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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610046033.9 (22)申请日 2016.01.22 C12P 7/16(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 地址 266071 山东省青岛市市南区南京路 106 号 (72)发明人 叶乃好 张晓雯 徐东 范晓 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11369 代理人 史霞 (54) 发明名称 以海洋藻类为原料生产生物丁醇的方法 (57) 摘要 本发明属于生物工程技术领域， 特别涉及一 种以海洋藻类为原料生产生物丁醇。
2、的方法， 通过 预处理糖化海藻， 得到海藻水解液， 以海藻水解液 为原料生产生物丁醇的方法， 该方法以海藻为原 料经预处理后用于制备发酵培养基， 在 35-40 下连续厌氧发酵 72-120h 以接种发酵生产生物丁 醇。 本发明方法与传统方法相比具有不与人争地、 不与地争粮的优势 ； 本发明方法中应用纤维素酶 对海藻进行糖化预处理， 破除了藻类细胞壁屏障， 实现了对海藻细胞内多糖分解利用， 并且通过本 发明方法克服了海藻处理液中褐藻多酚等对菌体 生长具有抑制作用， 实现和提高了生物丁醇的高 效产出， 对促进海洋藻类生物丁醇生产的产业化 发展、 以及环境保护、 粮食安全保障具有重要意 义。 (5。
3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 CN 105603004 A 2016.05.25 CN 105603004 A 1.一种生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培 养基， 以接种发酵生产生物丁醇。 2.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 以海藻为原料经预处理后用 于制备发酵培养基， 在35-40下连续厌氧发酵72-120h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌 种种子液接种发酵培养基的量占发酵培养基总体积的6-12。 3.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于。
4、， 以海藻为原料经预处理后用 于制备发酵培养基， 在37下连续厌氧发酵72h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌种种子 液接种发酵培养基的量占发酵培养基总体积的10。 4.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 所述海藻的含水量小于等于 2。 5.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 还包括将发酵培养基以装量 为发酵罐体积的55-75加入发酵罐中进行连续厌氧发酵。 6.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 所述海藻预处理的具体方法 包括以下步骤： 6.1)将浓度为50-200g/L的海藻匀浆液固液分离后获得海藻， 向海藻中加入纤维素酶 进行糖化处理。
5、3d获得酶解液， 其中， 纤维素酶的添加量为10-30FPU/g底物； 以及 6.2)将所述酶解液浓缩至原体积一半， 用于制备发酵培养基。 7.如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 所述发酵培养基的具体配制 方法为， 将预处理后的海藻冷却至室温， 之后向其中依次加入硫酸铵磷酸、 二氢钾、 乙酸钠、 磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸铁， 使得发酵培养基中硫酸铵磷酸、 二氢钾、 乙酸钠、 磷 酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸铁的浓度分别为10-20g/L、 2-10g/L、 2-10g/L、 1-1.5g/L、 1-1.5g/L、 0.02-0.04g/L和0.02-0.04。
6、g/L； 之后， 调节pH值为6.5-7.0， 在115-121下灭菌 15-30min， 制得发酵培养基。 8.如权利要求2所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 所述菌种种子液的培养方法 为： 8.1)将菌种接种到一级液体培养基中， 之后将接种有菌种的一级液体培养基在75水 浴10min， 之后将其至于37厌氧培养至一级液体培养基中的菌体生长至OD6000.8时获 得一级菌液； 8.2)将一级菌液转接至二级液体培养基中37厌氧培养至菌体生长至OD6000.2时 停止发酵， 获得菌种种子液； 其中， 一级液体培养基与二级液体培养基的体积比为1:100。 9.如权利要求8所述的生物丁醇的生产。
7、方法， 其特征在于， 所述一级液体培养基为液体 RCM培养基， 所述二级液体培养基为液体CGM培养基。 10.如权利要求1-9中任一项所述的生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 所述菌种为丙 酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC824或者拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiNCIMB8052中的一种或者两种的等体积混合物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105603004 A 2 以海洋藻类为原料生产生物丁醇的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 特别涉及一种以海洋藻类为原料， 通过预处理糖 化海藻， 得到海藻水解液， 以。
8、海藻水解液为原料生产生物丁醇的方法。 背景技术 0002 随着化石能源、 尤其是石油的逐渐枯竭。 以生物能源为主的新型可替代能源的发 展势在必行。 丁醇是一种重要的平台化学品， 主要用于制造增塑剂或用作溶剂、 萃取剂等； 近年来， 研究人员发现丁醇的热值、 辛烷值与汽油相当； 其含氧量与汽油中常用的甲基叔丁 基醚相近； 不会腐蚀管道、 不易吸水， 便于管道输送； 蒸汽压低， 安全性高， 且能与汽油以任 意比混合。 所以， 丁醇已成为被世界各国企业和研究机构强烈关注的一种极具潜力的新型 生物燃料Durre,P.,Biobutanol： anattractivebiofuel.Biotechnol。
