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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610094707.2 (22)申请日 2016.02.20 C07D 307/92(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 杭州富阳伟文环保科技有限公司 地址 311400 浙江省杭州市富阳区春江街道 新建村 (72)发明人 孙琴华 (54) 发明名称 一种新的佛木内酯类化合物及其制备方法和 医药用途 (57) 摘要 本发明公开了一种新的佛木内酯类化合物及 其制备方法和医药用途。 该化合物为首次报道， 是 一种结构新颖的佛木内酯类化合物， 可以从合子 草的。
2、干燥叶中提取、 分离纯化得到。 体外试验证明 该化合物对前列腺癌细胞株 PC3 和 DU145 有抑制 作用， 且抑制作用具有浓度时间依赖性关系。 化合物 ( ) 可能成为晚期前列腺癌治疗中的一 个具有潜力的选择， 可以用来开发成治疗前列腺 癌的药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 105503800 A 2016.04.20 CN 105503800 A 1.具有下述结构式的化合物()， 2.权利要求1所述的化合物()的制备方法， 其特征在于包含以下操作步骤： (a)将合子 草的干燥叶粉碎， 用。
3、8090乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物； (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂， 先用15乙醇洗脱8个柱体积， 再用 75乙醇洗脱12个柱体积， 收集75乙醇洗脱液， 减压浓缩得75乙醇洗脱物浸膏； (c)步 骤(b)中75乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1、 55:1、 35:1、 15:1和1: 1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依 次用体积比为20:1、 15:1和10:1的二氯甲烷-。
4、甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组 分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为80的甲醇水溶液等度洗脱， 收集810个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物()。 3.根据权利要求2所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 步骤(a)中， 用85乙醇 热回流提取， 合并提取液。 4.根据权利要求2所述的化合物()的制备方法， 其特征在于： 所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。 5.一种药物组合物， 其特征在于： 该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物()和药学上可接受的载体。 6.权利要求1所述的化合物()在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。。
5、 7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105503800 A 2 一种新的佛木内酯类化合物及其制备方法和医药用途 技术领域 0001 本发明属于药物技术领域， 具体涉及从合子草的干燥叶中分离得到的一种具有治 疗前列腺癌作用的佛木内酯类化合物及其制备方法。 背景技术 0002 合子草(ActinostemmalobatumMaxim.)为葫芦科盒子草属植物， 又名天球草、 无 白草。 一年生攀援草本。 叶片狭三角戟形或三角状心形， 圆锥花序腋生， 花小形单性， 雌雄同 株。 花冠黄绿色， 裂片三角状披针形。 蒴果卵圆形， 绿色， 下。
6、垂， 有细刺状突起， 熟时上半部盖 裂。 种子2粒， 灰色。 花期78月。 果期910月。 药用部位为全草、 种子及叶， 分布于我国南北 各地， 朝鲜、 日本、 苏联、 印度、 中南半岛也有分布。 合子草性寒、 味苦， 有小毒， 具有利尿消 肿、 清热解毒、 去湿之功效。 主治肾炎水肿、 腹水肿胀、 毒蛇咬伤及疳积初起等病症。 0003 合子草中富含皂苷、 黄酮、 糖类、 氨基酸等多种类型的化学成分。 皂苷类为合子草 的主要活性成分， 含量较大。 大环内酯三萜皂苷和达玛烷型三萜类化合物具有显著的抗肿 瘤活性。 黄酮主要有山柰酚-3-O- -L-鼠李糖(16)- -D-吡喃葡萄糖苷、 芦丁、 槲。
7、皮苷、 山 柰酚和槲皮素。 合子草不仅含有较高的三萜皂苷， 糖总含量也较高。 合子草多糖是由鼠李 糖、 木糖、 阿拉拍糖、 葡萄糖、 半乳糖和1个未知单糖组成， 游离糖主要为葡萄糖、 半乳糖及低 聚糖。 0004 现在研究表明合子草具有抗肿瘤、 抗氧化、 抗血栓、 抗菌、 抑制染色体突变、 增强免 疫等药理活性。 合子草为我国传统中药， 资源丰富， 其中的三萜皂苷含量较高， 结构新颖复 杂， 抗癌活性显著。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种从合子草的干燥叶中分离得到的一种具有治疗前列腺 癌作用的佛木内酯类化合物及其制备方法。 0006 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：。
