一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法.pdf

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1、10申请公布号CN102002486A43申请公布日20110406CN102002486ACN102002486A21申请号201010516235822申请日20101022C12N9/16200601C12N15/55200601C12N15/63200601C12R1/3920060171申请人北京理工大学地址100081北京市海淀区中关村南大街5号72发明人李春姜芳燕王金梅戴大章54发明名称一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法57摘要本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。该磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，其基因全长1272BP，编码4。

2、23个氨基酸，酶蛋白理论分子量为458KDA，其中169BP编码磷脂酶B信号肽，701272BP编码磷脂酶B成熟肽。利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。本发明的磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，制备方法简单、产品质量高、生产成本低。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表4页附图3页CN102002496A1/1页21一种磷脂酶B，其能够水解磷脂中的两。

3、个脂酰基基团，其特征在于来源于荧光假单胞菌的一个株系。2根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于荧光假单胞菌的一个株系为BIT18，其GENBANK号为GU367870。3根据权利要求1所述的一种磷脂酶B，其特性在于由423个氨基酸组成，酶蛋白理论分子量为458KDA。4根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含与序列SEQNO2所示氨基酸序列有至少90同源性的氨基酸序列，且能够水解磷脂中的两个脂酰基基团。5根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在于423个氨基酸包含的N端氨基酸序列是序列SEQNO2的第1423位所示序列。6根据权利要求3所述的一种磷脂酶B，其特性在。

4、于423个氨基酸所对应的核苷酸序列为SEQNO1，全长为1272BP，其中169BP编码磷脂酶信号肽，701272BP编码磷脂酶成熟肽。7一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于在合适的发酵培养基中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系；通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，以及随后离心回收磷脂酶B；其中发酵培养基为终浓度百分含量G/ML，0015大豆磷脂，0110淀粉，0015牛肉膏，0015蛋白胨，0013NACL，0012MGSO47H2O，调PH30110。8一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于步骤为从可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系中分离编码磷脂酶。

5、B的DNA序列；在合适的载体上将该DNA片段连上合适的表达信号；用该载体转化合适的异源宿主生物体；在可导致磷脂酶B表达的条件下培养经转化的宿主生物体，并从培养基中回收磷脂酶B。9根据权利要求8所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于异源宿主物体为原核细胞。10根据权利要求9所述的一种磷脂酶B的生产方法，其特征在于原核细胞为大肠杆菌。权利要求书CN102002486ACN102002496A1/7页3一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法技术领域0001本发明涉及一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，属于酶基因工程和酶工程领域。背景技术0002磷脂在自然界分布广泛，所有的细胞中都含。

6、有磷脂，磷脂是生物膜的基本组成成分。磷脂在生命过程中起代谢作用和结构形成作用，是重要的生命物质。磷脂酶是水解磷脂的酯键的酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，影响磷脂的分解代谢、生物膜的形成和重组，并且磷脂酶也涉及信号的级联。依据其作用位点不同，磷脂酶分为磷脂酶A1、A2、B、C、D等。其中磷脂酶A1和A2分别水解SN1和SN2位酰基，产生溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶B具有水解酶和溶血磷脂酶的活性。水解酶的活性能同时水解SN1和SN2位酰基，溶血磷脂酶的活性则能水解溶血磷脂剩余的酰基。0003磷脂酶在工业中有多种应用，包括应用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油/水混合物的乳化；磷脂酶可用于植物。

7、油加工过程中的酶法脱胶；淀粉水解产物特别是小麦淀粉的水解产物的后续处理以提高过滤通透能力。此外，磷脂酶在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有效。低温磷脂酶B的最适酶活温度一般在40以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点，因而应用于植物油酶法脱胶和修饰磷脂乳化剂等工业生产中可简化生产工艺、节能减耗、提高产品质量、保护环境、降低生产成本。0004磷脂酶B已从动物、植物、微生物等不同的来源获得。动物包括天竺鼠AGASSAMADIAGNE等，JBIOLCHEM，264，94709475，1989；老鼠SPINDETAL，BIOCHEMCELLBIOL，69，346357，。

8、1991；兔子WBOLLETAL，JBIOLCHEM，268，1290112911，1993。植物有蚕豆YLEEETAL，FEBSLETT，343，213218，2001。微生物包括酿酒酵母MICHIMASAETAL，AGRICBIOLCHEM，494，10831089，1985；FPAULTAUFETAL，JBIOLCHEM，269，1972519730，1994；粟酒裂殖酵母HOISHIETAL，BIOSCIBIOTECHBIOCHEM，607，10871092，1996；产黄青霉NKAWASAKIETAL，JBIOLCHEM，77，12331244，1975；NMASUDAETAL，EU。

