技术领域
本发明属于保健食品技术领域，尤其是一种由红曲霉液态发酵法生产高纯度红曲 素和红曲黄素的方法。
背景技术
红曲是我国传统、特色的出口产品，我国对红曲色素的应用也有了千年的历史。近 年来的研究发现，除了作为食品着色剂外，红曲色素还具有消炎、抗氧化、抑菌、降胆固醇、 抗突变和抗肿瘤等生物活性，也可用于制备太阳能电池与生物印染等，具有非常广阔的应 用前景。其中的黄色素--红曲素和红曲黄素更是被证明具有抗癌、抗炎、抑制肿瘤细胞等作 用而受到广泛关注。
在红曲色素中，一般同时包含红、橙、黄三种色素，其相似的结构、相近的极性给色 素的分离精制带来了困难，特别是橙色素的存在，会严重干扰黄色素的分离精制，因此，红 曲素和红曲黄素的市场售价高，且少有其纯品，限制了它们的应用与推广。因此，制备高纯 度的红曲素和红曲黄素不仅可以满足食品工业对天然、无毒黄色素的需求，还可以为这两 种色素的生物活性研究做出贡献。
近年来，对红曲色素进行分离和纯化的研究中，多采用乙醇为提取溶剂，而乙醇对 色素的提取没有专一性，增加了纯化的难度；崔莉等[1]利用高效液相色谱法对红曲色素进 行了分离。郑允权等[2]采用高速逆流色谱法分离纯化红曲色素。这些研究在纯化方法上，均 采用单级精制的方法，橙色素和黄色素的分离效果不明显。
通过对比，本发明方法通过采用正己烷等极性较小的溶剂从红曲发酵物中较为专 一地提取黄色素，再利用硅胶色谱对粗提物预分离，避免了橙色素对黄色素分离的干扰，然 后用高速逆流色谱对黄色素预分离物进行精制，降低了分离难度，且该方法在技术路线上 更为简单、高效。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种由红曲霉液态发酵法生产 高纯度红曲素和红曲黄素的方法，该方法通过采用极性较小的正己烷从红曲发酵物中较为 专一地提取黄色素，再利用硅胶色谱对粗提物进行预分离，避免了橙色素对黄色素分离的 干扰，然后用高速逆流色谱对黄色素预分离物进行精制，降低了分离难度，采用该方法制备 的红曲素与红曲黄素具有成本低、纯度高、安全无毒等特点。
本发明解决上述问题所采用的技术方案如下：
一种由红曲霉液态发酵法生产高纯度红曲素和红曲黄素的方法，步骤如下：
⑴种子培养：将红曲霉菌株接种到灭菌后的种子培养基中，在20-35℃摇床中培养 1-4d，得种子液；
⑵发酵：将步骤⑴中培养好的种子液以3％--8％(v/v)的比例接种到发酵培养基 中，30℃摇瓶培养6d，得到发酵液；
⑶离心：将发酵液离心，离心条件为3500r/min，离心20min，得到发酵物沉淀；
⑷干燥：将发酵物沉淀在40-60℃下烘干至恒重，得到干燥的发酵物；
⑸粉碎：将干燥的发酵物用研钵磨碎，过100目筛，得到干燥的发酵物粉末；
⑹超声波辅助提取：将干燥的发酵物粉末加入正己烷，进行超声波辅助提取，料液 比为1:20-120g：mL，提取1-4次，超声波功率为50-100W，提取15-45min，得正己烷粗提物；
⑺粗提物浓缩：将正己烷粗提物在40℃下真空浓缩，得浓缩液；
⑻预分离：将浓缩液用硅胶色谱柱进行预分离，得到黄色洗脱液，所述预分离的柱 分离条件具体为：100目细度的硅胶树脂作为固定相，流动相为正己烷和乙酸乙酯，所述正 己烷：乙酸乙酯的体积比为2-8:1；
⑼浓缩：将黄色洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到色素粉末；
⑽精制：配制高速逆流色谱上下相，静置分层，所述上下相由正己烷：甲醇：水的体 积比10:2.5-9:7.5-1配制而成，将色素粉末用5mL的上相和5mL的下相溶解，用高速逆流色 谱对红曲素和红曲黄素进行精制，检测波长为405nm，收集0-200min洗脱液，得到红曲素和 红曲黄素；
⑾干燥：将红曲素和红曲黄素洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，即得高纯度红 曲素和红曲黄素。
而且，所述步骤⑴中种子培养基为：葡萄糖6g，蛋白胨2g，NaNO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，自来水100mL。
而且，所述步骤⑵中发酵培养基为：大米粉5g，NaNO30.3g，MgSO4·7H2O0.1g， KH2PO40.15g，自来水100mL。