9、.J.2007,2, (12), 1525-34.。 其原料和生产工艺与生物乙醇相似， 但生物丁醇的蒸汽压力低， 与汽油混合时 对杂质水的宽容度大， 而且腐蚀性较小， 与现有的生物燃料相比， 能够与汽油达到更高的混 合比(混合燃料中可混入20的丁醇)， 而无需对车辆进行改造。 丁醇还是一种高能量生物 燃料， 与传统燃料相比， 每加仑可支持汽车多走10的路程， 与乙醇相比， 可多走30的路 程。 生物丁醇的发酵原料以农作物为主， 如专利 “一种半连续发酵生产生物丁醇的方法” ， 使 用半连续发酵方法， 以糖丁酸梭菌发酵甘蔗糖蜜、 甜菜糖蜜及木质纤维素水解糖浆等糖质 原料制备生物丁醇过程中的应用，。
10、 存在与人争粮的问题。 专利 “一种以木薯为原料制取燃油 生物丁醇的方法” 介绍了以薯为原料制备生物丁醇的方法， 其又存在与地争粮的问题。 以农 业废弃物为原料生产生物丁醇如专利 “一种稻壳生产生物丁醇的方法” 以及以 “木质纤维素 原料联产生物柴油与生物丁醇的方法” 又有原料分散， 不利于收集等弊端。 以海洋藻类为原 料生产生物能源与传统方法相比具有不与人争地、 不与地争粮的优势。 且拥有丰富的原材 料我国是海藻养殖大国， 据不完全统计， 在18000公里的沿海线上， 我们分别栽培生产了占 全球90、 80以上的海带、 紫菜等经济海藻， 全球海藻总产量为1860万吨， 我国海藻产量 为145。
11、0万吨， 占全球总产量的78。 以海洋藻类生产生物丁醇具有诸多问题。 首先藻类细胞 壁屏障影响细胞内多糖分解利用， 海藻处理液中褐藻多酚等对菌体生长具有抑制作用等。 发明内容 0003 本发明的一个目的是解决至少上述问题， 并提供至少后面将说明的优点。 0004 本发明还有一个目的是提供一种生物丁醇的生产方法， 其能够克服以海洋藻类生 产生物丁醇的诸多问题， 实现以预处理后的海藻为原料制备发酵培养基， 以接种发酵生产 生物丁醇； 0005 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点， 提供了一种生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养基， 以接种发酵生产生物丁醇。。
12、 0006 优选的是， 其中， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养基， 在35-40下连 续厌氧发酵72-120h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌种种子液接种发酵培养基的量占发 说明书 1/7 页 3 CN 105603004 A 3 酵培养基总体积的6-12。 0007 优选的是， 其中， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养基， 在37下连续厌 氧发酵72h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌种种子液接种发酵培养基的量占发酵培养基 总体积的10。 0008 优选的是， 其中， 所述海藻的含水量小于等于2。 0009 优选的是， 其中， 还包括将发酵培养基以装量为发酵罐体积的55-。
13、75加入发酵罐 中进行连续厌氧发酵。 0010 优选的是， 其中， 所述海藻预处理的具体方法包括以下步骤： 0011 6.1)将浓度为50-200g/L的海藻匀浆液固液分离后获得海藻， 向海藻中加入纤维 素酶进行糖化处理3d获得酶解液， 其中， 纤维素酶的添加量为10-30FPU/g底物； 以及 0012 6.2)将所述酶解液浓缩至原体积一半， 用于制备发酵培养基。 0013 优选的是， 其中， 所述发酵培养基的具体配制方法为， 将预处理后的海藻冷却至室 温， 之后向其中依次加入硫酸铵磷酸、 二氢钾、 乙酸钠、 磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸 铁， 使得发酵培养基中硫酸铵磷酸、 二氢钾、。
14、 乙酸钠、 磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸铁 的浓度分别为10-20g/L、 2-10g/L、 2-10g/L、 1-1.5g/L、 1-1.5g/L、 0.02-0.04g/L和0.02- 0.04g/L； 之后， 调节pH值为6.5-7.0， 在115-121下灭菌15-30min， 制得发酵培养基。 0014 优选的是， 其中， 所述菌种种子液的培养方法为： 0015 8.1)将菌种接种到一级液体培养基中， 之后将接种有菌种的一级液体培养基在75 水浴10min， 之后将其至于37厌氧培养至一级液体培养基中的菌体生长至OD6000.8 时获得一级菌液； 0016 8.2)将一级菌液。
15、转接至二级液体培养基中37厌氧培养至菌体生长至OD600 0.2时停止发酵， 获得菌种种子液； 0017 其中， 一级液体培养基与二级液体培养基的体积比为1:100。 0018 优选的是， 其中， 所述一级液体培养基为液体RCM培养基， 所述二级液体培养基为 液体CGM培养基。 0019 优选的是， 其中， 所述菌种为丙酮丁醇梭菌ClostridiumacetobutylicumATCC 824或者拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052中的一种或者两种的等体积混 合物。 0020 本发明至少包括以下有益效果： 0021 本发明方法能够以海洋藻类为原料生产生物能。
16、源丁醇， 其与传统方法相比具有不 与人争地、 不与地争粮的优势； 本发明方法中应用纤维素酶对海藻进行糖化预处理， 破除了 藻类细胞壁屏障， 实现了对海藻细胞内多糖分解利用， 并且通过本发明方法克服了海藻处 理液中褐藻多酚等对菌体生长具有抑制作用， 实现和提高了生物丁醇的高效产出， 对促进 海洋藻类生物丁醇生产的产业化发展、 以及环境保护、 粮食安全保障具有重要意义。 0022 本发明的其它优点、 目标和特征将部分通过下面的说明体现， 部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。 具体实施方式 0023 下面对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文字能够据 。
17、说明书 2/7 页 4 CN 105603004 A 4 以实施。 0024 应当理解， 本文所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 0025 一种生物丁醇的生产方法， 其特征在于， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵 培养基， 以接种发酵生产生物丁醇。 0026 一个优选方案中， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养基， 在35-40下连 续厌氧发酵72-120h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌种种子液接种发酵培养基的量占发 酵培养基总体积的6-12。 0027 一个优选方案中， 以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养。