9、RJBIOCHEM，202，783787，1991；牛莫氏杆菌JMTENNENTETAL，JBACTERIOL，183，67176720，2001；鼠麻风分支杆菌SHINJIMAEDAETAL，BIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA，1303，3138，1996。但动植物磷脂酶B来源有限，且价格昂贵。微生物磷脂酶B的研究发现为磷脂酶的应用提供了新的来源，并且其发酵条件简单，大大降低了生产成本，为以后的工业化生产奠定了基础。到目前为止，有关产生低温磷脂酶B的荧光假单胞菌的研究，国内外尚未见报道。发明内容0005本发明的目的是为了提供一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B及其生产方法，该磷。

10、脂酶B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰说明书CN102002486ACN102002496A2/7页4基基团，该方法简单、产品质量高、生产成本低。0006本发明的目的是通过以下技术方案实现的。0007本发明的一种来源于荧光假单胞菌PSEUDOMONASFLUORESCENS的磷脂酶B，该磷脂酶B由荧光假单胞菌产生，磷脂酶B在低温下具有良好的活性和稳定性。磷脂酶B基因全长1272BP，编码423个氨基酸，酶蛋白理论分子量为458KDA，其中169BP编码磷脂酶B信号肽，701272BP编码磷脂酶B成熟肽；利用现有分子生物学方法可以得到其表达载体和重组宿主，即。

11、获得含有磷脂酶B基因的大肠杆菌重组质粒以及重组大肠杆菌。0008本发明的一种来源于荧光假单胞菌的磷脂酶B的生产方法，在合适的发酵培养基中培养可产生磷脂酶B的荧光假单胞菌株系。通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，磷脂酶B发酵酶活达432UML1。其中发酵培养基为终浓度百分含量G/ML0015大豆磷脂，0110淀粉，0015牛肉膏，0015蛋白胨，0013NACL，0012MGSO47H2O，调PH30110。通过SDSPAGE以及从荧光假单胞菌克隆到磷脂酶B基因，进一步确定了菌株BIT18只产生磷脂酶B，无脂肪酶活性。0009有益效果0010本发明。

12、的磷脂酶基因B在低温下显示活性，并且无脂肪酶的活性，能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基基团，在油脂精炼和修饰磷脂乳化剂等工业过程中有着广泛的应用，本发明的制备方法简单、产品质量高、生产成本低。附图说明0011图1为棕榈酸甲酯的标准品气相色谱图；0012图2为油酸甲酯的标准品气相色谱图；0013图3为荧光假单胞菌BIT18表达磷脂酶的气相色谱鉴定图；0014图4为磷脂酶B温度变化曲线；0015图5为磷脂酶BPH值变化曲线；0016图6为PCR扩增荧光假单胞菌BIT18的磷脂酶B基因保守片段的琼脂糖凝胶电泳；其中M表示DL2000MARKER，1表示单引物PLB1PCR产物，2表示双引物PLB1和。

13、PLB2PCR产物，3单引物PLB2PCR产物；0017图7为PCR扩增荧光假单胞菌BIT18的磷脂酶B全长基因的琼脂糖凝胶电泳；其中M表示DL2000MARKER，1表示磷脂酶B全长基因PCR产物；0018图8为大肠杆菌重组质粒PET28APLB单酶切和双酶切图；其中M表示1KBMARKER，1表示ECORI和HINDIII双酶切，2表示ECORI单酶切，3表示HINDIII单酶切；0019图9为在大肠杆菌中表达的磷脂酶B的SDSPAGE；其中M表示蛋白MARKER，1和6表示荧光假单胞菌BIT18表达的磷脂酶B，2表示重组大肠杆菌BL21DE3诱导前全细胞，3表示重组大肠杆菌BL21DE3。

14、诱导后全细胞，4表示重组大肠杆菌BL21DE3的周质部分，5表示重组大肠杆菌BL21DE3的上清部分。具体实施方式0020实施例1说明书CN102002486ACN102002496A3/7页50021一、产生磷脂酶菌株的筛选00221、菌种的分离筛选0023采自新疆维吾尔自治区石河子市、山西省大同市、运城市、河南省郑州市，其中包括大豆油、菜籽油、棉籽油加工车间周围及大豆和菜籽种植基地的土样，均为地表以下10CM处采集，共18份。取土样10G，放入盛有90ML无菌水并带有玻璃珠的三角瓶，室温振荡12H后静置。吸取1ML上层液体接种于49ML富集培养基大豆磷脂40G/L，KN0310G/L，K2。