而且，所述步骤⑹中超声波辅助提取的最佳提取条件为：超声波辅助提取料液比 为1:90(g：mL)、提取3次、超声波功率为100W、提取15-45min。
而且，所述超声波辅助提取的最佳提取条件的确定方法如下：
以405nm波长下的吸光度作为评价指标，通过单因素试验和响应面实验得到正己 烷超声辅助提取黄色素的最佳条件；
⑴单因素实验
①提取时间对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，放入10mL离心管中，加入5mL正己烷；分别于100W 超声波辅助条件下提取15min，30min，45min，60min；3500r/min，离心20min；取上清液，定容 至5mL，稀释30倍后，分别测定405nm下的吸光度，重复3次，求其平均值；
②提取次数对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入4支10mL离心管中，各加入5mL正己烷； 100W超声波辅助条件下提取30min，3500r/min，离心20min取清液，作为一次提取；分别对上 述4支离心管中的红曲菌丝粉末提取1次、2次、3次和4次，合并相应试管的提取液，稀释适当 倍数，使吸光度数值在0.2～0.8之间，测定此时405nm的吸光度值；重复3次，求其平均值；
③液料比对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入6支10mL离心管中，分别加入20、40、60、 80、100、120倍体积的正己烷；于100W超声波辅助条件下提取30min；此后3500r/min离心 20min；取上清液，定容至10mL，稀释30倍，分别测定405nm波长下的吸光度，每个时间条件重 复3次；
④提取功率对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入3支10mL离心管中，各加入5mL正己烷；盖 上离心管盖子后分别于90W、70W、50W超声波辅助条件下提取30min；3500r/min，离心 20min；取上清液，定容至5mL，稀释30倍后，分别测定405nm下的吸光度，重复3次；
⑵Box-Behnken实验
Box-Benhnken设计法可通过实验设计，最终得到回归方程并进行分析来寻求最优 的组合，从而解决多变量问题的统计学方法；以提取时间、料液比和提取次数三个因素为自 变量，利用DesignExpert8.0.6设计三因素三水平响应面试验，得到利用正己烷为提取剂 提取红曲菌丝体中黄色素的最优条件，即超声波辅助提取料液比为1:90(g：mL)、提取3次、 超声波功率为100W、提取15-45min。
而且，所述步骤⑻中的预分离的柱分离的最佳条件为：100目细度的硅胶树脂作为 固定相，流动相为正己烷和乙酸乙酯，所述正己烷：乙酸乙酯的体积比为4:1。
而且，所述预分离的柱分离的最佳条件的确定方法如下：
(1)在薄层展开缸中分别配制正己烷-乙酸乙酯2：1、4：1、6：1、8：1的展开剂；取正 己烷提取物在薄层板上毛细管点样，待溶解色素的乙醇挥发后，将薄层板置于展开缸中，当 展开剂的液面将要到达层析板顶端时，将层析板取出，置于阴凉通风处使乙醇挥发，通过自 然光和三用紫外分析仪，根据色素的分离情况，计算相应色素的比移值；当流动相比例为正 己烷-乙酸乙酯2：1时，其极性偏大，橙色素和黄色素几乎同时被洗脱，且拖尾严重；当流动 相比例为正己烷-乙酸乙酯6：1时，橙色素和黄色素虽然能分开，但其展开速度太慢，而在柱 分离中，展开速度慢会耗费较多的流动相，由于利用硅胶色谱只是对色素进行预分离，不需 要很精准地分离，故最终选择流动相为正己烷-乙酸乙酯4：1；
(2)硅胶色谱预分离
用正己烷提取1g红曲霉菌粉，然后将正己烷浓缩干燥；利用100目细度的硅胶吸附 树脂，对红曲霉正己烷粗提物进行预分离；收集并检测不同时间段洗脱液的组分，同时以乙 腈作为空白对照；1、2、3号棕色瓶中的洗脱液分别对应100-200mL，200-350mL，350mL-500mL 的洗脱液，其液相检测时分别设置红色素、橙色素、黄色素三类色素的最适检测条件，检测 波长分别为540nm、480nm、390nm，参比波长分别为350nm、330nm、270nm；通过洗脱液和空白 溶液的对比，证明红曲霉菌丝体的正己烷粗提物经过100目细度的硅胶色谱柱分离后，收集 到的黄色组分主要为红曲素和红曲黄素。
