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1、(10)申请公布号 CN 103739852 A (43)申请公布日 2014.04.23 CN 103739852 A (21)申请号 201310751297.0 (22)申请日 2013.12.30 C08G 81/00(2006.01) C08G 65/48(2006.01) (71)申请人 中国科学院长春应用化学研究所 地址 130022 吉林省长春市朝阳区人民大街 5625 号 (72)发明人 宋镕光 石彤非 李帆 (74)专利代理机构 长春菁华专利商标代理事务 所 22210 代理人 南小平 (54) 发明名称 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物及其制备 方法 (57) 摘要。
2、 本发明涉及一种mPEG接枝-玉米醇溶蛋白 聚合物及其制备方法， 解决现有玉米醇溶蛋白作 为药物和营养素的包裹材料， 不利于控制药物的 释放与粒径分布均一的技术问题。该聚合物首先 由 mPEG 与丁二酸酐反应制备得到 mPEG-COOH ； 再 由 mPEG-COOH 与 - 玉米醇溶蛋白反应制备得到 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物。本发明方法 制备得到的mPEG接枝-玉米醇溶蛋白聚合物溶 于水后， 能够形成稳定存在且尺寸均一的微球 （粒 径在 80-100nm） ， 比混合的玉米醇溶蛋白的粒径 小， 可提高疏水类药物、 营养素的可控释放和生物 利用率。 (51)Int.Cl. 权利要。
3、求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103739852 A CN 103739852 A 1/2 页 2 1.一种mPEG接枝-玉米醇溶蛋白聚合物， 其特征在于， 该聚合物首先由mPEG与丁二 酸酐反应制备得到 mPEG-COOH ； 再由 mPEG-COOH 与 - 玉米醇溶蛋白反应制备得到 mPEG 接 枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物 ； 所述 mPEG 的重均分子量为 1KDa 50KDa ； 所述 - 玉米醇溶蛋白的重均分子量为 22KDa 26KDa ； 所。
4、述-玉米醇溶蛋白是由下述方法制备得到的 ： 首先将玉米醇溶蛋白溶于N-甲基吡 咯烷酮或二甲基亚砜 ； 再在二氯甲烷或乙醚中反复萃取 ； 最后将萃取后的沉淀物溶于 90% 以上甲醇或乙醇溶液， 离心取上清液， 并用水稀释至浓度 80% 以下， 过滤后的固体用正己烷 或石油醚洗涤， 真空干燥后得到 ； 所述聚合物的重均分子量为 23KDa 76KDa， 其具体结构如下式所示 ： 。 2. 权利要求 1 所述的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在于， 该 制备方法包括以下步骤 ： （1）将 mPEG 溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐， 45 65水浴， 搅拌 3 7h，。
5、 在乙醚和二氯甲烷中反复沉淀， 真空过夜， 将得到白色粉末溶于水后， 透析并冻干后得到 mPEG-COOH ； （2） 将 mPEG-COOH 溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 加入 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰 二亚胺盐酸盐 （EDCHCl） 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， mPEG-COOH、 EDCHCl 和 NHS 的 摩尔比 1:1.2:1.2， 搅拌 3 6h， 将上述混合液缓慢滴加至 -zein 的二甲基亚砜溶液中， mPEG-COOH 与 -zein 的摩尔比为 5:1， 室温搅拌 24 28h， 反应完毕后， 在乙醚和 N- 甲基 吡咯烷酮中反复沉淀， 。
6、干燥， 将得到的产物溶于水， 透析并冻干后得到白色mPEG接枝-玉 米醇溶蛋白聚合物。 3. 根据权利要求 2 所述的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在 于， 步骤 （1） 中所述的搅拌速度为 300 700rpm， 搅拌时间为 5h。 4. 根据权利要求 2 所述的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在 于， 步骤 （1） 中所述的反复沉淀的次数为 2 6 次。 5. 根据权利要求 2 所述的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在 于， 步骤 （1） 中所述的透析时间为两天。 6. 根据权利要求 2 所述的 mPEG。
