技术领域
本发明涉及一种提高酶热稳定性的方法，特别是一种利用双亲短肽融合表达提高重组酶 的热稳定性的方法。
背景技术
双亲短肽是具有亲水和亲油能力的小分子肽，广泛存在于膜蛋白及脂肪代谢相关酶类的 结构中。其双亲的特点能够帮助酶分子与疏水性底物结合、实现酶分子的定位等。
生物活性酶在工业生产中具有广泛的应用，而提高酶的热稳定性是工业酶的研究重点之 一。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括：1.定向进化：通过定点突变，随即突变，饱 和突变等技术，筛选得到热稳定的突变株；2.从嗜热微生物中筛选热稳定性的酶。但是，这 些方法并不适用于所有酶分子热稳定性改造中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高酶热稳定性的方法，通过在重组酶的N端或C 端融合表达双亲短肽实现酶热稳定性的提高。
为解决上述技术问题提供如下技术方案：
第一步 双亲短肽基因的获得
根据双亲短肽的氨基酸序列，化学合成相应的DNA序列，并将其克隆至大肠杆菌表达 质粒pET-22b(+)的Nde I和Nco I酶切位点之间上，构建成为pET-22b(+)/AP质粒；
第二步 融合双亲短肽的重组酶表达质粒的构建
将重组酶基因克隆至pET-22b(+)/AP质粒的Nco I和Hind III位点之间。构建成为表达 融合双亲短肽的重组酶表达质粒pET-22b(+)/AP-enzyme。
第三步 融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建
将重组质粒pET-22b(+)/AP-enzyme转化宿主大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))，构建高效表达 目的酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌。
菌株经培养表达目的酶的方法为：
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。；
各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL；高 压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)；
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培 养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL 的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加 入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG。
目的酶热稳定的测定方法：
将目的酶分别应用疏水层析、离子交换层析等分离手段，得到电泳纯的目的酶。将目的 酶在一定温度下保温，测定酶活相比初始未保温时损失50%所需要的时间(T1/2)。
本发明提供了一种提高酶热稳定性的方法，应用双亲短肽融合表达重组酶能够提高目的 重组酶的热稳定性。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶 热稳定性提高了新的方法和思路。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本 上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。
材料和方法：所用限制性内切酶，T4DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于 TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞E.coli JM109，引物，质粒提取试剂盒，PCR产 物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司。
实施例1：双亲短肽的氨基酸序列并克隆至质粒pET-22b(+)
1 AEAEAKAKAEAEAKAK
2.VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR
3.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADWLKAFYDKVAEKLKEAF
4.DWLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDWLKAFYDKVAEKLKEAF
5.DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF
6.DWLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADWLKAFYDKVAEKLKEAF
按照以上氨基酸序列通过化学合成DNA序列，并克隆至质粒pET-22b(+)等到质粒 pET-22b(+)/AP
实施例2：重组质粒pET-22b(+)/AP-enzyme的构建
将目的酶基因克隆至表达载体pET-22b(+)/AP的Nco I和Hind III位点。连接产物转化 感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下：
(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
(3)42℃热休克90s(准确),不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；
(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液 体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。
挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。
实施例3：融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建
感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。转化方法如下：
(1)无菌状态下取感受态细胞200μL置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
(3)42℃热休克90s（准确）,不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800μL；
(6)用无菌铺菌器将200μL菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37℃平放20min直至液 体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。
挑选阳性转化子，提取质粒验证，证明转化成功。
实施例4：发酵生产融合双亲短肽的脂肪氧合酶
脂肪氧合酶基因序列如Genebank NO:PA119所示，根据实施例2，实施例3所述方法得 到融合双亲短肽的重组脂肪氧合酶的表达菌株，以该菌株作为种子发酵生产重组脂肪氧合酶。
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g K2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。 高压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培 养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL 的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加 入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH 7.5的缓冲 液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热 稳定性，如表1所示：
表1.融合双亲短肽提高脂肪氧合酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6 T1/2min(50℃) 10 18 39 38 22 252 187
实施例5：发酵生产融合双亲短肽的碱性淀粉酶
以实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组碱性淀粉酶的表达菌株，以该 菌株作为种子发酵生产重组碱性淀粉酶。碱性淀粉酶基因序列如Genebank NO:HV220894.1 所示。
培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高 压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培 养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL 的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加 入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH 7.5的缓冲 液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热 稳定性，如表2所示：
表2.融合双亲短肽提高碱性淀粉酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6 T1/2min(60℃) 25 40 60 57 80 350 300
实施例6：发酵生产融合双亲短肽的谷氨酰胺转肽酶
以实施例2，实施例3所述方法得到融合双亲短肽的重组谷氨酰胺转肽酶的表达菌株，以该菌株作为 种子发酵生产重组谷氨酰胺转肽酶。谷氨酰胺转肽酶基因序列如Genebank NO:AF531437所示。 培养基组成(g/L)：
种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。
发酵培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。
各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72mol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100mL。高 压灭菌或用0.22μm的滤膜过滤除菌)。
培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25mL的三角瓶(250mL)中，培 养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25mL 的三角瓶(250mL)中，培养温度37℃，当OD600达到0.6时，将培养温度降为16℃，同时加 入终浓度为1.0mM的诱导剂IPTG，发酵24h。
将发酵液15000rpm离心10min得到菌体，将菌体溶解于150mM Tris-Hcl，pH 7.5的缓冲 液中，并依次通过疏水层析、离子交换层析得到电泳纯的重组酶。在50℃下测定重组酶的热 稳定性，如表2所示：
表3.融合双亲短肽提高谷氨酰胺转肽酶的热稳定性，以未融合双亲短肽的为对照
对照 1 2 3 4 5 6 T1/2min(50℃) 12 21 40 45 100 328 298
本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不 脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利 要求书所界定的为准。