而且，所述步骤⑽中上下相由正己烷：甲醇：水的体积比10:7:3配制而成。
而且，所述步骤⑽的具体步骤如下：
⑴黄色素在正己烷-甲醇-水分离体系中分配率k值的测定
选用体系：正己烷-甲醇-水；
配制原则：保证上下相的最终体积相近，因比之正己烷，水和甲醇极性相近，故保 持正己烷体积不变，调整甲醇和水的配比，最终使甲醇和水的总体积加和与正己烷的体积 相近，这样可以保证在分离体系配制过程中上下相体积相近，从而避免有机溶剂的浪费，同 时又能全面调整分离体系的极性；
在10mL离心管中按照比例配制上下相，充分混合，待分层后分别取4mL上相和下 相，分别装入另外两个干净的10mL离心管中；将少量的色素粗提物固体加入下相，超声波处 理，完全溶解后取1mL，用HPLC检测黄、橙色素含量，分别记为C11、C12；在剩余的含有色素的 下相中加入3L的上相；充分混合后再取1mL下相，用HPLC检测，含量记为C21，C22；
当上下相平衡后，色素在上下相的分配系数＝色素在上相中的含量/色素在下相 中的含量；即色素在两相中分配率k＝(C1n-C2n)/C1n×100％(n＝1或n＝2)；
按照上述方法测定红曲素、红斑素、红曲黄素和红曲红素在不同上下相中的分配 比，利用高速逆流色谱对混合物进行分离时，理论上，k值在0.95～1.5时能够达到最优的分 离效果，得到上下相由正己烷：甲醇：水的体积比10:7:3配制而成为最优；
用5mL上相和5mL下相将其溶解后，用HSCCC进行分离；
⑵高速逆流色谱的分离
①高速逆流色谱上下相的配制
将特定体积比的三种试剂加入大烧杯中，用玻璃棒充分搅拌后用封口膜封口，静 置，使其分层；体系平衡后倒出上相，上下相分层的部分利用分液漏斗静置后将上下相分 开；选取上相为固定相，下相为流动相，分别超声脱气30min，小心移动，以免混入气泡；
②高速逆流色谱的准备
依次打开电脑、循环水浴系统、逆流色谱主机及检测器；保证电源、信号线稳固，管 路封闭；设定温度为25℃，检测波长为405nm；
开启泵，以10mL/min的速度泵入固定相，当固定相从管路的出柱口流出后停泵；切 换泵头，将其插入流动相中，调节逆流色谱主机转速，选择FWD模式，转速缓慢调至900r/ min，待主机转速稳定后，以2mL/min的速度泵入下相；
③样品的分离及收集
当HSCCC准备妥当后，将要分离的样品色素粉末用5mL上相和5mL下相的混合液进 行溶解，超声波辅助溶解，至无明显颗粒为止；若有明显颗粒，则将混合物用0.45μm有机滤 膜过滤，装入干净的20mL注射器中；
将混合液in口和out口分别插入进样注射器和空注射器，停泵；将六通阀手柄快速 拨到load档；推动空注射器，至进样注射器中液面上升，且没有气泡，将样品圈尾部的气体 排尽，拉动空注射器，将进样注射器中的样品吸入定量环；
将六通阀手柄拨至inject档位，开泵，同时开启HSCCC电脑软件和自动收集器，检 测波长为405nm，收集0-200min洗脱液，得到红曲素和红曲黄素。
本发明的优点和有益效果为：
1.本方法通过采用极性较小的正己烷从红曲发酵物中较为专一地提取黄色素，尽 量减少了红、橙色素对黄色素分离的干扰，提高了红曲霉发酵法生产得到的红曲素和红曲 黄素的纯度。
2.本方法利用硅胶色谱对粗提物预分离，将极性十分接近的橙、黄色素分开，避免 了橙色素对黄色素分离的干扰。
3.本方法使用高速逆流色谱对黄色素预分离物进行精制，降低了分离难度，同时， 采用该方法制得的红曲素及红曲黄素成本低、纯度高、安全无毒，可以实现红曲素和红曲黄 素的高效、廉价制备，制得的红曲素与红曲黄素，经面积归一化法计算，纯度可达99％以上。
附图说明
图1为本发明中1号瓶洗脱液液相色谱检测结果图；
图2为本发明中2号瓶洗脱液液相色谱检测结果图；
图3为本发明中3号瓶洗脱液液相色谱检测结果图；
图4为本发明中空白洗脱液液相色谱检测结果图；
其中，在图1-图4中，上图均为样品在红曲红色素的检测条件下(检测波长540nm， 参比波长350nm)的检测结果图；中图为样品在红曲橙色素的检测条件下(检测波长480nm， 参比波长330nm)的检测结果图；下图为在红曲黄色素的检测条件下(检测波长390nm，参比 波长270nm)的检测结果图；