18、基， 在37下连续 厌氧发酵72h以接种发酵生产生物丁醇， 其中， 菌种种子液接种发酵培养基的量占发酵培 养基总体积的10。 0028 一个优选方案中， 所述海藻的含水量小于等于2。 0029 一个优选方案中， 还包括将发酵培养基以装量为发酵罐体积的55-75加入发酵 罐中进行连续厌氧发酵。 0030 一个优选方案中， 所述海藻预处理的具体方法包括以下步骤： 0031 6.1)将浓度为50-200g/L的海藻匀浆液固液分离后获得海藻， 向海藻中加入纤维 素酶进行糖化处理3d获得酶解液， 其中， 纤维素酶的添加量为10-30FPU/g底物； 以及 0032 6.2)将所述酶解液浓缩至原体积一半，。
19、 用于制备发酵培养基。 0033 优选的是， 其中， 所述发酵培养基的具体配制方法为， 将预处理后的海藻冷却至室 温， 之后向其中依次加入硫酸铵磷酸、 二氢钾、 乙酸钠、 磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸 铁， 使得发酵培养基中硫酸铵磷酸、 二氢钾、 乙酸钠、 磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锰和硫酸铁 的浓度分别为10-20g/L、 2-10g/L、 2-10g/L、 1-1.5g/L、 1-1.5g/L、 0.02-0.04g/L和0.02- 0.04g/L； 之后， 调节pH值为6.5-7.0， 在115-121下灭菌15-30min， 制得发酵培养基。 0034 一个优选方案中， 所述。
20、菌种种子液的培养方法为： 0035 8.1)将菌种接种到一级液体培养基中， 之后将接种有菌种的一级液体培养基在75 水浴10min， 之后将其至于37厌氧培养至一级液体培养基中的菌体生长至OD6000.8 时获得一级菌液； 0036 8.2)将一级菌液转接至二级液体培养基中37厌氧培养至菌体生长至OD600 0.2时停止发酵， 获得菌种种子液； 0037 其中， 一级液体培养基与二级液体培养基的体积比为1:100。 0038 一个优选方案中， 所述一级液体培养基为液体RCM培养基， 所述二级液体培养基为 液体CGM培养基。 0039 一个优选方案中， 所述菌种为丙酮丁醇梭菌Clostridiu。
21、macetobutylicumATCC 824或者拜氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052中的一种或者两种的等体积混 合物。 0040 下面结合具体实施例对本发明实施过程作详尽描述： 0041 实施例1 0042 海藻预处理糖化： 将浓度为180g/L的海藻匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取 固体部分进行糖化， 纤维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天。 酶解液使用抽滤、 离心 说明书 3/7 页 5 CN 105603004 A 5 固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半； 0043 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料。
22、,加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵10.8g/L， 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 及 1.1g/L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二 氢钾含量为1.2g/L， 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液 中硫酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L， 加入硫酸铁直至 水解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵培 养基； 0044 海藻水解液发酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 。
23、积的71.4， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum ATCC824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平 板上挑取ClostridiumacetobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基 (RCM培养基： 酵母膏3g， 牛肉膏l0g， 蛋白胨10g， 可溶性淀粉lg， 葡萄糖5g,半胱氨酸盐酸盐 0.5g， NaCl3g， NaAc3g,水1000mL,pH8.5， 刃天青3mg/L,121湿热灭菌30min。 )中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后37厌氧培养；。
24、 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基(CGM培养基： KH2PO40.05g， K2HPO40.05g， MgSO40.4g， NaCl1.0g， Asparagine2.0g， YeastExtract5.0g， (NH4)2SO42.0g， NaAc5.0g,Glucose75g FeSO4.7H2O0.01gMnSO4.H2O0.01g水l000mL,pH8.5， 121湿热灭菌30min。 )中37厌 氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子液即成)， 种子液的接种量为 发酵水解液培养基体积的10， 在37厌氧发酵72小。
25、时， 即成。 0045 发酵结果： 经72小时发酵后， 产生丁醇28.78g/L 0046 表1巨藻化学成分 0047 0048 巨藻中可作为发酵底物的碳水化合物总量较高， 但其中褐藻胶、 及半纤维素水解 物通常不能被发酵菌株利用。 纤维素、 褐藻淀粉水解产物及甘露醇是发酵的主要原料。 0049转化率计算： 0050 70L发酵罐装液量50L， 所用巨藻为18Kg， 其中总糖为8 .122Kg， 丁醇产量为 1.439Kg， 因此， 单位丁醇产量为17.7。 0051 实施例2 0052 海藻预处理糖化： 将浓度为90g/L的紫菜匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取 固体部分进行糖化， 纤。