7、 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在 于， 步骤 （2） 中所述的反复沉淀的次数为 2 6 次。 7. 根据权利要求 2 所述的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 其特征在 权 利 要 求 书 CN 103739852 A 2 2/2 页 3 于， 步骤 （2） 中所述的透析时间为 1 4 天。 权 利 要 求 书 CN 103739852 A 3 1/5 页 4 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种聚合物， 具体涉及一种mPEG接枝-玉米醇溶蛋白聚合物及其制 备方法。 背景技术 0002 玉米醇溶蛋白 （ze。
8、in）存在于玉米胚乳中， 是一种天然的混合醇溶蛋白 （包含 alpha,beta,gamma,delta 四种组分） 。它具有很好的生物相容性， 低吸水性， 被广泛应用于 药物的包裹、 运输等领域。 目前人们直接将玉米醇溶蛋白作为药物和营养素的包衣材料， 这 种混合的醇溶蛋白在水溶液中形成的微球粒径分布较大， 不利于控制粒径分布与药物的可 控释放。此外， 这种 zein 微球的溶解性和稳定性较为有限。 0003 在混合醇溶蛋白中， - 玉米醇溶蛋白 （-zein） 组分约占 60%， 它具有丰富自组 装行为， 且为组分单一的大分子， 非常适合作为药物、 营养素等的包裹运输材料。 -zein是 。
9、疏水性的， 接枝上亲水性物质使其变成两亲性醇溶蛋白， 那么这种两亲性的 -zein 就能 够溶于水， 用于提高疏水类药物、 营养素的可控释放和生物利用率。此外， 对更好的利用玉 米资源及农产品的深加工与转化也有着十分重要的意义。 发明内容 0004 本发明为解决现有玉米醇溶蛋白作为药物和营养素的包裹材料， 不利于控制药物 的释放与粒径分布均一的技术问题， 提供了一种mPEG接枝-玉米醇溶蛋白聚合物及其制 备方法。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明的技术方案具体如下 ： 0006 一种 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物， 该聚合物首先由 mPEG 与丁二酸酐反应 制备得到 mPEG。
10、-COOH ； 再由 mPEG-COOH 与 - 玉米醇溶蛋白反应制备得到 mPEG 接枝 - 玉 米醇溶蛋白聚合物 ； 0007 所述 mPEG 的重均分子量为 1KDa 50KDa ； 0008 所述 - 玉米醇溶蛋白的重均分子量为 22KDa 26KDa ； 0009 所述-玉米醇溶蛋白是由下述方法制备得到的 ： 首先将玉米醇溶蛋白溶于N-甲 基吡咯烷酮或二甲基亚砜 ； 再在二氯甲烷或乙醚中反复萃取 ； 最后将萃取后的沉淀物溶于 90% 以上甲醇或乙醇溶液， 离心取上清液， 并用水稀释至浓度 80% 以下， 过滤后的固体用正 己烷或石油醚洗涤， 真空干燥后得到 ； 0010 所述聚合物的。
11、重均分子量为 23KDa 76KDa， 其具体结构如下式所示 ： 0011 说 明 书 CN 103739852 A 4 2/5 页 5 0012 一种 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的制备方法， 该制备方法包括以下步骤 ： 0013 （1） 将 mPEG 溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐， 45 65水浴， 搅拌 3 7h， 在乙醚和二氯甲烷中反复沉淀， 真空过夜， 将得到白色粉末溶于水后， 透析并冻干后得到 mPEG-COOH ； 0014 （2） 将 mPEG-COOH 溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 加入 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳酰二亚胺盐酸盐 （EDC 。
12、HCl） 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， mPEG-COOH、 EDC HCl 和 NHS 的 摩尔比 1:1.2:1.2， 搅拌 3 6h， 将上述混合液缓慢滴加至 -zein 的二甲基亚砜溶液中， mPEG-COOH 与 -zein 的摩尔比为 5:1， 室温搅拌 24 28h， 反应完毕后， 在乙醚和 N- 甲基 吡咯烷酮中反复沉淀， 干燥， 将得到的产物溶于水， 透析并冻干后得到白色mPEG接枝-玉 米醇溶蛋白聚合物。 0015 在上述技术方案中， 步骤 （1） 中所述的搅拌速度为 300 700rpm， 搅拌时间为 5h。 0016 在上述技术方案中， 步骤 （1） 中所述的。
13、反复沉淀的次数为 2 6 次。 0017 在上述技术方案中， 步骤 （1） 中所述的透析时间为两天。 0018 在上述技术方案中， 步骤 （2） 中所述的反复沉淀的次数为 2 6 次。 0019 在上述技术方案中， 步骤 （2） 中所述的透析时间为 1 4 天。 0020 本发明具有以下的有益效果 ： 0021 本发明是对玉米醇溶蛋白进行纯化后得到纯净的 -zein 组分， 再在其上成功接 枝亲水性物质mPEG变成两亲性醇溶蛋白 （附图1， 2可证明） 。 mPEG具有很好的水溶性和生物 相容性， 是美国FDA认证安全的食品、 药品材料， 使它与-zein蛋白发生反应， 可以将mPEG 良好的。
