技术领域
本发明涉及多巴胺能神经元(dopaminergicneuron)的制备方法。而且，本 发明还提供含有由该方法得到的多巴胺能神经元的药物，以及用于该方法的 试剂和试剂盒。
(发明背景)
多巴胺(3,4-二羟基苯基乙基胺)是具有多种作用的生物学分子，主要作 为中枢神经系统中的神经递质发挥作用。在生物体中，多巴胺是以氨基酸酪 氨酸为起点，通过酪氨酸羟化酶和DOPA脱羧酶这两种酶的作用而在细胞内 生物合成的。
多巴胺能神经元是能够合成和释放多巴胺作为神经递质的神经细胞。 在脑中，它主要存在于中脑，并且部分地存在于下丘脑。存在于中脑的多巴 胺能神经元在运动和情绪控制中扮演重要角色。当中脑多巴胺能神经元变性 或脱落时，例如能够引起严重的神经退行性疾病例如帕金森氏病等。最为期 待的治疗这样的神经退行性疾病的一种治疗方式是细胞移植治疗，包括对对 象进行多巴胺能神经元移植。
作为获得多巴胺能神经元的方法，目前已知有下述方法，该方法包括： 将干细胞例如胚胎干细胞(本说明书中有时记作ES细胞)、人工多能性干细 胞(本说明书中有时记作iPScell)等分化为神经外胚层，并进一步诱导分化为 多巴胺能神经元。
最近，有报道称由底板细胞生产了中脑多巴胺能神经元。此外，接连报 道了下述方法：通过使用两种SMAD(SmallMothersAgainstDecapentaplegic) 信号抑制剂，将干细胞分化为底板细胞来得到中脑多巴胺能神经元的方法 (专利文献1,非专利文献1)，由人干细胞诱导底板细胞并且与神经营养因子 一起培养底板细胞来诱导中脑多巴胺能神经元的方法(专利文献2,非专利文 献2-4)，以及通过将人ES细胞与GSK3beta抑制剂和激活素/Nodal抑制剂 反应来有效诱导底板细胞的方法(非专利文献5)。
然而，这些方法得到的多巴胺能神经元的生产效率仍然停留在低水平， 并且由于它们不能在体外再现对于氧化应激和药物刺激的应答性等，所述细 胞是功能不充分的。因此，仍然需要开发有效得到高品质的多巴胺能神经元 的方法。
文献列表
[专利文献]
[专利文献1]US-B-2012/0094381
[专利文献2]WO2013/067362
[非专利文献]
[非专利文献1]Fasano等,Cell干细胞6(2010)336-347
[非专利文献2]Kriks等,Nature480(2011)547-553
[非专利文献3]Kirkeby等,CellReports1(2012)703-714
[非专利文献4]Xi等,干细胞s30(2012)1655-1663
[非专利文献5]Denham等,干细胞s30(2012)2400-2411
发明概述
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供更有效制备高品的多巴胺能神经元的方法。本发明 的目的还在于提供含有由所述方法得到的多巴胺能神经元的药物，以及用于 所述方法的试剂和试剂盒。
解决问题的手段
基于上述问题，本发明人进行了锐意研究并且发现，通过在含有(i)cAMP 类似物和(ii)MEK抑制剂的培养基中培养神经前体细胞，能够以高密度并且 良好的重现性制备多巴胺能神经元。而且，他们确认到所得到的多巴胺能神 经元是高品质的多巴胺能神经元，具有与在体内的多巴胺能神经元同样的表 型特征和机能等，从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下方面的内容。
[1]多巴胺能神经元的制备方法，该方法包括使底板细胞(floorplatecells) 进行下述步骤(1)：
(1)在含有(i)cAMP类似物(cAMPanalogue)和(ii)MEK抑制剂的培养 基中进行培养的步骤；
[2]根据上述[1]的制备方法，其中，所述培养基是还含有抗坏血酸或其 盐的培养基；
[3]根据上述[2]的制备方法，其中，所述培养基是还含有激活素受体样 激酶-4,7的活化剂(activator)的培养基；
[4]根据上述[1]的制备方法，其中，所述cAMP类似物是二丁酰基 -cAMP；