8、 0007 具有下述结构式的化合物()， 0008 0009 所述的化合物()的制备方法， 包含以下操作步骤： (a)合子草的干燥叶粉碎， 用80 90乙醇热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱和的 说明书 1/6 页 3 CN 105503800 A 3 正丁醇萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸 乙酯萃取物用大孔树脂除杂， 先用15乙醇洗脱8个柱体积， 再用75乙醇洗脱12个柱体 积， 收集75乙醇洗脱液， 减压浓缩得75乙醇洗脱物浸膏； (c)步骤(b)中75乙醇洗脱物 浸膏用正相硅胶分离， 依次用体积。
9、比为85:1、 55:1、 35:1、 15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分； (d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1、 15:1 和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为80的甲醇水溶液等度洗脱， 收集810个柱体积洗脱 液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物()。 0010 进一步地， 步骤(a)中， 用85乙醇热回流提取， 合并提取液。 0011 进一步地， 所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。 0012 一种药物组合物， 该药物组合物含有治疗有效量的权。
10、利要求1所述的化合物()和 药学上可接受的载体。 0013 所述的化合物()在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。 0014 所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。 0015 本发明化合物用作药物时， 可以直接使用， 或者以药物组合物的形式使用。 0016 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物()， 其余为药物学上可接受的、 对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。 0017 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、 半固体和液体稀释剂、 填料 以及药物制品辅剂。 将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。 本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。
11、。 用于口服时， 可将其制成片剂、 缓释片、 控 释片、 胶囊、 滴丸、 微丸、 混悬剂、 乳剂、 散剂或颗粒剂、 口服液等； 用于注射时， 可制成灭菌的 水性或油性溶液、 无菌粉针、 脂质体或乳剂等。 附图说明 0018 图1为化合物()结构式； 0019 图2为化合物()理论ECD值与实验ECD值比较； 0020 图3为不同浓度化合物()作用72h后PC3和DU145存活率； 0021 图4为10.0mg/L化合物()作用不同时间后PC3和DU145存活率。 具体实施方式 0022 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明保护范 围。 尽管参照较佳实施例对本发明作。
12、了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 0023 实施例1： 化合物()分离制备及结构确证 0024 试剂来源： 乙醇、 石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇、 二氯甲烷为分析纯， 购自上海凌峰化 学试剂有限公司， 甲醇， 分析纯， 购自江苏汉邦化学试剂有限公司。 0025 制备方法： (a)将合子草的干燥叶(8kg)粉碎， 用85乙醇热回流提取(25L3次)， 合并提取液， 浓缩至无醇味(3L)， 依次用石油醚(3L3次)、 乙酸乙酯(3L3次)和水饱和的 正丁醇(3L3次)萃取， 分别得到石油醚萃取物、 乙。
13、酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物； 说明书 2/6 页 4 CN 105503800 A 4 (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂， 先用15乙醇洗脱8个柱体积， 再用 75乙醇洗脱12个柱体积， 收集75乙醇洗脱液， 减压浓缩得75乙醇洗脱物浸膏(131g)； (c)步骤(b)中75乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离， 依次用体积比为85:1(8个柱体积)、 55:1 (8个柱体积)、 35:1(6个柱体积)、 15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分； (d)步骤(c)中组分4(29g)用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为 20。