图5为本发明中四种色素的光谱图；其中，图5-1为红曲素(Monascin，黄色)的光谱 图；图5-2为红斑素(Rubropunetatin，橙色)的光谱图；图5-3为红曲黄素(Ankaflavin，黄 色)的光谱图；图5-4为红曲红素(Monascorubrin，橙色)的光谱图；
图6为本发明中硅胶柱预分离后HSCCC的分离结果图；
图7为本发明中26号收集管液相色谱检测结果图；
图8为本发明中32号收集管液相色谱检测结果图；
图9为本发明中51号收集管液相色谱检测结果图；
图10为本发明中63号收集管液相色谱检测结果图；
图11为本发明中Monascin标品和纯化品液相色谱图对比图；
图12为本发明中纯化Ankaflavin的质谱图；
图13为本发明中提取时间对红曲黄素的提取效果的影响图；
图14为本发明中提取次数对红曲黄素的提取效果的影响图；
图15为本发明中溶剂使用量对红曲黄素的提取效果的影响图；
图16为本发明中超声波功率对红曲黄色素提取效果的影响图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本发明中所使用 的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂。
本发明中所使用的红曲霉为M9或红曲霉M3或其它红曲霉，所述红曲霉为M9文章 (Stimulatoryeffectsofbluelightonthegrowth,monascinandankaflavin productioninMonascus，BiotechnolLett(2015)37:1043–1048DOI10.1007/s10529- 014-1763-3，ChangluWang，DiChen，MianhuaChen，YurongWang，ZhenjingLi，engjuan Li；或者，Optimizationofsubmergedfermentationmedium，forcitrinin-free monascinproductionbyMonascus，PreparativeBiochemistryandBiotechnology，Di Chen,YuanXue,MianhuaChen,ZhenjingLi&ChangluWang；或者，Effectsofbluelight onpigmentbiosynthesisofMonascus，JournalofMicrobiology(2016)Vol.54,No.4, pp.305–310，DOI10.1007/s12275-016-6011-1，DiChen,ChunmaoXue,MianhuaChen, ShufenWu,ZhenjingLi,andChangluWang)中所公开的，所述红曲霉M3为专利公开文献 (CN201110065942.4，具有高效胆固醇降解能力的红曲霉M3菌株)中所公开的。
实施例1
一种由红曲霉M3液态发酵法生产高纯度红曲素和红曲黄素的方法，步骤如下：
①种子培养：将红曲霉M3菌株接种到灭菌后的种子培养基中，30℃摇床中培养3d， 得种子液；
所述种子培养基为：葡萄糖6g，蛋白胨2g，NaNO31g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41g，自 来水100mL；
②发酵：将步骤⑴中培养好的种子液以5％(v/v)的比例接种到发酵培养基中，30 ℃摇瓶培养6d，得到发酵液；
所述发酵培养基为：大米粉5g，NaNO30.3g，MgSO4·7H2O0.1g，KH2PO40.15g，自来水 100mL；
③离心：将发酵液离心，离心条件为3500r/min，离心20min，得到发酵物沉淀；
④干燥：将发酵物沉淀在60℃下烘干至恒重，得到干燥的发酵物；
⑤粉碎：将干燥的发酵物用研钵磨碎，过100目筛，得到干燥的发酵物粉末；
⑥超声波辅助提取：将干燥的发酵物粉末加入正己烷，超声波辅助提取，料液比为 1:20-120g：mL，提取1-4次，超声波功率为50-100W，提取15-45min，得到正己烷粗提物；
⑦粗提物浓缩：将正己烷粗提物在40℃下真空浓缩，得到浓缩液；
