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1、(10)申请公布号 CN 102586375 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586375 A *CN102586375A* (21)申请号 201210044681.2 (22)申请日 2012.02.24 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/12(2006.01) A23L 1/305(2006.01) A61K 38/01(2006.01) A61P 9/12(2006.01) (71)申请人 华东理工大学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路 130 号 (72)发明人 谢静莉 方明 吴燕玲 杜磊 李鹏 魏东芝 (74)专利代理机构 上海智。
2、信专利代理有限公司 31002 代理人 薛琦 (54) 发明名称 开心果用于制备 ACE 抑制剂的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种开心果用于制备血管紧张 素转化酶抑制剂的应用。 优选的， 所述开心果为开 心果的果仁经蛋白酶水解、 酸性水解或碱性水解 后的产物。本发明为开心果的开发利用开辟了一 条全新的途径， 具有非常广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 开心果用于制备血管紧张素转化酶抑制剂的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用，。
3、 其特征在于， 所述开心果为开心果的果仁经蛋白酶水解、 酸性水解或碱性水解后的产物。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述开心果的果仁包括脱脂和未脱脂的果 仁。 4. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述蛋白酶选自 ： 胃蛋白酶、 中性蛋白酶、 碱 性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 风味酶、 菠萝蛋白酶以及胰蛋白酶。 5. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述酸性水解的 pH 为 2 6。 6. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述碱性水解的 pH 为 8 11。 7. 开心果用于制备降血压食品或保健品的应用， 其特征在于， 所述降血压食品或保健 。
4、品用于抑制血管紧张素转化酶的活性。 权 利 要 求 书 CN 102586375 A 2 1/6 页 3 开心果用于制备 ACE 抑制剂的应用 技术领域 0001 本发明属于食品领域， 具体地说， 是关于开心果用于制备血管紧张素转化酶 (Angiotensin Converting Enzyme， ACE) 抑制剂的应用。 背景技术 0002 开心果(pistacia vera L.)， 又名阿月浑子， 是漆树科(Anacardiaceae)黄连木属 (Pistacia) 的多年生落叶小乔木， 是木本油料、 干果、 药用等多种用途的经济树种。阿月浑 子这一名称来源于波斯语 Peste 或 Pi。
5、ste ， 已有 5000 年的栽培历史。目前， 世界上的主 要开心果生产国有美国、 伊朗、 土耳其、 希腊、 叙利亚、 阿富汗等国家。中国新疆等地也有栽 培生产。 0003 每100克开心果含有47的果壳， 53的果仁。 开心果果仁中蛋白质含量为21， 脂肪含量为 46， 碳水化合物含量为 26， 纤维素含量为 10， 钙含量为 0.11， 镁含量 为 0.1 ( 魏玉君等， 阿月浑子生产现状及引种前景 J， 河南林业科技， 2004， 6， 24(2) ： 32-34 ； 韩中海等， 开心果的开发利用价值及建园技术 J， 安徽农业科学， 2005， 33(10) ： 1828-1829 ；。
6、 杨恒等， 开心果的生物学特性及主要品种简述 J， 陕西林业科技， 2002(4) ： 54-56 ； 李建红， 美国阿月浑子现状 J， 甘肃农业， 2003(11) ： 75-76 ； USDA SR 18， 2005. USDA National Nutrient Database for Standard ReferenceN， Release 21(2008). http:/www.nal.usda.gov/fnic/food-comp/)。 0004 ACE(血管紧张素转化酶， Angiotensin Converting Enzyme)在人体内的作用是把 血管紧张素I(Angiot。