14、:1(8个柱体积)、 15:1(10个柱体积)和10:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分； (e)步骤(d)中组分2(11g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度 为80的甲醇水溶液等度洗脱， 收集8-10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物()(233mg)。 0026 结构确证： 无色晶体(甲醇)； HR-ESIMS显示M+Na+为m/z369.1714， 结合核磁特 征可得分子式为C20H26O5， 不饱和度为8。 核磁共振氢谱数据 H(ppm， DMSO-d6， 500MHz)： H-1 (2.24， dt， J4.5， 10.4)， H-。
15、2(1.48， m)， H-2(1.74， m)， H-3(1.53， m)， H-3(1.46， m)， H-4 (1.27， m)， H-9(1.86， dd， J2.8， 13.7)， H-9(2.31， dd， J4.1， 13.9)， H-10(2.40， dt， J 4.4， 13.5)， H-13(1.79， s)， H-14(1.17， d， J1.2)， H-15(0.78， d， J6.4)， H-3 (6.02， qq， J 1.0， 7.0)， H-4 (1.95， dq， J1.4， 7.3)， H-5 (1.83， br， s)； 核磁共振碳谱数据 C(ppm， D。
16、MSO-d6， 125MHz)： 42.7(CH， 1-C)， 25.1(CH2， 2-C)， 28.9(CH2， 3-C)， 39.8(CH， 4-C)， 63.7(C， 5-C)， 204.6(C， 6-C)， 154.4(C， 7-C)， 103.2(C， 8-C)， 33.6(CH2， 9-C)， 37.8(CH， 10-C)， 124.7 (C， 11-C)， 171.3(C， 12-C)， 8.5(CH3， 13-C)， 16.3(CH3， 14-C)， 15.3(CH3， 15-C)， 204.6(C， 1 - C)， 127.5(C， 2 -C)， 138.4(CH， 3 -C。
17、)， 15.8(CH3， 4 -C)， 20.6(CH3， 5 -C)； 碳原子标记参见图 1。 红外光谱表明该化合物含有 , -不饱和-内酯和羰基(1760， 1650cm-1)。 13CNMR谱显 示20个碳信号， 包括五个甲基， 三个亚甲基， 四个次甲基(一个烯属次甲基)， 以及八个季碳 (三个羰基碳， 三个烯烃季碳， 一个含氧季碳)。 1H和13CNMR谱显示一个2-甲基-2-烯丁酮基 信号 H1.83(3H， br， s， H-5 )， 1.95(3H， dq， J1.4， 7.3Hz， H-4 )， 6.02(1H， qq， J1.0， 7.0Hz， H-3 )； C204.6(C。
18、-1 )， 127.5(C-2 )， 138.4(C-3 )， 15.8(C-4 )， 20.6(C-5 )， 一个 甲基的取代的, -不饱和-内酯1.79(3H， s)； C154.4(C-7)， 124.7(C-11)， 171.3(C- 12)， 8.5(C-13)， 一个羟基基团 C103.2(C-8)。 质子信号为 H1.17(3H， d， J1.2Hz)和 H0.78(3H， d， J6.4Hz)的甲基分别位于C-5和C-4位上。 HMBC谱中Me-14与C-10和C-4的相关 性验证了上述推论。 NOESY谱中， Me-14与Me-15， H-10和H-1的相关性表明这些质子为 。
19、构型。 综合氢谱、 碳谱、 HMBC谱和NOESY谱， 以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物 如图1所示， 立体构型进一步通过ECD试验确定， 理论值与实验值基本一致(图2)。 0027 实施例2： 化合物()药理作用试验 0028 一、 材料和仪器 0029 前列腺癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、 前列腺癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。 化 合物()自制， HPLC归一化纯度大于98， 用二甲基亚矾(DMSO)配制成浓度为1.0g/L的储存 液备用。 CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。 RPMI-1640培养基购自Gibco公司。 胎牛 血清。
20、(FBS)购自Hyelone公司。 青/链霉素为上海先锋药业产品。 胰蛋白酶购自华美生物工程 公司。 二甲基亚砜(DMSO)购自上海华舜生物工程公司。 琼脂(Agarose)、 二硫苏糖醇(DTT)、 苯甲基磺酞氟(PMSF)、 四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。 十二烷基磺酸钠(SDs)、 三 氯甲基烷基甲烷(Tris)Tris-Hcl、 Tritonx-100为Promega公司产品。 丙烯酞胺、 过硫酸钱 说明书 3/6 页 5 CN 105503800 A 5 (AP)购于苏州化学试剂厂产品。 0030 CO2细胞培养箱(ShellLab)， 倒置相差显微镜(Nikon)。
