量单位典型计划为计量施用或者“吹入”本发明的抗体。全部 的每日剂量典型以全天单一剂量或者通常以多次分开剂量施用。
包含抗原性PCSK9肽的药物组合物也可以配制为口服途径施用。口服 可包括吞咽，由此所述化合物进入胃肠道，和/或经口腔、舌或舌下施用， 由此所述化合物直接从口进入血流。
适于口服施用的配制物包括固体、半固体和液体系统，如片剂；含有 多粒子或纳米粒子、液体或粉末的软胶囊或硬胶囊；锭剂(包括充填液体的 锭剂)；咀嚼片；凝胶；快速分散剂型；膜；珠(ovule)；气雾剂；以及口 腔/粘膜粘着片剂。
液体配制物包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这种配制物可用作软胶 囊或硬胶囊(由例如明胶或者羟丙基甲基纤维素制成)中的充填物，及典型包 含载体如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素，或者合适的油，及 一或多种乳化剂和/或悬浮剂。液体配制物也可以通过例如从囊剂重建固体 而制备。
本发明的组合物可用于处于PCSK9-介导的疾病或症状风险或患有这 种疾病或症状的对象中治疗、减轻或预防这种疾病或症状，通过免疫治疗 刺激所述对象的免疫应答而进行。免疫治疗可包括初始免疫及随后另外的 如1、2、3或多次加强免疫。
本发明的抗原性PCSK9肽或其组合物的“免疫学有效量”是以单一剂 量或一系列的一部分输送给哺乳动物对象的量，其在所述对象体内有效诱 导针对PCSK9的免疫应答。这个量根据治疗个体的健康和生理状况、治疗 个体的分类群、个体免疫系统合成抗体的能力、疫苗的配制及其它相关因 素而改变。预期所述量在可以通过常规实验确定的相对广泛的范围内。
“药物有效剂量”或者“治疗有效剂量”是治疗或预防或减轻对象的 一或多种PCSK9-相关疾病或症状需要的剂量。所述药物有效剂量依赖于施 用的特定化合物、症状的严重性、对象对于副作用的易感性、疾病的类型、 使用的组合物、施用途径、治疗的哺乳动物类型、特定哺乳动物的生理特 性如健康和生理状况、同时服药情况、个体免疫系统合成抗体的能力、希 望的保护作用程度以及本领域技术人员已知的其它因素。出于预防目的， 选择的每个剂量中肽的量是在典型的疫苗接种个体中诱导免疫保护性应答 且无明显不利副作用的量。在最初的免疫接种之后，所述对象可以接受一 或多次足够间隔时间的加强免疫。
应理解对于任何特定患者的特定剂量水平根据各种因素确定，包括应 用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用 时间、施用途径及排泄率，药物组合及进行治疗的特定疾病的严重性。
例如，本发明的抗原性PCSK9肽或者药物组合物可以以如下剂量施用 给对象：大约0.1μg至大约5mg，如大约0.1μg至大约5μg，大约5μg至大 约10μg，大约10μg至大约25μg，大约25μg至大约50μg，大约50μg至大 约100μg，大约100μg至大约500μg，大约500μg至大约1mg，大约1mg 至大约2mg，任选地加强剂量在例如1周、2周、3周、4周、2个月、3 个月、6个月和/或1年之后。
在一些实施方案中，施用单一剂量的本发明的抗原性PCSK9肽或者药 物组合物。在其它实施方案中，施用多剂量的本发明抗原性PCSK9肽或者 药物组合物。施用频率可以根据许多因素改变，如症状的严重性、希望的 免疫保护作用的程度等，无论所述组合物是用于预防还是治疗目的。例如， 在一些实施方案中，本发明的抗原性PCSK9肽或者药物组合物每月施用1 次，每月2次，每月3次，隔周1次(qow)，1周1次(qw)，1周2次(biw)， 1周3次(tiw)，1周4次，1周5次，1周6次，隔天1次(qod)，每日一次 (qd)，1日2次(qid)或者1日3次(tid)。当本发明的组合物用于预防目的时， 通常施用激发剂量和加强剂量。预期加强剂量以间隔足够时间间隔给予， 或者优选每年给予一次或者在循环抗体水平低于希望水平时给予。加强剂 量可以由所述抗原性PCSK9肽在不存在原始免疫原性载体分子的条件下组 成。这种加强构建体可包含另一种免疫原性载体或者不含任何载体。这种 加强组合物可以与佐剂一起配制或者不含佐剂。
本发明的抗原性PCSK9肽的施用持续时间，即施用抗原性PCSK9肽 的时间可以根据许多因素如患者反应等任何因素改变。例如，抗原性PCSK9 肽可以施用大约1天至大约1周，大约2周至大约4周，大约1个月至大 约2个月，大约2个月至大约4个月，大约4个月至大约6个月，大约6 个月至大约8个月，大约8个月至大约1年，大约1年至大约2年，或者 大约2年至大约4年或更长时间。