7、ensin I Converting Enzyme)转化成血管紧张素II(Angiotensin II Converting Enzyme)， 而血管紧张素II为强烈的血管收缩物质， 可使血管收缩， 从而使体内 血压升高。此外， ACE 还可以失活体内调节血压的缓激肽， 也从而使体内血压升高。 0005 ACE 是一种金属肽酶， 含有 2 个结合 Zn2+的位点， 即所谓 “必须结合位点 (Obligatory Binding Site)” 。Zn2+结合位点是 ACE 催化反应的活性基团所在部位。各种 ACE 抑制物的共同作用是与 ACE 活性部位的 Zn2+结合， 使之失活。 0006 降。
8、血压肽是由数个氨基酸组成的肽， 是对 ACE 活性区域亲和力较强的竞争性抑制 剂， 它们与ACE的亲和力比血管紧张素转化酶I(AngI)或舒缓激肽更强， 而且也较不容易从 ACE 结合区释放， 降低 ACE 活性或使其失去活性， 从而阻碍 ACE 催化血管紧张素 I 转化成血 管紧张素 II， 使血管不收缩， 以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程， 起 到降血压的作用。 0007 到目前为止， 未发现有关于利用开心果制备 ACE 抑制物或降血压药物的报道。 发明内容 0008 本申请的发明人在长期研究开心果的用途的过程中发现， 开心果果仁的水解产物 具有明显的血管紧张素转化酶 (。
9、ACE) 抑制活性。 0009 因此， 本发明的目的在于提供一种开心果用于制备血管紧张素转化酶抑制剂的应 说 明 书 CN 102586375 A 3 2/6 页 4 用。 0010 根据本发明， 所述开心果为开心果的果仁经蛋白酶水解、 酸性水解或碱性水解后 的产物。 0011 根据本发明的优选实施例， 所述开心果的果仁包括脱脂和未脱脂的果仁。 0012 根据本发明的优选实施例， 所述蛋白酶选自 ： 胃蛋白酶、 中性蛋白酶、 碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 风味酶、 菠萝蛋白酶以及胰蛋白酶。 0013 根据本发明的优选实施例， 所述酸性水解的 pH 为 2 6。 0014 根据本发明的优选实施例，。
10、 所述碱性水解的 pH 为 8 11。 0015 基于开心果具有抑制血管紧张素转化酶活性的作用， 开心果可进一步用于开发具 有降血压功能的食品或保健品。 0016 本发明为开心果的开发利用开辟了一条全新的途径， 具有非常广泛的应用前景。 具体实施方式 0017 以下结合具体实施例， 对本发明的降血压多肽的制备方法作进一步详细说明。应 理解， 以下实施例仅用于实施本发明而非用于限定本发明的范围。 0018 以下实施例中， ACE 抑制活性的测定原理及方法步骤如下 ： 0019 开心果果仁蛋白水解物(多肽)的ACE抑制活性测定采用体外模拟测定， 体外ACE 抑制率测试原理为 ： 底物马尿酰组氨酰亮。
11、氨酸(HHL)在酶ACE的催化作用下， 可以生产马尿 酸 (Hip) 和二肽， 通过液相的方法测定马尿酸的含量， 进而可以间接测定 ACE 酶的酶活 ； 而 ACE 抑制剂放入存在可以抑制 ACE 酶的活性， 致使 Hip 的生成减少， 从而间接反应了 ACE 抑 制肽的活性。 0020 测试方法步骤如下 ： 选取 EP 管作为反应器， 编号 0、 1、 2、 3 等， 0 号管加入 50L 去 离子水为对照， 1、 2、 3 等管加入 50L 的 ACE 抑制剂， 同时各管内加入 50L 的底物 HHL， 37温浴 5min， 然后加入 10L 的 ACE 启动反应， 在 37水浴中反应 4。
12、0min， 反应结束后， 加入 100L 1M HCl 终止反应。反应液进行高速离心， 过 4.5m 的滤头， 然后进行高效液 相色谱 (HPLC) 测定。HPLC 条件是 ： 15乙腈 ： 85水 (0.1 TFA)， 检测波长 228nm， 柱温 30， 上样量 10L ； 0021 ACE 抑制率 (X) 按下式计算 ： 0022 X (A 对照 -A1)/A 对照 100 0023 式中 ： X-ACE 抑制率 ( ) 0024 A 对照 - 对照组生成 Hip 的峰面积 0025 A1- 实验组生成 Hip 的峰面积 0026 实施例 1-12、 脱脂开心果果仁多肽水解物的制备 00。
13、27 取开心果， 去壳， 取果仁， 捣碎研磨， 收集， 取一定量的开心果粉末， 加乙醇脱脂 3h， 反复水洗去乙醇， 干燥， 得脱脂开心果果仁粉。 0028 按表 1 所示， 对获得的脱脂开心果果仁粉分别用不同的蛋白酶、 酸性溶液和碱性 溶液处理， 具体如下 ： 0029 酶水解 ： 称取 10g 粉末加 100ml 水， 按照表 1 的蛋白酶水解条件， 调 pH 值至相应的 酶反应 pH 条件， 加入相应的酶 0.1 (w/v)， 在相应的反应温度下水浴酶解 2 5hr， 搅拌， 说 明 书 CN 102586375 A 4 3/6 页 5 终止反应， 水解物离心 (12000r/min， 。