[5]根据上述[1]的制备方法，其中，所述MEK抑制剂是
(i)N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰 胺(PD0325901),
(ii)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺 (PD184352),或
(iii)2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸 (SU5402)；
[6]根据上述[3]的制备方法，其中，所述激活素受体样激酶-4,7的活化 剂激活素；
[7]根据上述[3]的制备方法，其中，所述cAMP类似物是二丁酰基 -cAMP,
所述MEK抑制剂是
(i)N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘-苯基)氨基]苯甲酰 胺(PD0325901),
(ii)2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺 (PD184352),或
(iii)2-[(1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸 (SU5402),以及
激活素受体样激酶-4,7的活化剂是激活素(activin)；
[8]药物，其包含根据[1]的制备方法得到的多巴胺能神经元；
[9]用于由底板细胞制备多巴胺能神经元的试剂，所述试剂包括：
(i)cAMP类似物，和(ii)MEK抑制剂；
[10]用于由底板细胞制备多巴胺能神经元的试剂盒，所述试剂盒包括： (i)cAMP类似物，和(ii)MEK抑制剂；
[11](i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂用于由底板细胞制备多巴胺能神 经元的用途。
发明的效果
根据本发明，由神经前体细胞能够非常有效地制备高品质的多巴胺能神 经元。本发明制备的多巴胺能神经元具有与体内多巴胺能神经元相似的表型 特征和机能，因为它显示出在通过常规方法制备的多巴胺能神经元中没有观 察到的对于氧化应激以及药物刺激的应答性等。因此，本发明制备的多巴胺 能神经元能够获得高移入率(engraftedrate)并且对于用来治疗由于多巴胺的 降低的产出(释放)而引起的疾病的细胞移植治疗是极为有用的，所述疾病例 如神经退行性疾病例如帕金森氏病等，而且也能够用于各种应用，例如筛选 用于预防和/或治疗所述疾病的化合物，化合物的毒性评价，药物研发靶标 的核实，疾病机制的分析等。
附图说明
图1显示了底板细胞标记物的表达变化的结果，所述结果是通过使用添 加有不同组合的分化诱导因子的Neuro/B27，诱导底板细胞的分化，并且通 过定量RT-PCR检测在培养第13天的表达变化而得到的。[-]显示没有添加 各分化诱导因子，[All]显示使用了全部5种LDN193189(LDN),SB431542 (SB),SonicHedgehog(SHH),purmorphamine(Pur)和CHIR99021(CHIR)的 情况。[-factorname]显示除去各因子的情况。作为细胞株，使用了253G1 株和201B7株。Y轴的值显示以GAPDH的拷贝数修正后的各基因的拷贝数， 误差棒显示标准偏差。
图2显示将诱导的底板细胞在培养的第13天用抗-FOXA2抗体和抗 -LMX1A抗体进行了免疫荧光染色的结果。作为细胞株，使用了253G1株。 红色显示FOXA2阳性细胞的核，绿色显示LMX1A阳性细胞的核，以及蓝 色(DAPI染色)显示细胞核。
图3显示NURR1的表达变化的结果，该结果是通过诱导底板细胞的分 化，在诱导后13天起，通过添加抗坏血酸(AA)、二丁酰基-cAMP(dbcAMP) 和PD0325901(PD)的不同组合来培养细胞，并且在第45天以定量RT-PCR 检测表达变化而得到的。作为细胞株，使用了253G1株和201B7株。Y轴 的值显示以GAPDH的拷贝数修正后的各基因的拷贝数，误差棒显示标准偏 差。.