14、水溶性， 转移到结合物上， 使 -zein 能够溶于水并包裹疏水类药物和营养素等。 0022 并且， 本发明方法制备得到的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物溶于水后， 能够 形成稳定存在且尺寸均一的微球 （粒径在 80 100nm） ， 比混合的玉米醇溶蛋白的粒径小， 可提高疏水类药物、 营养素的溶解度和生物利用率。 附图说明 0023 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 0024 图 1 为实施例 1 制备的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的红外光谱图。 0025 图 2 为实施例 1 制备的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物 1H NMR 谱图。 00。
15、26 图 3 为实施例 1 制备的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的粒径分布图。 0027 图 4 为实施例 1 制备的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物的扫描电镜图。 说 明 书 CN 103739852 A 5 3/5 页 6 具体实施方式 0028 一种 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物， 该聚合物首先由 mPEG 与丁二酸酐反应 制备得到 mPEG-COOH ； 再由 mPEG-COOH 与 - 玉米醇溶蛋白反应制备得到 mPEG 接枝 - 玉 米醇溶蛋白聚合物 ； 所述 mPEG 的重均分子量为 1KDa 50KDa ； 所述 - 玉米醇溶蛋白的重 均分子量为 2。
16、2KDa 26KDa ； 0029 所述-玉米醇溶蛋白是由下述方法制备得到的 ： 首先将玉米醇溶蛋白溶于N-甲 基吡咯烷酮或二甲基亚砜 ； 再在二氯甲烷或乙醚中反复萃取 ； 最后将萃取后的沉淀物溶于 90% 以上甲醇或乙醇溶液， 离心取上清液， 并用水稀释至浓度 80% 以下， 过滤后固体用正己 烷或石油醚洗涤， 真空干燥后得到 ； 所得聚合物的重均分子量为 23KDa 76KDa。 0030 所 述 - 玉 米 醇 溶 蛋 白 的 具 体 结 构 请 参 见 （Momany,F.A.,et al.(2006).Structural characterization of alpha-zein。
17、.Journal of Agricultural and Food Chemistry54(2):543-547.） 。 0031 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物具体是由下述方法制备得到的 ： 0032 （1） 将 mPEG 溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐， 45 65水浴， 300 700rpm 搅拌37h， 在乙醚和二氯甲烷中反复沉淀26遍， 真空过夜， 将得到白色粉末溶于水后， 注入到透析袋中， 透析两天， 冻干后得到 mPEG-COOH ； 优选搅拌时间为 5h ； 0033 （2） mPEG-COOH 溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 加入 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基。
18、丙基 ) 碳 酰二亚胺盐酸盐 （EDCHCl） 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， mPEG-COOH、 EDCHCl 和 NHS 的 摩尔比 1:1.2:1.2， 搅拌 3 6h， 将上述混合液缓慢滴加至 -zein 的二甲基亚砜溶液中， mPEG-COOH 与 -zein 的摩尔比为 5:1， 室温搅拌 24 28h， 反应完毕后， 在乙醚中沉淀析 出， 再溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 反复沉淀 2 6 次， 干燥， 得到的产物溶于水， 注入透析袋 中， 透析 1 4 天， 再冻干， 得到白色 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物 （mPEG-zein） 。 合成路线如下 ： 003。
19、4 0035 -zein 的制备实施例 0036 1 份玉米粉溶于 5 份 50 75% 乙醇， 离心取上清液。加水稀释直至不再有蛋白析 出， 过滤后晾干， 得到玉米醇溶蛋白。用正己烷等溶剂去除玉米醇溶蛋白中的油脂， 取 1 份 说 明 书 CN 103739852 A 6 4/5 页 7 脱脂zein溶于30份N-甲基吡咯烷酮中， 在90份的二氯甲烷反复萃取3次去除核黄素。 最 后用90%以上乙醇溶液洗涤， 离心取上清液， 用水稀释至浓度80%以下， 过滤 ； 将过滤的固体 用正己烷洗涤， 真空干燥得到白色 -zein 粉末。 0037 实施例 1 0038 1g mPEG(Mz=1KDa)。