14、10min)， 取上清液， 在 -40冷冻干燥， 收集水解物粉 末。 0030 酸、 碱水解 ： 称取 10g 粉末加 100ml 去离子水， 分别用 1M HCl 和 1M NaOH 调 pH 值 至 2、 4、 6、 8、 10、 11， 50水浴 6 9hr， 离心取上清液， 终止反应， 水解物离心 (12000r/min， 10min)， 取上清液在 -40冷冻干燥， 收集水解物粉末。 0031 表 1、 蛋白酶、 酸、 碱水解条件 0032 实施例 酶、 酸或碱 温度 ( ) pH 时间 (hr) 1 胃蛋白酶 37 1.8 2 2 中性蛋白酶 42 6 3 3 碱性蛋白酶 55 8。
15、.12 2 4 木瓜蛋白酶 55 5 4 5 风味酶 55 6 5 6 胰蛋白酶 37 7.97 3 7 pH2 酸处理 50 2 6 8 pH4 酸处理 50 4 8 9 pH6 酸处理 50 6 7 10 pH8 碱处理 50 8 9 11 pH10 碱处理 50 10 7 12 pH11 碱处理 50 11 6 0033 实施例 13-29、 未脱脂开心果果仁多肽水解物的制备 0034 开心果去壳， 取果仁， 捣碎研磨， 收集开心果果仁粉末。 0035 按表 2 所示， 对获得的脱脂开心果果仁粉分别用不同的蛋白酶、 酸性溶液和碱性 溶液处理， 具体如下 ： 0036 酶水解 ： 称取 1。
16、0g 磨碎开心果果仁粉末， 加水 100ml， 按照表 2 所列的蛋白酶水解 条件， 调至酶相应的 pH 值， 加酶 0.1 (w/v)， 在酶的最适温度下水解 0.17 20hr。取酶解 液离心 (12000r/min， 10min)， 取上清液， 在 -40冷冻干燥， 收集水解物粉末。 0037 酸、 碱水解 ： 称取 10g 粉末加 100ml 去离子水， 分别用 1M HCl 和 1M NaOH 调 pH 值 至 2、 4、 6、 8、 10、 11， 于 50水浴水解 6 9hr。分别取酸解液和碱解液离心 (12000r/min， 10min)， 取上清液， 在 -40冷冻干燥， 收。
17、集水解物粉末。 0038 表 2、 蛋白酶、 酸、 碱水解条件 说 明 书 CN 102586375 A 5 4/6 页 6 0039 0040 实施例 30、 ACE 抑制活性的测定 0041 分别取实施例 1-12 和 13-29 获得的开心果果仁水解物粉末， 制成浓度为 3mg/ml 的溶液， 采取体外模拟测定方法对 ACE 抑制活性进行测定， 结果分别如以下表 2 和表 3 所 示 ： 0042 表 2、 ACE 抑制活性 -1 0043 说 明 书 CN 102586375 A 6 5/6 页 7 实施例 ACE 抑制率 ( ) 1 96.6 2 91.8 3 97.4 4 91.6。
18、 5 95.5 6 98.0 7 91.9 8 89.5 9 87.5 10 85.4 11 84.0 12 47.4 0044 0045 表 3、 ACE 抑制活性 -2 0046 实施例 ACE 抑制率 ( ) 13 85.5 14 85.6 15 94.3 16 86.7 17 89.8 18 84.9 19 78.9 20 88.8 说 明 书 CN 102586375 A 7 6/6 页 8 21 84.3 22 92.1 23 95.1 24 71.7 25 94.5 26 93.4 27 91.2 28 90.4 29 92.7 0047 0048 由表 2 的结果可见， 脱脂开。
19、心果果仁经蛋白酶水解、 酸水解和碱水解后的多肽均 具有明显的 ACE 抑制活性， 除碱性水解的抑制率较低外， 其余方法的抑制率均达到 90以 上， 其中经胰蛋白酶水解后的抑制活性最高， 达 98。 0049 由表 3 的结果可见， 未脱脂开心果经蛋白酶水解、 酸水解和碱水解后的多肽也均 具有明显的 ACE 抑制活性， 其中 pH4 酸处理水解后的抑制活性最高。碱性水解的抑制率也 从脱脂开心果的略低水平增加到 90以上， 可能未脱脂开心果中的脂肪也被碱水解形成有 助于抑制 ACE 活性的物质。 0050 综上所述， 本发明提供的开心果果仁的蛋白酶水解物， 酸水解物和碱水解物对血 管紧张素转化酶(ACE)均具有明显的抑制活性， 因而可以用于制备ACE抑制剂， 或者进一步 用于制成具有降血压功能的食品或保健品， 这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。 说 明 书 CN 102586375 A 8 。