21、， 超净工作台(苏州净化设备 厂)， 流式细胞仪(BD)， F039300A型酶标仪(Sunrise)， 高压蒸汽灭菌器(HirayamaHA- 300MD)， 低温超速离心机(Kubota3740)， 万向摇床(江苏麒麟医用仪器厂TS-92)， 电泳仪 (Gibco公司)， LXJ-型离心机(上海医用分析仪器厂)， DK600型电热恒温水浴箱(上海精密 试验设备公司)， 电子天平(METTLERTOLEDO)， 台式干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)， 紫外分光光度仪(Beckman)。 0031 二、 试验方法 0032 1、 细胞培养与养护 0033 1.1细胞培养 0034 细胞株培养。
22、于肿瘤医院中心实验室。 培养于含10胎牛血清的RPMI-1640培养基 中， 另添加谷氨酞胺(2mmol/L)和抗生素(l00U/青霉素和100mg/L链霉素)， 置37、 饱和湿 度、 含5CO2气体的培养箱中培养。 0035 1.2细胞传代 0036 于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁， 即可传代。 传代前用75酒精擦拭经 过紫外线照射的超净工作台和双手。 用吸管吸去培养瓶中的旧培养液， 用PBS清洗3次。 加入0.02EDTA-0.25胰蛋白酶液2mL进行消化， 静置约5分钟， 并不时在倒置相差显微镜 下观察， 当胞质回缩， 细胞之间不再连接成片时， 加入适量含血清之新鲜培养基终止胰蛋白。
23、 酶的作用。 用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液， 吸入10mL离心管中平衡离心(1000 转/分)5分钟。 弃去上清液， 加入2mL培养液， 用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液， 1:23 分装入新培养瓶， 添加培养液适量于孵箱中继续培养。 0037 2、 细胞形态学观察 0038 倒置显微镜观察:将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿， 培养24h后加 入10.0mgL-1， 化合物()处理24， 48， 72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变并 记录。 0039 3、 细胞毒试验(CCK-8法) 0040 培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液， 细胞计数后按照3104个细胞。
24、/孔接种于 96孔板， 每孔加0.lmL培养基， 常规培养于37、 含5CO2气体的培养箱中。 试验分组:设 阴性对照组(有细胞但不加药， 0.1DMSO)， 空白对照组(无细胞仅有培养液)， 化合物()分 别2.5mg/L， 5.0mg/L， 10.0mg/L和20.0mg/L共6组。 24小时后观察细胞贴壁生长良好， 分别 按上述试验分组向96孔板内加药， 每组设6-8个重复孔。 加药后将96孔板移入37、 含5 CO2气体的培养箱中继续分别培养24、 48和72小时。 每组试验结束时每孔加入CCK-810 L， 37培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔的吸光度(OD)值， 测定波。
25、长为450nm， 参 考波长为600nm。 按照以下公式计算出细胞存活率(cellviability)， 然后绘制成图表， 存活率为50时的值即为IC50。 细胞存活率()(As-Ab)/(Ac-Ab)100。 其中As为试 验孔， Ac为对照孔， Ab为空白孔。 0041 4、 集落形成试验 0042 取对数生长期细胞， 计数后以3l02个接种于6孔板， 每孔加2mL培养基， 常规培 养于37、 含5CO2气体的培养箱中。 24h后观察细胞贴壁生长良好， 分别加入不同浓度 说明书 4/6 页 6 CN 105503800 A 6 (0， 2.5， 5.0， 10.0， 20.0mg/L)化合。
26、物()处理， 每组设3个重复孔。 加药后将6孔板移入37 、 含5CO2气体的培养箱中继续14天。 10甲醇固定， Giemsa染色， 计算每孔集落数( 50个细胞的计为一个集落)。 计算集落形成率:集落总数/接种细胞数100。 0043 三、 结果及结论 0044 1、 化合物()气对PC3和DU145细胞形态的影响 0045 镜下见对照组细胞贴壁生长， 相邻细胞融合成片， 细胞呈类圆形或梭形， 体积较 大， 排列紧密， 边缘光滑， 胞质饱满， 核膜、 核仁等结构轮廓明显， 细胞生长迅速； 经10.0mg/L 化合物()处理后， 细胞密度逐渐降低， 生长速度明显减慢至几乎停滞， 细胞逐渐脱落。