26、维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天。 酶解液使用抽滤、 离心 固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半； 说明书 4/7 页 6 CN 105603004 A 6 0053 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料， 加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵5.4g/L， 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 1.1g/ L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾 含量为1.2g/L， 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液中硫 酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液中硫。
27、酸锰含量为0.02g/L以及加入硫酸铁直至 水解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵培 养基； 0054 海藻水解液发酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 积的55， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumATCC 824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平板上挑 取ClostridiumacetobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后37厌。
28、氧培养； 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37厌氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子 液即成)， 种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10， 在35厌氧发酵72小时， 即成。 0055 发酵结果： 经60小时发酵后， 产生丁醇11.74g/L， 丁醇产率为14.5。 0056 实施例3 0057 海藻预处理糖化： 将浓度为120g/L的裙带菜匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取固体部分进行糖化， 纤维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天， 酶解液使用抽滤、 离 心固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半；。
29、 0058 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料,加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵5.4g/L， 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 1.1g/ L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾 含量为1.2g/L， 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液中硫 酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L， 及加入硫酸铁直至水 解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵培养 基； 0059 海藻水解液发。
30、酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 积的65， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumATCC 824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平板上挑 取ClostridiumacetobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后37厌氧培养； 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37厌氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子 液即成)， 种子。
31、液的接种量为发酵水解液培养基体积的10， 在38厌氧发酵96小时， 即成。 0060 发酵结果： 经120小时发酵后， 产生丁醇18.55g/L， 丁醇产率为18.3。 0061 实施例4 0062 海藻预处理糖化： 将浓度为150g/L的海带匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取 固体部分进行糖化， 纤维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天， 酶解液使用抽滤、 离心 固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半； 0063 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料,加入硫酸铵直 说明书 5/7 页 7 CN 105603004 A 7 至水解液中硫酸铵7.2g/L，。
32、 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 1.1g/L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二 氢钾含量为1.2g/L， 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液 中硫酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L， 及加入硫酸铁直 至水解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵 培养基； 0064 海藻水解液发酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 积的70， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(。
33、ClostridiumacetobutylicumATCC 824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平板上挑 取ClostridiumacetobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后37厌氧培养； 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37厌氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子 液即成)， 种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10， 在37厌氧发酵72小时， 即成。 0065 发酵结果： 经84小时发酵后， 。