⑧预分离：将浓缩液用硅胶色谱柱进行预分离，得到黄色洗脱液，所述预分离的柱 分离条件具体为：100目细度的硅胶树脂作为固定相，流动相为正己烷和乙酸乙酯，所述正 己烷：乙酸乙酯的体积比为2-8:1；
⑨浓缩：将黄色洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到色素粉末；
⑩精制：配制高速逆流色谱上下相，静置分层，所述上下相由正己烷：甲醇：水的体 积比10:2.5-9:7.5-1配制而成(例如，上述上下相具体的配制如下：将正己烷、甲醇及水倒 入一个的大烧杯中，最终形成由三种溶剂组成的两相溶液，也就是将三种溶剂倒在一起后 最终分为上下两层，在上面的就叫做上相，下面的叫做下相。上下相中都既有正己烷也有甲 醇也有水，根据各个组分的特性，上相中含有的正己烷比较多，下相中含有的甲醇和水比较 多)，将色素粉末用5mL的上相和5mL的下相溶解，用高速逆流色谱对红曲素和红曲黄素进行 精制，检测波长为405nm，收集0-200min洗脱液，得到红曲素和红曲黄素；
⑾干燥：将红曲素和红曲黄素洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到高纯度红 曲素和红曲黄素。
实施例2
一种由红曲霉M9液态发酵法生产高纯度红曲素和红曲黄素的方法，步骤如下：
①种子培养：将红曲霉M9菌株接种到灭菌后的种子培养基中，20℃摇床中培养4d， 得种子液；
所述种子培养基为：葡萄糖6g，蛋白胨2g，NaNO31g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41g，自 来水100mL；
②发酵：将步骤⑴中培养好的种子液以3％(v/v)的比例接种到发酵培养基中，30 ℃摇瓶培养6d，得到发酵液；
所述发酵培养基为：大米粉5g，NaNO30.3g，MgSO4·7H2O0.1g，KH2PO40.15g，自来水 100mL；
③离心：将发酵液离心，离心条件为3500r/min，离心20min，得到发酵物沉淀；
④干燥：将发酵物沉淀在40℃下烘干至恒重，得到干燥的发酵物；
⑤粉碎：将干燥的发酵物用研钵磨碎，过100目筛，得到干燥的发酵物粉末；
⑥超声波辅助提取：将干燥的发酵物粉末加入正己烷，超声波辅助提取，料液比为 1:20-120g：mL，提取1-4次，超声波功率为50-100W，提取15-45min，得到正己烷粗提物；
⑦粗提物浓缩：将正己烷粗提物在40℃下真空浓缩，得到浓缩液；
⑧预分离：将浓缩液用硅胶色谱柱进行预分离，得到黄色洗脱液，所述预分离的柱 分离条件具体为：100目细度的硅胶树脂作为固定相，流动相为正己烷和乙酸乙酯，所述正 己烷：乙酸乙酯的体积比为2-8:1；
⑨浓缩：将黄色洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到色素粉末；
⑩精制：配制高速逆流色谱上下相，静置分层，所述上下相由正己烷：甲醇：水的体 积比10:2.5-9:7.5-1配制而成(例如，上述上下相具体的配制如下：将正己烷、甲醇及水倒 入一个的大烧杯中，最终形成由三种溶剂组成的两相溶液，也就是将三种溶剂倒在一起后 最终分为上下两层，在上面的就叫做上相，下面的叫做下相。上下相中都既有正己烷也有甲 醇也有水，根据各个组分的特性，上相中含有的正己烷比较多，下相中含有的甲醇和水比较 多)，将色素粉末用5mL的上相和5mL的下相溶解，用高速逆流色谱对红曲素和红曲黄素进行 精制，检测波长为405nm，收集0-200min洗脱液，得到红曲素和红曲黄素；
⑾干燥：将红曲素和红曲黄素洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到高纯度红 曲素和红曲黄素。
实施例3
一种由红曲霉液态发酵法生产高纯度红曲素和红曲黄素的方法，步骤如下：
1.发酵物粉末的制备
(1)种子培养：将红曲霉菌株接种到灭菌后的如下种子培养基中，所述培养基为： 葡萄糖6g、蛋白胨2g、NaNO31g、MgSO4·7H2O0.5g、KH2PO41g，自来水100mL，在30℃下摇瓶培 养3d。
(2)发酵：将步骤(1)中培养好的种子液以5％(v/v)的比例接种到以下发酵培养基 中，所述培养基为：大米粉5g，NaNO30.3g，MgSO4·7H2O0.1g，KH2PO40.15g，自来水100mL，30 ℃摇瓶培养6d，得到发酵液。