本发明还涵盖了许多治疗方法，所述方法包括施用本发明的抗原性 PCSK9肽。主题治疗方法包括在个体内诱导对自身-PCSK9免疫应答的方 法，以及预防、减轻或治疗个体内PCSK9-相关疾病或症状的方法。
一方面，本发明提供了治疗、预防或减轻对象中PCSK9相关疾病或症 状方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的抗原性PCSK9肽或者 其免疫原性组合物或药物组合物。
另一方面，本发明提供了在对象体内诱导针对自身PCSK9免疫应答的 方法，包括给所述对象施用治疗或免疫学有效量的本发明的抗原性PCSK9 肽或者其免疫原性组合物或药物组合物。
PCSK9相关疾病或者PCSK9介导的疾病是例如其中PCSK9活性被抑 制或者PCSK9与LDL受体相互作用被抑制是有益的疾病。
“治疗”是指减轻或消除一种生物学疾病和/或至少一种其伴随症状的 方法。如本文所用，“减轻”疾病、失调或病症是指降低疾病、失调或病症 症状的严重性和/或发生频率。进一步地，本文提及“治疗”时包括治疗性、 缓解性及预防性治疗。所述对象可以是任何年龄的人，可以是男性或女性。
本发明的其它方面涉及本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合 物或药物组合物用作药物，优选治疗、减轻或预防PCSK9相关疾病。
再一方面，本发明提供了本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组 合物或药物组合物在生产药物、优选治疗PCSK9相关疾病的药物中的应用。
特别地，本发明涉及本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物 或者药物组合物用作药物，优选治疗、减轻或预防胆固醇水平增高相关疾 病。
再一方面，本发明提供了本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组 合物或药物组合物在生产药物、优选降低需要其的对象的血液中LDL-胆固 醇水平的药物中的应用。
在本发明的应用或方法的一些方面中，所述PCSK9-相关疾病选自胆固 醇增高，与LD-L-胆固醇增高相关的病症，如脂质失调(如高脂血症，I、II、 III、IV或V型高脂血症，继发高甘油三酯血症，高胆固醇血症，家族性高 胆固醇血症，黄瘤病，胆固醇乙酰转移酶缺陷)，动脉硬化性病症(如动脉硬 化)，冠心病及心血管疾病。
再一方面，本发明提供了本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组 合物或者药物组合物在生产治疗或减轻疾病的药物中的应用，所述疾病是 LDL受体的上调或者PCSK9与LDL受体之间的相互作用被抑制是有益的 疾病。
再一方面，本发明提供了本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组 合物或者药物组合物在生产治疗阿尔兹海默病的药物中应用。
在本发明的应用或方法的其他方面，所述对象是哺乳动物，优选人。
在本发明的应用或方法的其他方面，所述对象患有所述PSCK9-相关疾 病。或者，所述对象处于患有所述PCSK9-相关疾病的风险中，如由于存在 一或多种风险因素(如高血压、吸烟、糖尿病、肥胖或者高同型半胱氨酸血 症)。
本发明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或药物组合物可用于 不耐受另一种降低胆固醇药剂治疗的对象，或者用于另一种降低胆固醇药 剂治疗结果不足的对象(如经历抑制素治疗而LDL-c降低不足的对象)。本文 描述的本发明的抗原性PCSK9肽可以施用给LDL-胆固醇增加的对象。
优选胆固醇增加的对象是人，其总血浆胆固醇水平为200mg/dl或更高。 优选胆固醇增加的对象是人，其LDL-胆固醇水平为160mg/dl或更高。
使用标准方法对在合适禁食后获得的血液样品测量总血浆胆固醇水平 和LDL-胆固醇水平。测量总血浆胆固醇水平和LDL-胆固醇水平的方案为 本领域技术人员熟知。