34、产生丁醇12.38g/L， 丁醇产率为13.9。 0066 实施例5 0067 海藻预处理糖化： 将浓度为50g/L的泡叶藻匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取固体部分进行糖化， 纤维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天， 酶解液使用抽滤、 离 心固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半； 0068 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料,加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵2.4g/L， 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 1.1g/ L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾 含量为1.2g/L，。
35、 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液中硫 酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L， 及加入硫酸铁直至水 解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵培养 基； 0069 海藻水解液发酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 积的60， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumATCC 824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平板上挑 取Clostridiumac。
36、etobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后37厌氧培养； 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37厌氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子 液即成)， 种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10， 在40厌氧发酵84小时， 即成。 0070 发酵结果： 经96小时发酵后， 产生丁醇6.62g/L， 丁醇产率为16.5 0071 实施例6 0072 海藻预处理糖化： 将浓度为150g/L的巨藻匀浆液预处理后抽滤、 离心固液分离， 取 固体部分进行糖化。
37、， 纤维素酶添加量为15FPU/g底物， 酶解处理3天， 酶解液使用抽滤、 离心 固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半； 0073 发酵培养基配制： 待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料,加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵10.8g/L， 加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， 说明书 6/7 页 8 CN 105603004 A 8 1.1g/L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L， 加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二 氢钾含量为1.2g/L， 加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1.1g/L， 加入硫酸镁直至水解液 中硫酸镁含量为0.4g/L， 加入硫酸锰直至水解液。
38、中硫酸锰含量为0.02g/L， 及加入硫酸铁直 至水解液中硫酸铁含量为0.02g/L， 用氨水调节pH值为6.8， 在121灭菌20分钟， 制成发酵 培养基； 0074 海藻水解液发酵： 将配制好的培养基转入70L发酵罐中， 培养基的装量为发酵罐体 积的75， 无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(ClostridiumacetobutylicumATCC 824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程： 首先在平板上挑 取ClostridiumacetobutylicumATCC824， 的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中， 并在 75水浴中热激10分钟， 然后。
39、37厌氧培养； 当菌体生长至OD6000.8时， 将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37厌氧培养作为种子液； 当种子液菌体生长至OD6000.2时， 种子 液即成)， 种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10， 在37厌氧发酵72小时， 即成。 0075 发酵结果： 经72小时发酵后， 产生丁醇23.28g/L， 丁醇产率为17.2 0076 本实施例与实施例6的区别在于： 所用发酵菌种为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckiiNCIMB8052购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。 0077 发酵结果： 经72小时发酵后， 产生丁醇15.8g/L。 0078 实。
40、施例8 0079 本实施例与实施例6的区别在于： 步骤( 4 )， 所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌 (ClostridiumacetobutylicumATCC824， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)和拜 氏梭菌ClostridiumbeijerinckiiNCIMB8052， 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心) 等体积混合物。 0080 发酵结果： 经72小时发酵后， 产生丁醇1.70g/L。 0081 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。 说明书 7/7 页 9 CN 105603004 A 9 。