27、并漂 浮于培养液中。 细胞体积缩小， 胞膜皱缩， 成小圆形或不规则形态， 胞内多见小颗粒状物质。 药物作用时间越长， 细胞形态学改变越明显。 0046 2、 细胞毒试验 0047 不同浓度化合物()对前列腺癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。 2.5， 5.0， 10.0， 20.0mg/L化合物()作用两种细胞24， 48和72h后的存活率如下表所示(表l及表 2)。 其中， 10.0mg/L化合物()作用于PC3和DU145细胞24， 45， 72h后的细胞存活率分别为 56.2， 42.5， 24.3和50.8， 32.6， 20.7； 2.5， 5.0， 10.0， 20.0。
28、mg/L， 化合物()作 用两种细胞72h后的存活率分别为54.3， 37.7， 24.3， 13.2和52.4， 32.8， 20.7， 11.2(见图3及图4)。 两因素方差分析示不同浓度与不同时间处理组之间差别具 有统计学意义(P0.05)， 提示化合物()对PC3和DU145的生长抑制作用呈时间浓度依赖。 0048 3、 集落形成试验 0049 试验显示， 对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67.7和64， 而2.5， 5.0， 10.0， 20.0mg/L化合物()处理组分别为60.7， 51.3， 39.3， 27.0和49.7， 34.0， 27.7， 15.7(见表3)。
29、。 这进一步证实了化合物()对PC3和DU145细胞具有增殖抑制作用。 0050 结论， 本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证化合物()对前列腺癌细胞株 PC3和DU145的作用， 且抑制作用具有浓度时间依赖性关系。 化合物()可能成为晚期前 列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择。 0051 表l不同浓度化合物()作用于PC3后的细胞存活率 0052 时间/浓度2.5mg/L5.0mg/L10.0mg/L20.0mg/L 24h0.8250.7310.5620.422 48h0.690.530.4250.226 72h0.5430.3770.2430.132 0053 表2不同浓度化合物(。
30、)作用于DU145后的细胞存活率 0054 时间/浓度2.5mg/L5.0mg/L10.0mg/L20.0mg/L 24h0.8090.6040.5080.375 48h0.6460.4810.3260.173 72h0.5420.3280.2070.112 0055 表3不同浓度化合物()作用下PC3和DU145的集落形成率 0056 说明书 5/6 页 7 CN 105503800 A 7 0057 实施例3 0058 片剂的制备： 按实施例1方法先制得化合物()， 以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、 无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐， 按其与赋形剂重量比为1:9的 比。
31、例加入赋形剂， 制粒压片。 0059 实施例4 0060 口服液制备： 按实施例1方法先制得化合物()， 以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、 无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐， 按常规口服液制法制成口服 液。 0061 实施例5 0062 胶囊剂或颗粒剂的制备： 按实施例1方法先制得化合物()， 以及利用有机酸如酒 石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、 无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐， 按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂。 0063 实施例6 0064 注射液的制备： 按实施例1方法先制得化合物()， 以及利用有机酸如酒石酸、 或柠 檬酸或甲酸。
32、或乙二酸等、 无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐， 按常规加注射用水， 精滤， 灌封灭菌制成注射液。 0065 实施例7 0066 无菌粉针的制备： 按实施例1方法先制得化合物()， 以及利用有机酸如酒石酸、 或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、 无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐， 将其溶于无菌注射用水 中， 搅拌使溶， 用无菌抽滤漏斗过滤， 再无菌精滤， 分装于安瓿中， 低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。 0067 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护 范围。 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 105503800 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 105503800 A 9 图3 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 105503800 A 10 。