在一个实施方案中，所述抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或者 药物组合物与另一药物一起施用，两者可以以一定顺序相继施用或者同时 施用。在一些实施方案中，抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或者药 物组合物施用给也接受另一种药物(如另一种降低胆固醇药物)治疗的对象。 降低胆固醇的药物包括他汀类药物、胆酸螯合剂、烟酸、纤维酸衍生物， 及长链α、ω-二羧酸。他汀类药物通过阻断HMGCoA而抑制胆固醇合成， HMGCoA是胆固醇生物合成中的关键酶。举例的他汀类药物是洛伐他汀、 普伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀和辛伐他汀。胆酸螯合剂 中断胆汁酸从肠至肝的再循环。这些药物的例子是考来烯胺(cholestyramine) 和考来替泊(colestipol)氢氯化物。纤维酸衍生物的例子是氯贝丁酯 (clofibrate)和吉非贝齐(gemfibrozil)。长链α、ω-二羧酸在例如Bisgaier et al.，1998，J.Lipid Res.39：17-30；WO 98/30530；美国专利4,689,344；WO 99/00116；美国专利5,756,344；美国专利3,773,946；美国专利4,689,344；美国专 利4,689,344；美国专利4,689,344；和美国专利3,930,024)中描述；醚(见例如 美国专利4,711,896；美国专利5,756,544；美国专利6,506,799)。多萜醇的磷酸 酯(美国专利4,613,593)及azolidinedione衍生物(美国专利4,287,200)也可用 于降低胆固醇水平。组合治疗方案可以是加合的，或者其可以产生协同结 果(如胆固醇降低高于组合使用这两种药物的预期水平)。在一些实施方案 中，抗原性PCSK9肽或者其免疫原性组合物或者药物组合物与他汀类药物 的组合治疗产生协同结果(如胆固醇协同降低)。在一些对象中，这可以减少 他汀类药物剂量以达到希望的胆固醇水平。
实施例
提出如下实施例用以为本领域技术人员提供关于怎样准备和实施本发 明的全部揭示和描述，但是所述实施例不意图限制本发明的范围，也不代 表下文的实验是所有实验或仅进行如下实验。已经进行尝试保证使用数目 的精确性(例如量、温度等)，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非特别 指出，部分是指重量部分，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压 力是在大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，如bp，碱基对；kb，千 碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸； kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c， 皮下等。
实施例1：在LDL受体界面的PCSK9-EGF-A结构域选择抗原性PCSK9肽
结合LDL受体的EGF-A结构域的人PCSK9的结构已经揭示及公开 (Kwon et al，PNAS 105，1820-1825，2008)。这种结构信息(PDB:3BPS)与来自 游离PCSK9的结构PDB:2P4E的信息(Cunningham et al，Nature Structural & Molecular Biology，14，413-419，2007)一起使用以设计如下肽，其相应于对于 PCSK9-LDL受体相互作用重要的区域(见图1)。
肽1.ASSDCSTCFV(SEQ ID No：19)
肽2.GTRFHRQASK(SEQ ID No：63)
肽3.IQSDHREIEGRV(SEQ ID No：109)
肽4.SGRDAGVAKGA(SEQ ID No：153)
肽5.SIPWNLERITP(SEQ ID No：184)
由于肽1-4在PCSK9结构中呈现环状，因此制备各个序列(SEQ ID No： 19、63、109和153)加入Cys、Cys-Gly或Lys接头以使得通过两个末端与 VLP载体偶联，提供天然环状结构的构象模拟物(表1中VR_9.1至VR_9.4)。 此外，也制备环化形式的肽2-4(表1中VR_9.6至VR_9.9)，提供Cys残基 以与VLP偶联。所制备的肽1具有用于缀合目的的Lys-Gly-Gly N末端接 头，以便两个Cys残基自由形成二硫键，就像它们在天然PCSK9结构中那 样。肽5表示人PCSK9的N末端成熟加工形式，其通过C末端添加的半 胱氨酸残基偶联，以使得N末端是自由的以用于抗体识别(表1中VR_9.5)。 下表(表1)描述了对作为疫苗候选物进行评估产生的9种肽。
表1.肽序列
下划线表示用于缀合目的的半胱氨酸残基，双下划线表示GC或KGG接头。
实施例2：制备肽-VLP缀合物以作为疫苗候选物进行评估