15、HPO410G/L，NACL05G/L，MGSO47H2O05G/L中，30摇瓶培养24H，然后取少量富集培养液涂布于初筛培养基大豆磷脂40G/L，蛋白胨100G/L，K2HPO410G/L，NACL05G/L，MGSO47H2O05G/L，琼脂180G/L平板上，分离得到能够以大豆磷脂为唯一碳源生长且产生水解圈的单菌落，水解圈直径与菌落直径比值R越大则表明磷脂酶的活力越大。采用分离培养基筛选得到136株产磷脂酶的微生物，其中有4株菌的水解圈较大。0024将平板初筛获得的4株菌接种于LB磷脂平板分别采用酚红和罗丹明染色，30培养72H，水解圈直径与菌落直径比值R越大则表明磷脂酶的活力越大。选出。

16、产酶能力较强的菌株进行斜面保存。单菌株摇瓶发酵葡萄糖100G/L，牛肉膏75G/L，蛋白胨75G/L，NACL30G/L，MGS047H2010G/L，大豆磷脂4G/L试验复筛表明菌株BIT18所产磷脂酶活力最高，酶活力达到25UML1，可作为进一步研究的原始菌株。00252菌种鉴定00261生理生化检测0027形态特征参照伯杰氏系统细菌学鉴定手册BERGEYSMANUALOFSYSTEMATICBACTERIOLOGY第九版和常用细菌系统鉴定手册中的方法进行，生理生化特征采用细菌生化试验鉴定仪及配套革兰氏阴性菌检测试验卡对复筛菌株进行生理生化特征鉴定。产生磷脂酶的微生物菌株BIT18的生物学。

17、特性如表1所示0028表1菌株BIT18的生理生化特征00290030注利用或该反应为阳性；不利用或该反应为阴性说明书CN102002486ACN102002496A4/7页600312分子生物学鉴定0032菌株BIT18基因组DNA的提取0033用本领域技术人员已知的常规方法提取菌株BIT18基因组DNA。取1ML培养物于15MLEP管中，室温10,000RPM离心5MIN，弃上清，沉淀重新悬浮于1MLTEPH80中；加入6L50MG/ML的溶菌酶，37作用2H。再加2MOL/LNACL50L，10SDS110L，50作用3H或37过夜；菌液均分到两个15MLEP管，加等体积的酚氯仿异戊醇2。

18、5241，混匀，室温放置510MIN。14,000RPM离心10MIN，抽提两次。加入等体积的氯仿，轻轻混合，14,000RPM4离心3MIN，上清吸入另一干燥离心管中；加入1/10体积的醋酸钠10MMOL/L溶液，混匀，加06倍体积冷的异丙醇，混匀，20放置30MIN，14,000RPM离心10MIN；沉淀用75的乙醇洗涤两次，真空干燥，直至无乙醇味；抽凉干后，溶于4050LTE或DDH2O中，取5L电泳，剩余20保存备用。003416SRDNA序列分析0035采用16SRDNA的通用引物16SL5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3和16SR5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。

19、3，以BIT18菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得16SRDNA序列与GENBANK数据库中的序列进行同源性比对，结果表明菌株BIT18与荧光假单胞菌形成一簇，其同源性达99以上，其16SRDNA基因序列如下00361ATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG003761AGCGGATGAAAGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAA0038121TCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACG。

20、TCCTACG0039181GGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTA0040241GTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAG0041301TCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG0042361ACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTA0043421AAGCACTTTAAGTTGGGA。

21、GGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTACCG0044481ACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCG0045541TTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAT0046601CCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTG0047661GTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACC。

22、AGTGGCGAAG0048721GCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA0049781GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCT0050841TAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAAC0051901TCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAC0052961GCGAAGAACCTTACC。

23、AGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTT00531021CGGGAGCATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT00541081TAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTC00551141TAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCC00561201CTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAA。

24、GGGTTGCCAAGCCGCGA00571261GGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCG00581321TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCC说明书CN102002486ACN102002496A5/7页700591381TTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACC00601441TTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGG。

25、GTGAAGTCGTAACAAGGTAGC00611501CGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTAATC0062从菌株BIT18的显微特征菌、生理生化特征和分子特性可以确定，产磷脂酶菌株BIT18，属于荧光假单胞菌系，因将其命名为荧光假单胞菌BIT18，在GENBANK数据库中的登陆号为GU367870。0063二、荧光假单胞菌BIT18产生磷脂酶种类的确定0064通过气相色谱测定与磷脂酶与磷脂标准品反应产物中脂肪酸的种类，从而判断其种类。0065待测样品的预处理。25MGPC标准品1棕榈酰2油酰磷脂酸溶于05ML乙醚中；取01ML溶解后标准品与29ML酶液于25，1。