(3)离心：将步骤(2)中培养好的发酵液进行离心，离心条件为3500r/min，离心 20min，得到发酵物沉淀。
(4)干燥：将所得的发酵物沉淀在60℃下烘干至恒重，得到干燥的发酵物。
(5)粉碎：将干燥的发酵物用研钵磨碎，过100目筛，得到干燥的发酵物粉末。
2.确定最佳提取条件
以405nm波长下的吸光度作为评价指标，通过单因素试验和响应面实验得到正己 烷超声辅助提取黄色素的最佳条件。超声波辅助提取料液比为1:90(g：mL)，提取3次，超声 波功率为100W，提取15-45min。
(1)单因素实验
①提取时间对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，放入10mL离心管中，加入5mL正己烷。分别于100W 超声波辅助条件下提取15min，30min，45min，60min。3500r/min，离心20min。取上清液，定容 至5mL，稀释30倍后，分别测定405nm下的吸光度，重复3次，求其平均值。结果见图13，随着提 取时间的增加，黄色素提取量大致呈先升高后降低的趋势，在提取时间30min左右处可达到 最大值。因此，可在30min左右对正己烷提取黄色素的结果进行优化。
②提取次数对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入4支10mL离心管中，各加入5mL正己烷。 100W超声波辅助条件下提取30min，3500r/min，离心20min取清液，作为一次提取。分别对上 述4支离心管中的红曲菌丝粉末提取1次、2次、3次和4次，合并相应试管的提取液，稀释适当 倍数，使吸光度数值在0.2～0.8之间，测定此时405nm的吸光度值。重复3次，求其平均值。结 果见图14，其中1，2，3分别为正己烷提取红曲霉菌丝1次、2次、3次时，溶液稀释30倍时的吸 光度，4为提取4次后的溶液折算成稀释30倍时的吸光度。由此可见，在液料比100：1、100W超 声辅助提取30min的提取条件下，从第四次开始时提取液的吸光度明显下降，说明此时黄色 素提取接近完全。故选择2、3、4次作为正己烷提取黄色素的变量对提取结果进行优化。
③液料比对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入6支10mL离心管中，分别加入20、40、60、 80、100、120倍体积的正己烷。于100W超声波辅助条件下提取30min。此后3500r/min离心 20min。取上清液，定容至10mL，稀释30倍，分别测定405nm波长下的吸光度，每个时间条件重 复三次。结果见图15，图中测定值均为折算成稀释30倍时的结果。由此可见，随着提取溶剂 使用量的增大，色素的提取量也随之升高，考虑溶剂的使用量和后期浓缩蒸发的成本，选择 100倍左右正己烷量可使提取效果达到一个较好的水平。
④提取功率对正己烷提取黄色素的影响
准确称取0.050g红曲菌丝粉末，分别放入3支10mL离心管中，各加入5mL正己烷。盖 上离心管盖子后分别于90W、70W、50W超声波辅助条件下提取30min。3500r/min，离心20min。 取上清液，定容至5mL，稀释30倍后，分别测定405nm下的吸光度，重复3次。结果如图16所示， 在50-100W范围内，功率对正己烷提取红曲黄色素的影响不大，故在以后的分离提取过程中 不考虑功率对提取黄色素的影响。
(2)Box-Behnken实验
Box-Benhnken设计法可通过实验设计，最终得到回归方程并进行分析来寻求最优 的组合，从而解决多变量问题的统计学方法。以提取时间、料液比和提取次数三个因素为自 变量，利用DesignExpert8.0.6设计三因素三水平响应面试验，以期得到一个利用正己烷 为提取剂提取红曲菌丝体中黄色素的最优条件，即超声波辅助提取料液比为1:90(g：mL)、 提取3次、超声波功率为100W、提取15-45min。
具体的Box-Behnken实验设计及相关检测结果见表1和表2。
表1Box-Behnken实验设计及实验结果表
表2Box-Behnken实验回归模型方差分析表