使用标准Fmoc方案在CLEAR酰胺树脂上合成所述肽。使用5倍过量 的经1eq的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯)激活 的Fmoc-保护的氨基酸在存在HOBt(羟基苯并三唑)和NMM(N-甲基吗啉) 条件下进行氨基酸偶联反应。Fmoc基团的去保护通过使用20％哌啶/DMF 实现。然后切下与树脂结合的肽，同时用试剂D(TFA/H2O/DODT：89/3/8) 除去侧链保护基团。所述肽被制备成游离N末端及酰胺化的C末端。使用 BEH 130C18柱及水/乙腈梯度在存在0.1％TFA条件下，通过HPLC对粗制 的肽进行纯化至均质。纯化的肽使用冻干仪真空干燥。使用质谱(LC-MS) 分析所述肽并提供满意数据。
这项研究中使用的QβVLP通过大肠杆菌BL21(DE3)菌株发酵产生，所 述菌株掺入编码如下14kD单体蛋白质的pET28质粒： MAKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRV TVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFT QYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY(Genbank ID：99039)。所 述发酵是在OD600为0.8时用IPTG诱导的，使其在具有卡那霉素的terrific broth(TB)中发酵过夜。所述VLP在宿主细胞中自主装配，将其从发酵细胞 沉淀中纯化，使用除了下述不同之外的如专利申请EP1736538中描述的方 法进行：在细胞破坏之后，将澄清的匀浆用硫酸铵在50％饱和度处理，通 过离心回收细胞沉淀。然后，将所述沉淀再溶解于HEPES缓冲液中，用 HEPES缓冲液透析，之后进行所述公开方法中的第一个柱步骤。在离子交 换柱和羟磷灰石柱步骤之后，使用进一步的阴离子交换柱步骤纯化所述材 料，并灭菌过滤以产生最终的VLP整批材料，将其通过大小排阻层析、 SDS-PAGE及电子显微镜分析，获得可接受的结果。
肽通过半胱氨酸残基的缀合
QβVLP通过使用N-γ-马来酰亚胺-丁酰氧-琥珀酰亚胺酯(GMBS)或者 更长的琥珀酰亚胺-6-[β-马来酰亚胺丙酰胺]己酸酯(Succinimidyl-6-[β- maleimidopropionamido]hexanoate)连接试剂激活。这两种试剂的使用程序 相似：将固体试剂溶解于二甲亚砜(DMSO)中，以≥10倍摩尔过量加入VLP 溶液中。使激活反应进行≥90分钟，然后将该溶液使用NAP-25脱盐柱在 具有5mM EDTA的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水(DPBS)或者已经加入固体 NaCl(14.6g/L)修饰的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中脱盐。如果需要， 将该蛋白质溶液使用10kD旋转微型浓缩仪略加浓缩，之后进行接下来的缀 合反应。
在缀合反应之前，将所述肽溶解于等份的pH 7.4DPBS中，其中5mM EDTA作为添加剂。溶液中所述肽的浓度为10mg/ml。将溶解的肽加入等份 的TCEP固定的还原剂(Pierce Chemical)中，其已经在含有5mM EDTA的 DPBS中洗涤。将所述肽等份在存在TCEP凝胶条件下混合保温大约1小时， 之后将该等份在微离心机中旋转，弃去固体沉淀。将含有还原的肽的上清 直接加入提前制备的激活的VLP中。然而该程序的另一方法是将固体肽直 接加入激活的QβVLP样品中。这两种方法等同地产生肽-VLP缀合物。
使所述VLP与还原的肽之间的反应进行至少30分钟，伴随非常温和的 混合。在反应时间结束时，将每种样品使用NAP-10或NAP-25脱盐柱(GE Healthcare)在Dulbeccos PBS(DPBS)中脱盐。使用Bradford(考马斯亮蓝， Pierce Chemical Co)测定或BCA蛋白质测定(双金鸡宁酸(bicinchoninic acid)) (Pierce Chemical Co)以及通过SDS-PAGE及大小排阻层析分析所述脱盐的 缀合肽的蛋白质含量。将缀合产物使用0.22μm滤膜灭菌过滤，在2-8℃贮 存直至使用。在贮存期间小心处置这些样品以防止冷冻或暴露于极端温度。