26、50RPM反应3H；加6ML5盐酸甲醇溶液于95，反应2H；加6ML己烷，振荡摇匀，1500RPM离心15MIN，收集上清液，重复两次；用氮气去除机除尽己烷，然后用100L无水甲醇溶解，用于下一步气相色谱分析。0066气相色谱SHIMADZU，GC2010条件FFAP毛细管柱032MM25M；FID检测器；采用程序升温，180维持05MIN后，以10/MIN的速度升温至250，维持7MIN；进样口温度和检测器温度分别为250和275；进样量，4L。结果如图13所示，其中图1和图2分别表示棕榈酸和油酸的标准品气相色谱图，图3表示待测样品的气相色谱图。从图3可以看出，荧光假单胞菌BIT18所产磷脂。

27、酶水解PC标准品同时产生棕榈酸和油酸，说明该磷脂酶同时水解PC的SN1位酰基和SN2位酰基，从而可以判断其为磷脂酶B。0067三、荧光假单胞菌BIT18产生的磷脂酶B基因的活力测定0068磷脂酶B活性测定采用NAOH电位滴定法。取一定量大豆磷脂、05PVA溶于预定PH值的缓冲液中，用高速均质机在10000R/MIN的条件下均质3MIN，得到底物溶液。取4个100ML的三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液9ML，再于空白瓶中加入95乙醇20ML，于预定温度的水浴中预热5MIN，然后在各瓶中加入酶液预定稀释倍数的稀释液1ML用缓冲液稀释，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180R/M。

28、IN的条件振荡准确反应一定时间，于样品瓶中立即补加95乙醇20ML终止反应，取出，用005MOL/LNAOH标准溶液进行滴定，记录标准碱液平均消耗量，计算磷脂酶活力，其计算公式00690070式中X样品的磷脂酶活力，U/ML；0071V滴定样品时消耗的NAOH标准溶液体积，ML；0072V0滴定空白时消耗的NAOH标准溶液体积，ML；0073CNAOH标准溶液的浓度，MOL/L；007450005MOL/LNAOH标准溶液100ML相当于脂肪酸50MOL；0075T测定酶活的反应时间。0076脂肪酶活力测定参照国标GB/T1803932002采用NAOH滴定法。0077根据磷脂酶活力的计算公式。

29、可得到磷脂酶活力随温度和PH的变化曲线，如图5和图6所示，结果表明磷脂酶B最适作用温度2530，最适PH65。0078实施例2说明书CN102002486ACN102002496A6/7页80079一、荧光假单胞菌BIT18的磷脂酶B基因的克隆00801PCR扩增磷脂酶B基因保守片段0081根据NCBI上已公布的细菌磷脂酶B的保守序列设计了一对简并引物P1F5GVSAACAACGGCGGCTACGC3和P2R5GCCARYTCCAYTGCGGRTGC3，以荧光假单胞菌BIT18基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为94预变性4MIN，94变性40S，56退火30S，72延伸2MI。

30、N，35个循环后72延伸10MIN。PCR反应液经1琼脂糖凝胶电泳分离，如图6所示。结果表明扩增到大小约为450BP的DNA片段。0082将PCR扩增出的大小约为450BP的DNA片段连接到PMD19T载体上，将转化好的大肠杆菌涂布在含有终浓度为50G/MLAMP的LB固体培养基，37下培养1618H。在含有AMP的LB固体培养基中挑取白色的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性克隆，再通过经ECORI和HINDIII双酶切鉴定，最后送往北京六合华大基因有限公司测序。测序结果表明，扩增得到426BP的保守片段，将保守片断测序结果在NCBI中进行BLAST比对，在比对的结果中发现，保守片断与荧光假单。

31、胞菌PF01中一个未知酶蛋白基因GENBANK登陆号CP0000942的同源性最高，达到91。00832PCR扩增磷脂酶B全长基因0084将未知蛋白基因序列作为模板设计一对特异性引物P2F5ATAGCGCCGGGACGAAAATG3和P2R5AGCTCGCCGTGCAGCATCA3，以荧光假单胞菌BIT18基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为94预变性4MIN，94变性40S，59退火30S，72延伸2MIN，35个循环后72延伸10MIN。PCR反应液经1琼脂糖凝胶电泳分离，如图7所示。结果表明扩增到大小约为1300BP的DNA片段。0085将PCR扩增出的大小约为1300B。