20、溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐。 45水浴， 300rpm搅拌 5h。在乙醚和二氯甲烷中反复沉淀 2 遍， 抽滤后真空过夜。将得到白色粉末溶于水后， 注入 相对分子量为 3500 的透析袋中， 透析两天。冻干后得到 mPEG-COOH。将上述产物溶于 10ml N- 甲基吡咯烷酮中， 加入 0.018gEDCHCl（活化剂） 和 0.027g NHS， 搅拌活化 3h。将上述 混合液缓慢滴加至 1g-zein（Mz=26KDa） 的二甲基亚砜溶液中， 搅拌 28h， 反应完毕后， 在 乙醚中沉淀析出， 再溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 反复 2 次。干燥得到的产物溶于水， 注入截留 分子量。
21、为 30000 的透析袋中， 水中透析 1 天， 冻干后得到 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合 物， 称重， 产率为 64%。 0039 附图 1 为该实施例制备的聚合物的红外图谱， 该图谱显示 ： a.850cm-1两个 CH2CH2O 特征峰， 接枝后的 -zein 上这两个峰先无后有。b.2800cm-1纯化的 -zein 上没有甲基 峰， 接枝后出现甲基的振动峰。说明 mPEG 成功接枝到 -zein。在附图 21H NMR 谱图也进 一步印证。 0040 附图 3 和 4 分别为该实施例制备的聚合物的粒径分布图和扫描电镜图， 将制备 的 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物溶于。
22、水中， 形成胶束， 检测其粒径分布， 动态光散射 （DLS） 结果显示 80nm 左右， 可以看出用 -zein 形成的微球比用混合 zein 的粒径小， 且尺 寸分布均匀 （PDI=0.180.2） ， 有效控制功能因子和药物在摄入人体后的释放时间和速度。 0041 实施例 2 0042 10g mPEG(Mz=25KDa)溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐。 65水浴， 700rpm搅 拌 3h。在乙醚中反复沉淀 4 遍， 抽滤后真空过夜。将得到白色粉末溶于水后， 注入相对分子 量为 35000 的透析袋中， 透析两天。冻干后得到 mPEG-COOH。将上述产物溶于 100ml N- 甲。
23、 基吡咯烷酮中， 加入 0.036g EDCHCl（活化剂） 和 0.054g NHS， 搅拌活化 4h。将上述混合 液缓慢滴加至 1.2g-zein（Mz=22KDa） 的二甲基亚砜溶液中， 搅拌 24h， 反应完毕后， 在乙 醚中沉淀析出， 再溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 反复 4 次。干燥得到的产物溶于水， 注入截留分 子量为 35000 的透析袋中， 水中透析 4 天， 冻干后得到 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物， 称重， 产率为 62%。 0043 实施例 3 0044 100g mPEG(Mz=50KDa) 溶于二氯甲烷中， 加入过量的丁二酸酐。55水浴， 500rpm 搅。
24、拌 7h。在乙醚中反复沉淀 6 遍， 抽滤后真空过夜。将得到白色粉末溶于水后， 注入截留 分子量为 60000 的超滤膜中透析， 透析两天。冻干后得到 mPEG-COOH。将 10g mPEG-COOH、 0.0297g DCC 和 0.01657g NHS 混合并滴加少量三乙胺， 搅拌活化 6h。将上述混合液缓慢滴 加至 0.6g-zein （Mz=22KDa） 的二甲基亚砜溶液中， 室温搅拌 26h。反应完毕后， 在乙醚中 沉淀析出， 再溶于 N- 甲基吡咯烷酮中， 反复 6 次。产物在截留分子量为 60000 的透析袋中 透析 3 天， 冻干后得到 mPEG 接枝 - 玉米醇溶蛋白聚合物。
25、， 称重， 产率为 63%。 0045 显然， 上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例， 而并非对实施方式的限定。 对 于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 说 明 书 CN 103739852 A 7 5/5 页 8 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。 说 明 书 CN 103739852 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103739852 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103739852 A 10 。