PCSK9肽与CRM197的缀合通过使用BAANS(溴乙酸N-羟基琥珀酰亚 胺酯，Sigma B8271)进行。首先将CRM197通过与在0.1M碳酸钠pH 8.3 中的BAANS以摩尔比率为100在冷藏室中反应90分钟而激活。将该反应 混合物经过Zeba脱盐柱，收集流出液。将10mg/ml的PCSK9肽与等体积 的固定的TCEP还原凝胶(Thermo Scientific)一起在室温保温1小时，在经过 0.2μm滤膜离心后收集。然后将激活的CRM197与处理的肽在冷藏室中混 合过夜，随后在PBS缓冲液中充分透析。回收缀合物，浓缩并通过0.22μm 滤膜灭菌。蛋白质浓度通过使用考马斯蓝测定法(Thermo Scientific)确定。
通过胺进行的肽缀合
对于肽通过胺残基与Qβ的缀合，特别是肽VR_9.1，使用如下程序。 首先通过加入相对于VLP单体≥10倍摩尔过量的固体琥珀酸酐使Qβ衍生 化。使所述琥珀酸酐溶解，衍生化反应进行至少30分钟。在此时间之后， 将样品使用NAP-25脱盐柱在具有5mM EDTA的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐 水(DPBS)中脱盐。然后，以列出的顺序加入相对于VLP单体≥10倍摩尔过 量的如下试剂：固体肽，N-羟基硫代琥珀酰亚胺及最后的1-乙基-3-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亚胺。在按上述顺序加入试剂之后，将样品在室温保温， 使反应进行至少30分钟，之后将VLP-肽缀合物使用NAP-25脱盐柱在 Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中脱盐。
VLP-肽样品的缀合程度使用SDS-PAGE测量，观测到所有样品的分子 量均增加，这与将所述肽加入VLP蛋白质单体中的结果一致。此外，在HPLC 大小排阻层析测定中检测样品(使用Tosoh PWXL5000HPLC柱)，发现当与 未缀合的VLP样品相比时含有装配的VLP。VLP-肽缀合特征在表2中示出。
表2：VLP-肽缀合物
*通过SDS-PAGE及密度计量学计算确定。
实施例3：PCSK9肽免疫原性
这项研究目的在于评估与Qbeta VLP缀合的肽(如实施例2详述)在诱导 可结合人和小鼠PCSK9的抗体应答中的效力如何。将雌性Balb/c小鼠(6-8 周龄)通过肌肉途径(将50μl体积注射进每个胫骨前肌中)在第0、21和42 天注射VLP-肽缀合物，所述缀合物配制在具有化学式为5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’的CpG的明矾中。将一组对照小鼠用与 对照(非-PCSK9)肽偶联的VLP根据相同方案免疫，第二个对照组不进行免 疫。在第49天进行尸检。在尸检时，从麻醉的小鼠中使用抗凝剂通过心脏 穿刺取400-600μl血液。离心血液以分离血浆，将其冷冻贮存直至检测。
使用方法比色ELISA方法测量针对全长人重组PCSK9蛋白的IgG抗体 应答。制备血清样品的系列稀释液，在所述测定中检测。
人PCSK9ELISA方法1：将384-孔高结合测定平板(Corning International Cat#3700)用25μL/孔经0.01M PBS pH 7.4稀释为1μg/mL的人 PCSK9蛋白质原液包被，在室温振荡混合器上保温3小时。在用PBS pH 7.4 洗涤2次之后，将平板用80μL/孔的0.01M PBS/1％BSA封闭，在室温保温 1小时，之后用0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20最后洗涤3次。第二天， 从1∶25稀释(PBS/1％BSA稀释剂)开始制备每个样品的8点1/2(8point1/2)log 系列稀释液，然后将25μL/孔的系列稀释液一式两份转移进人PCSK9包被 的平板中，在室温振荡保温1.5小时。在用0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20 洗涤3次之后，加入25μL/孔的用0.01M PBS pH 7.4/1％BSA以1∶6000稀释 的总IgG检测抗体(兔抗小鼠IgG-Fc，Cat#A90-130ABethyl Laboratories)，然 后在室温振荡保温1小时。在用0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20洗涤5 次之后，加入25μL/孔用0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20pH 7.4以1∶3000 稀释的Bio-Rad试剂盒山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合物(Bio-Rad Cat#172 -1019)，然后在室温振荡保温1小时。在用0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20 洗涤4次及仅用0.01M PBS pH 7.4洗涤1次之后，加入25μL/孔的小鼠Typer HRP底物(Bio-Rad Cat#172-1064)，将该平板在室温保温30分钟。加入25μL/ 孔的2％草酸，然后在Abs 405nm读取吸光度。