32、P的DNA片段连接到PMD19T载体上，将转化好的大肠杆菌涂布在含有终浓度为50G/MLAMP的LB固体培养基，37下培养1618H。在含有AMP的LB固体培养基中挑取白色的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性克隆，再通过经ECORI和HINDIII双酶切鉴定，最后送往北京六合华大基因有限公司测序。测序结果表明，扩增得到1272BP的磷脂酶B基因完整的核苷酸序列，参见磷脂酶B核苷酸序列SEQNO1。0086二、磷脂酶B基因在大肠杆菌中的诱导表达00871大肠杆菌重组质粒的构建0088以荧光假单胞菌BIT18的基因组DNA为模板，采用引物P3F5CCGGAATTCATGAAAAAAGTCATGCT。

33、CAA3，含ECORI酶切位点和引物P3R5CCCAAGCTTTCAGAAGCGGTAGGTCGCGC3，含HINDIII酶切位点，PCR扩增含有PLB基因的DNA片段。反应条件为94预变性4MIN，94变性40S，624退火30S，72延伸2MIN，30个循环后72延伸10MIN。回收PCR产物用ECORI/HINDIII双酶切，酶切片段回收纯化后与经ECORI/HINDIII双酶切的PET28A载体连接，获得重组质粒PET28APLB。重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3，提取质粒，并进行酶切鉴定，如图8所示。结果表明获得阳性克隆BL21/PET28APLB。00892磷脂酶B基因在大肠杆菌。

34、中的诱导表达0090重组大肠杆菌在含有50GML1卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养37，170RPM过夜，以1的接种量转接于50ML含50GML1卡那霉素的LB培养基中，摇床培养37，170RPM至06，再加入诱导剂IPTG至终浓度为08MMOL/L，于22，170RPM下诱导培养5H后，冷冻离心4，10000RPM，8MIN收集菌体和上清液。上清液用于酶活测定，说明书CN102002486ACN102002496A7/7页9菌体悬于50MMOL/LPH70的醋酸缓冲液中，冰浴超声破碎。破碎后的菌体再离心获得的上清液用于酶法活性测定和SDSPAGE分析。其中上清液酶活为3UMG1，细胞周质。

35、酶活为845UMG1，结果表明磷脂酶B基因在大肠杆菌中的表达产物绝大部分位于细胞周质中，只有少量在上清液中。0091所有的可溶性蛋白进行SDSPAGE电泳分析，如图9所示，结果表明上清液无明显的蛋白条带，而周质部分有明显的表达蛋白条带。重组大肠杆菌BL21/PET28APLB经IPTG诱导在分子量约为50KDA的位置出现了特异的蛋白条带，在扣除4KDA的融合蛋白后，分子量约为458KDA，与荧光假单胞菌BIT18表达的磷脂酶大小一致，也与原始与磷脂酶B氨基酸序列推测的理论值大小一致，说明表达产物中存在磷脂酶B蛋白，而含有PET28A空质粒的对照菌经IPTG诱导后在同一位置上没有特异的条带。以上。

36、的电泳分析结果和酶活测定结果均证明荧光假单胞菌BIT18磷脂酶B基因能够在大肠杆菌中进行有效地表达。0092三、生产磷脂酶B工程菌的核苷酸序列0093生产磷脂酶B的工程菌，是含有下列核苷酸序列之一的原核细胞或真核细胞00941序列表中的SEQNO1；00952编码序列表中SEQNO2蛋白质序列的多核苷酸；00963与序列表中SEQNO1限定的DNA序列具有80以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；00974在中度严谨条件下能与序列表中SEQNO1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。0098其中所述原核或真核细胞优选的为大肠杆菌和酵母细胞，也可以是其它的各种动植物细胞。可选用本领域技术人员熟知。

37、的各种合适的表达载体，如市场销售的各种质粒、噬菌体及病毒载体等。可以直接将磷脂酶基因序列直接连接于表达载体中表达调控序列下游，形成磷脂酶B表达载体。包含本发明的分离的核酸分子的宿主细胞可以是常规使用的原核宿主细胞、酵母、哺乳动物、昆虫细胞等。说明书CN102002486ACN102002496A1/4页100001序列表CN102002486ACN102002496A2/4页1100020003序列表CN102002486ACN102002496A3/4页120004序列表CN102002486ACN102002496A4/4页13序列表CN102002486ACN102002496A1/3页14图1图2图3图4说明书附图CN102002486ACN102002496A2/3页15图5图6图7图8说明书附图CN102002486ACN102002496A3/3页16图9说明书附图CN102002486A。