通过对实验数据进行二次多项回归拟合，获得红曲色素在405nm下的响应值对因 变量的多元回归方程为：Y＝0.77+0.12A+0.15B+0.070C-0.084B2。在液料比、提取时间和提 取次数三个变量中，优先选择最小液料比、最小提取时间和最少提取次数。得到正己烷提取 黄色素完全时的提取条件为：液料比89.8，提取次数2.89，提取时间15min，预期吸光度为 0.62543。取整之后，确定最优提取条件为液料比90：1，提取三次，提取时间为15min。(采用 响应面试验仅仅是为了确定最佳的提取条件，并不是只看几个因素之间的交互作用)。
将干燥的发酵物粉末加入正己烷，进行超声波辅助提取，料液比为1:90(g：mL)、提 取3次、超声波功率为100W、提取15-45min，得正己烷粗提物；
将正己烷粗提物在40℃下真空浓缩，得浓缩液。
3.硅胶色谱对色素的预分离
(1)薄层色谱确定分离条件
在薄层展开缸中分别配制正己烷-乙酸乙酯2：1、4：1、6：1、8：1的展开剂。取正己烷 提取物在薄层板上毛细管点样，待溶解色素的乙醇挥发后，将薄层板置于展开缸中，当展开 剂的液面将要到达层析板顶端时，将层析板取出，置于阴凉通风处使乙醇挥发，通过自然光 和三用紫外分析仪，根据色素的分离情况，计算相应色素的比移值(Rf值)。其结果如表3所 示，从表3中可以看出，当流动相比例为正己烷-乙酸乙酯(2：1)时，其极性偏大，橙色素和黄 色素几乎同时被洗脱，且拖尾严重；当流动相比例为正己烷-乙酸乙酯(6：1)时，橙色素和黄 色素虽然能分开，但是其展开速度太慢，而在柱分离中，展开速度慢会耗费较多的流动相， 由于利用硅胶色谱只是对色素进行预分离，不需要很精准地分离，故最终选择流动相为正 己烷-乙酸乙酯(4：1)。
(2)硅胶色谱预分离
用正己烷提取1g红曲霉菌粉，然后将正己烷浓缩干燥。利用100目细度的硅胶吸附 树脂，对红曲霉正己烷粗提物进行预分离。收集并检测不同时间段洗脱液的组分，同时以乙 腈作为空白对照。1、2、3号棕色瓶中的洗脱液分别对应100-200mL，200-350mL，350mL-500mL 的洗脱液，其液相检测结果如图1、图2、图3和图4所示。图1-图4中分别设置了红色素、橙色 素、黄色素，三类色素的最适检测条件(检测波长分别为540nm、480nm、390nm，参比波长分别 为350nm、330nm、270nm)。通过洗脱液和空白溶液的对比，证明红曲霉菌丝体的正己烷粗提 物经过硅胶色谱柱分离后，收集到的黄色组分主要为红曲素(Monascin)和红曲黄素 (Ankaflavin)。将黄色部分集中旋干，得到黄色粉末状固体。
将浓缩液用硅胶色谱柱进行预分离，得到黄色洗脱液，所述预分离的柱分离条件 具体为：100目细度的硅胶树脂作为固定相，流动相为正己烷和乙酸乙酯，所述正己烷：乙酸 乙酯的体积比为4:1；
将黄色洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，得到色素粉末。
4.高速逆流色谱对色素的精制
(1)黄色素在正己烷-甲醇-水分离体系中分配率k值的测定
选用体系：正己烷-甲醇-水。
配制原则：保证上下相的最终体积相近，因比之正己烷，水和甲醇极性相近，故保 持正己烷体积不变，调整甲醇和水的配比，最终使甲醇和水的总体积加和与正己烷的体积 相近。这样可以保证在分离体系配制过程中上下相体积相近，从而避免有机溶剂的浪费，同 时又能全面调整分离体系的极性。
在10mL离心管中按照比例配制上下相，充分混合，待分层后分别取4mL上相和下 相，分别装入另外两个干净的10mL离心管中。将少量的色素粗提物固体加入下相，超声波处 理，完全溶解后取1mL，用HPLC检测黄、橙色素含量，分别记为C11、C12。在剩余的含有色素的 下相中加入3L的上相。充分混合后再取1mL下相，用HPLC检测，含量记为C21，C22，其中研究的 两种橙色素和两种黄色素的光谱图如图5所示。
当上下相平衡后，色素在上下相的分配系数＝色素在上相中的含量/色素在下相 中的含量。即色素在两相中分配率k＝(C1n-C2n)/C1n×100％(n＝1或n＝2)。
按照上述方法测定四种色素在不同上下相中的分配比，结果如表4所示。利用高速 逆流色谱对混合物进行分离时，理论上，k值在1左右可以达到最优的分离效果。四种色素在 此两种体系下的k值如表5所示。用5mL上相和5mL下相将其溶解后，用HSCCC进行分离。
表3不同展开剂对橙色素和黄色素的展开效果表
表4四种色素在不同上下相体系的分配比表