小鼠PCSK9ELISA方法1：将Thermo Immunolon 4HBX 96-孔ELISA 平板用100μl在PBS中的1μg/ml重组小鼠PCSK9在4℃包被过夜。在洗 涤后，将平板用300ml PBS/0.5％BSA(Sigma A7030)封闭1小时，用300μl PBS/0.01％Tween-20洗涤4次，加入100μl血浆样品的系列稀释液(在 PBS/0.5％BSA)中。在室温轻轻振荡保温1小时后，将平板用300μl PBS/0.01％Tween-20洗涤4次，在每个孔中加入100μl的1∶5000稀释的山 羊抗小鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶，Pierce 31430)。将平板在室温轻轻振 荡保温45分钟，然后用300μl PBS/0.01％Tween-20洗涤7次。加入100μl TMB底物(Sigma T-4444)，在4分钟后通过加入2N硫酸结束生色反应，在 450nm读取吸光度。
数据分析：绘制每个检测样品的滴定曲线(样品稀释度比吸光度)。然后 取样品效价(随后转变为效价倒数(reciprocal titer))作为实现光密度(O.D.)截 断值为1.0或0.5的血清稀释度。
血浆/血清胆固醇水平的测量
血浆和血清样品中的胆固醇水平使用WAKO胆固醇E测定试剂盒(Cat# 439-17501)根据厂商指导进行测量。将胆固醇标准或检测血浆/血清样品(4μl 体积)稀释液加入96孔平板的孔中，加入196μl制备的胆固醇试剂。将该平 板在37℃保温5分钟，在30分钟内在600nm读取产生的颜色的吸光度。
PCSK9与LDL受体的细胞外结构域之间相互作用的测量
使用荧光团标记的LDLR胞外结构域(LDLR-ECD)及全长野生型 PCSK9蛋白通过TR-FRET测定(时间分辨荧光共振能量转移测定)确定小鼠 血浆对LDLR与PCSK9结合的中断。根据厂商指导将LDLR-ECD(R&D system，cat#2148-LD/CF))用铕(GE healthcare，Cat#PA99148)标记(Eu∶LDLR 摩尔比率为6∶1)。将PCSK9用Biotin-XX-SSE(Pierce，cat#21237)生物素酰 化，生物素∶PCSK9摩尔比率为8。使用在20μl测定缓冲液(20mM Hepes， pH7.0，150mM NaCl，0.1mM CaCl2和0.05％(w/v)BSA)中的5nM LDLR-Eu+3、30nM PCSK9-生物素和50nM Alexa Fluor 647缀合的链霉抗生 物素蛋白(SA647，Invitrogen，cat#S21374)在384孔避光平板(Corning，Cat# 3676)中进行TR-FRET测定。将小鼠血浆的系列稀释液与PCSK9-生物素在 恒湿箱中在室温预保温30分钟，随后与LDLR和链霉抗生物素蛋白-SA647 混合。在黑暗环境中、湿润气氛下在室温另外保温60分钟之后，在Perkin Elmer Victor2平板读取器上读取平板，使用50μs延迟时间和400μs窗口。 数据报告为在(665nm/615nM)x1000的信号比率。
结果：如图2所示，所有用作免疫原的肽均能诱导针对完整的全长人 PCSK9蛋白质的抗体应答，一些肽较其它肽诱导更高的应答。在所有情况 中，这些应答与小鼠PCSK9交叉反应，如图3所示。图4示出肽VR_9.5 免疫也导致血浆胆固醇水平降低，图5和6示出VR_9.5和VR_9.6诱导的 血清抗体应答可抑制PCSK9与LDL受体之间相互作用，使用荧光共振能 量转移(FRET)测定进行。
实施例4：相应于与PDB:3BPS中存在的受体EGF-A结构域不同的区域的 肽的设计
LDL受体是多结构域蛋白，其胞外结构域由一个N末端配体结合结构 域、三个EGF样重复(EGF-A是其中一个)、一个β-螺旋桨结构域和一个“O 连接的糖结构域”组成(Kwon et al，PNAS 105，1820-1825，2008)。PDB文件 3GCX详细描述了PCSK9与LDL受体的仅EGF-A结构域的可溶形式复合 的结构，因此我们假设在PCSK9与LDL受体之间可能存在进一步的不明 显的相互作用，其不能从对PDB:3GCX中呈现的分子的直接分析中推断。 这些区域的实例在图7中详细描述，特别鉴别了PCSK9中两个序列，它们 可以作为额外的推定受体界面(NAQDQPVTLGTL和INEAWFPEDQRVL- 见图8)。
SIPWNLERIIP(SEQ ID No：332)(小鼠)
NAQDQPVTLGTL(SEQ ID No：227)
INEAWFPEDQRVL(SEQ ID No：263)
INMAWFPEDQQVL(SEQ ID No：360)(小鼠)
通过使用在公共数据库中发现的鼠PCSK9序列，也鉴别了鼠同系物(如 表3所示)。我们也假设肽VR_9.5(在实施例1中描述)中含有的一部分氨基 酸序列也可能与在PDB:3BPS中未见到的LDL受体部分相互作用(图8)。 这个概念通过改变氨基酸接头和缀合方向对序列VR_9.5进行调节(refining) 而探查。我们也鉴别了相应于VR_9.5的小鼠同系物的肽(肽VR_9.10)。从 上述方法中获得的系列肽序列通过加入氨基酸而修饰以允许化学缀合，并 且对其作为疫苗候选物进行了评估(肽在表3中详述)。
表3-肽序列
肽 序列 物种 SEQ ID No VR_9.10 SIPWNLERIIPC 小鼠 322 VR_9.11 CGGSIPWNLERIIP 小鼠 323 VR_9.12 SIPWNLERIIPGGC 小鼠 324 VR_9.13 CGGNAQDQPVTLGTL 小鼠&人 325 VR_9.14 NAQDQPVTLGTLGGC 小鼠&人 326 VR_9.15 CGGINMAWFPEDQQVL 小鼠 327 VR_9.16 INMAWFPEDQQVLGGC 小鼠 328
下划线处残基表示为了缀合目的加入的氨基酸。
实施例5
如实施例2所述将肽VR_9.10至VR_9.16(以及为了进行对比的VR_9.5) 与QβVLP缀合，并如实施例3所述用于免疫小鼠及评定针对PCSK9的抗 体应答，未缀合的VLP用作对照免疫原。如图9和10所示，在ELISA测 定中所有肽均诱导可识别完整全长小鼠PCSK9的抗体。
实施例6
在我们观测到的胆固醇降低是由肽VR_9.5(代表人PCSK9的N末端成 熟加工形式(SEQ ID No：184))免疫而诱导的基础上，我们假设由于已知裂解 的未成熟PCSK9的前结构域保持与成熟PCSK9蛋白质相关，因此这个前 结构域区域(SEQ ID No.329)也是降低胆固醇水平的候选抗体靶位。
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVL ALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLS QSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELAL KLPHVDYIEEDSSVFAQ(SEQ ID No：329)
感兴趣的特异性肽的非限制性实例在前结构域区域的C末端序列和表 面暴露的序列和环中发现，包括含有已知在人类中的功能丧失或功能获得 性遗传突变的区域：
VDYIEEDSSVFAQ(SEQ ID No：308)
RCAKDPWRLPGT(SEQ ID No：309)
AQAARRGYLTKIL(SEQ ID No：310)
GDYEELVLALRSEEDG(SEQ ID No：311)
FLVKMSGDLLELALKLP(SEQ ID No：312)
上述肽及其截短形式是使用N末端或C末端加入的接头(例如CGG或 GGC)合成的，或者作为环化的或另外构象限制的分子，并如实施例2所述 与QβVLP偶联，并如实施例3所述用于免疫小鼠及评定针对PCSK9的抗 体应答。
实施例7
如实施例2所述将肽VR_9.5和9.10与QβVLP或者与CRM197缀合， 并用于免疫小鼠(BALB/c或C57BL/6)，使用TiterMax Gold、明矾或者明矾 -CpG作为佐剂。将乙型肝炎病毒衍生肽(氨基酸28-39(IPQSLDSWWTSL)) 与QβVLP或者与CRM197缀合，用作对照免疫原。