注：其中“-”表示相应的上相或下相中因检测器响应值太低而不能检测出来。
表5四种色素在最适上下相体系的分配比表
(2)高速逆流色谱的分离
①高速逆流色谱上下相的配制
将特定体积比的三种试剂加入大烧杯中，用玻璃棒充分搅拌后用封口膜封口，静 置，使其分层。体系平衡后倒出上相，上下相分层的部分利用分液漏斗静置后将上下相分 开。选取上相为固定相，下相为流动相，分别超声脱气30min，小心移动，以免混入气泡。
②高速逆流色谱的准备
依次打开电脑、循环水浴系统、逆流色谱主机及检测器。保证电源、信号线稳固，管 路封闭。设定温度为25℃，检测波长为405nm。
开启泵，以10mL/min的速度泵入固定相，当固定相从管路的出柱口流出后停泵。切 换泵头，将其插入流动相中，调节逆流色谱主机转速，选择FWD模式，转速缓慢调至900r/ min，待主机转速稳定后，以2mL/min的速度泵入下相。
③样品的分离及收集
当HSCCC准备妥当后，将要分离的样品色素粉末用5mL上相和5mL下相的混合液进 行溶解(选择上下相各5mL是这样考虑的：当样品不好溶于下相时，一般用等量的上下相去 溶解，而平时在做HSCCC时一般的进样量可以为10mL)，超声波辅助溶解，至无明显颗粒为 止。若有明显颗粒，则将混合物用0.45μm有机滤膜过滤，装入干净的20mL注射器中。
将混合液in口和out口分别插入进样注射器和空注射器，停泵。将六通阀手柄快速 拨到load档。推动空注射器，至进样注射器中液面上升，且没有气泡，将样品圈尾部的气体 排尽，拉动空注射器，将进样注射器中的样品吸入定量环。
将六通阀手柄拨至inject档位，开泵，同时开启HSCCC电脑软件和自动收集器，收 集流出液。
高速逆流色谱分离结果如图6所示，出峰时间约52-126min，对应的收集管为26-63 管。其中52-64min吸收峰对应的收集管为26-32管，102-126min吸收峰对应的收集管为51- 63管。由图6可知，经过HSCCC色谱分离后的正己烷色素粗提物可以很好地分成两段黄色素。
分别取26号收集管和32号收集管、51号收集管和63号收集管，用HPLC检测其中的 黄色素。检测结果如图7、图8、图9和图10所示。
由图7至图10可以看出，在红曲霉中红、橙、黄三类色素检测条件下，均只有单一的 吸收峰，扣除参比信号后，峰面积比例均大于99％，可以说明，此时的色素均为单一的黄色 素。
5.干燥：将红曲素和红曲黄素洗脱液在40℃下真空浓缩至粉末状，即得高纯度红 曲素和红曲黄素。
本发明的相关检测结果：
将通过液态发酵红曲霉得到并经纯化后的红曲素(Monascin)色素与市售红曲素 (Monascin)标准品的液相色谱图进行对比，结果如图11所示。标准品出峰时间为9.747min， 纯化品的出峰时间为9.796min，对比两者的光谱图，可以说明该物质为红曲素(Monascin)。 同时，由标准曲线得到0.23g色素正己烷粗提物中，纯化红曲素(Monascin)的质量为 1.88mg。
由于没有红曲黄素(Ankaflavin)的标准品，故采用LC-MS的手段来鉴定纯化的红 曲黄素(Ankaflavin)，图12为纯化红曲黄素(Ankaflavin)的质谱图。
由图12正离子模式质谱图显示，[M+H]+分子量(m/z)为387.42的准分子离子峰，负 离子模式质谱图显示[M-H]-，分子量(m/z)为385.31的准分子离子峰，确定该组分分子量为 386D，同时，结合光谱图，判定该物质为红曲色素中的红曲黄素(Ankaflavin)。
将所得红曲黄素(Ankaflavin)用真空离心浓缩仪浓缩至液体挥干，用万分之一天 平称取离心管和红曲黄素(Ankaflavin)总重量m1，用10mL色谱级甲醇分4次将色素洗净，称 量干燥离心管的质量m2，用洗涤前的质量m1减去洗涤后的质量m2，即为红曲黄素 (Ankaflavin)的质量。最终从0.23g黄色素正己烷粗提物中制备得到红曲黄素 (Ankaflavin)4.8mg。
主要参考文献
[1]崔莉,胡晓丹,张德权.HPLC法同时测定红曲色素中的红曲素和安卡红曲黄素 [J].食品科学,2009,30(08):163-166.
[2]郑允权,李泳宁,王阿万,等.高速逆流色谱法分离纯化红曲色素组分[J].食品 科学,2010,31(20):192-195。