使用的ELISA方法与在实施例3中揭示的方法略有不同：所述ELISA 方法如下述人和小鼠PCSK9ELISA(方法2)进行：将384-孔高结合测定平板 (Greiner bio-one 781061)用25μL/孔的经1×PBS pH 7.4稀释为1μg/mL的人 或小鼠PCSK9蛋白质原液包被，在4℃保温过夜。第二天，将平板用25μL/ 孔的1×PBS/0.05％Tween-20/1％BSA封闭，在摇床上在室温保温1小时。 从1∶50或1∶500稀释度(1×PBS/0.05％Tween-20稀释剂)开始制备每个样品 的10点1/2(10point1/2)log系列稀释液，然后将25μL/孔系列稀释液一式两 份转移进人或小鼠PCSK9包被的平板中，在室温振荡保温1小时。在用1 ×PBS pH 7.4/0.05％Tween-20洗涤3次后，加入25μL/孔的用1×PBS pH 7.4/0.05％Tween-20以1∶3000稀释的总IgG检测抗体(山羊抗小鼠IgG(γ)， HR，Invitrogen M30107)，然后在室温振荡保温1小时。在用1×PBS pH 7.4/0.05％Tween 20洗涤5次后，加入25μL/孔的Bio-Rad TMB过氧化物酶 EIA底物试剂盒(Bio-Rad Cat#172-1067)，将该平板保温15分钟。加入 12.5μL/孔的1N硫酸，然后在Abs 450nm读取吸光度。
结果：与QβVLP或者CRM197缀合的肽VR_9.5和9.10能诱导针对完 整的全长人和小鼠PCSK9蛋白的抗体应答(见图11和12)。图13和14及表 4也示出与不同载体缀合的肽VR_9.5和9.10在存在不同佐剂条件下导致血 清胆固醇水平降低。
表4：免疫小鼠中总胆固醇水平
Stats(a)：1-way ANOVA统计学比较，使用Tukey post-hoc检验，展示测 试组比未处理组的p值。
Stats(b)：1-way ANOVA统计学比较，使用Tukey post-hoc检验，展示测 试组比匹配的对照肽-载体的p值。
实施例8
从PCSK9的前结构域和催化结构域的C末端区域中选择另外的肽 (SEQ ID No：312、420、421、422、423、425、426、427、428、445、482、 525和563)进行表面暴露及与在人中鉴别的功能获得或功能丧失性突变相 关。对通过上述方法获得的系列肽通过加入氨基酸修饰以允许化学缀合， 并作为疫苗候选物进行评估(表5，肽9.23-9.35)。
表5-肽序列
肽 序列 物种 SEQ ID No VR_9.5 SIPWNLERITPC 人 317 VR_9.10 SIPWNLERIIPC 小鼠 322 VR_9.17 SIPWNLERIGGC 人&小鼠 401 VR_9.18 SIPWNLERGGC 人&小鼠 402 VR_9.19 SIPWNLEGGC 人&小鼠 403 VR_9.20 CGGSGRDAGVAKGA 人 404 VR_9.21 CGGSGRDAGVAKGT 小鼠 405 VR_9.22 RDAGVAKGGC 人 406 VR_9.23 CSRHLAQASQELQ 人 407 VR_9.24 CRSRPSAKASWVQ 小鼠 408 VR_9.25 CGGDYEELVLALR 人 409 VR_9.26 CGGDYEELMLALP 小鼠 410 VR_9.27 LVLALRSEEDGGC 人 411 VR_9.28 LMLALPSQEDGGC 小鼠 412 VR_9.29 AKDPWRLPGGC 人 413 VR_9.30 SKEAWRLPGGC 小鼠 414 VR_9.31 CGGAARRGYLTK 人 415 VR_9.32 CGGAARRGYVIK 小鼠 416 VR_9.33 FLVKMSGDLLELALKLPGGC 人 417 VR_9.34 FLVKMSSDLLGLALKLPGGC 小鼠 418 VR_9.35 CGGEEDSSVFAQ 人 419
下划线处残基表示为了缀合目的加入的氨基酸。
实施例9
如实施例2所述将肽VR_9.17至VR_9.35(以及VR_9.5)与QβVLP缀 合并用于免疫小鼠以评定对PCSK9的抗体应答，如实施例3所述。将乙型 肝炎病毒衍生肽(氨基酸28-39(IPQSLDSWWTSL))与QβVLP缀合并用作对 照免疫原。使用方法2进行ELISA。
结果：如图15和16所示，大多数与Qb VLP缀合的肽能诱导对完整的 全长PCSK9的抗体应答。对肽9.31和9.32检测到无抗体应答。在某些情 况中(肽9.23、9.24、9.27、9.28、9.29、9.30、9.33和9.34)，抗体应答是物 种特异性的。用肽9.5、9.18和9.29进行免疫也导致血清胆固醇降低，而用 肽9.17、9.19、9.30、9.31和9.32免疫导致胆固醇降低的倾向(表6，图17)。
表6：免疫的小鼠中的总胆固醇水平
Stats(a)：1-way ANOVA统计学比较，使用Bonferroni post-hoc检验，展 示测试组比未处理组的p值。
Stats(b)：1-way ANOVA统计学比较，使用Bonferroni post-hoc检验，展 示测试组比对照肽组的p值。
序列表