图4显示在按照与图3中相同的方式进行了分化诱导后，在培养第45 天使用抗-TH抗体和抗-NURR1抗体进行的免疫荧光染色的结果。作为细胞 株，使用了253G1株和201B7株。绿色显示TH阳性细胞的细胞体(cellbody)， 红色显示NURR1阳性细胞的核。
图5显示免疫荧光染色的结果，其是通过诱导底板细胞的分化,在诱导 后13天起，通过添加抗坏血酸(AA)、二丁酰基-cAMP(dbcAMP)和 PD0325901(PD)来培养细胞，并且在第45天(253G1株)或第52天(201B7株) 使用抗-TH抗体、抗-NURR1抗体和抗-FOXA2抗体进行免疫荧光染色而得 到的结果。作为细胞株，使用了253G1株和201B7株。绿色显示TH阳性 细胞的细胞体,红色显示NURR1阳性细胞的核,洋红显示FOXA2阳性细胞的 核，以及蓝色(DAPI染色)显示细胞核。
图6显示以高倍率对图5中的使用253G1株所得到的结果进行观察。。 绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示NURR1阳性细胞的核，以及蓝 色(DAPI染色)显示细胞核。
图7显示在以与图5中相同的方式进行了分化诱导后，在培养的第50 天，评价以高-KCl刺激释放多巴胺的能力的结果。作为细胞株，使用了253G1 株和201B7株，并且显示了两个独立试验的结果。Ctrl显示用HBSS刺激 的情况，KCL显示用含有55mMKCl的HBSS刺激的情况。Y轴的值显示 当以对照组中的多巴胺释放量作为1时的相对值，误差棒显示标准偏差。
图8显示NURR1的表达偏差的结果，其是通过诱导底板细胞的分化,在 诱导后13天起，通过除抗坏血酸(AA)和二丁酰基-cAMP(dbcAMP)外还添加 各种MEK抑制剂(包括FGFR抑制剂)来培养细胞，并且在第45天以定量 RT-PCR检测表达变化而得到的。作为细胞株，使用了253G1株和201B7 株。Y轴的值显示以GAPDH的拷贝数修正后的各基因的拷贝数，误差棒显 示标准偏差。.
图9显示由人iPS细胞诱导分化成底板细胞和多巴胺能神经元的方法 的模式图。
图10显示当根据图9的方法进行分化诱导时，以定量RT-PCR进行检 测的各种分化标记物的经时表达变化的结果。[All]、[-]、[-SHH]和[-Pur]分 别表示：根据图9进行了分化诱导、排除了CHIR99021、LDN193189、 SB431542、SHH和purmorphamine、排除了单独的SHH、以及排除了单独 的purmorphamine。作为细胞株，使用了253G1株和201B7株。Y轴的值显 示以GAPDH的拷贝数修正后的各基因的拷贝数，误差棒显示标准偏差。.
图11显示多巴胺能神经元标记物的表达变化的结果，其是通过在图9 所示的步骤3中通过添加抗坏血酸(AA)、二丁酰基-cAMP(dbcAMP), PD0325901(PD)和激活素A(Act)的各种组合来诱导分化，并且在培养的第26 天以定量RT-PCR检测多巴胺能神经元标记物的表达变化而得到的。[-]显 示没有添加各分化诱导因子。作为细胞株，使用了253G1株和201B7株。 Y轴的值显示以GAPDH的拷贝数修正后的各基因的拷贝数，误差棒显示标 准偏差。.
图12显示在与图11同样方式地分化诱导后，在培养的第26天，使用 抗-TH抗体和抗-NURR1抗体进行的免疫荧光染色的结果。作为细胞株，使 用了253G1株和201B7株。绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示 NURR1阳性细胞的核。
图13显示多巴胺能神经元标记物的表达变化的结果，其是通过在图9 所示的步骤3中，通过添加抗坏血酸(AA)、二丁酰基-cAMP(dbcAMP)、 PD0325901(PD)和激活素A(Act)的各种组合来诱导分化，在培养的第26天 将细胞冻结保存，将细胞解冻，通过添加AA、dbcAMP,PD和ACT的各种 组合培养细胞2周，并且在培养的第26天以定量RT-PCR检测多巴胺能神 经元标记物的表达变化而得到的。[-]表示没有添加各种分化诱导因子。作为 细胞株，使用了253G1株和201B7株。Y轴的值显示以GAPDH的拷贝数 修正后的各基因的拷贝数，误差棒显示标准偏差。
图14显示进行了免疫荧光染色的结果，其是通过与图13中的相同的方 式将冻结保存的细胞解冻，通过添加AA、dbcAMP、PD和ACT培养细胞 2周，并且使用抗-TH抗体和抗-NURR1抗体进行免疫荧光染色而得到的。 绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示NURR1阳性细胞的核，以及蓝 色(DAPI染色)显示细胞核。
图15显示组织染色的结果，其是通过在图9所示的步骤3中，通过添 加抗坏血酸、dbcAMP、PD0325901(对照组；左侧四个板(panel))或抗坏血酸、 dbcAMP、PD0325901和激活素A(激活素A组；右侧四个板)进行诱导分化， 在培养的第26天回收细胞，将细胞移植入小鼠纹状体，并且在移植4周后 进行组织染色而得到的。绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示hNuc 阳性细胞的核，以及蓝色(DAPI染色)显示细胞核。
图16显示以图15相同的方式移植后以及移植8周后的组织染色结果。 绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示hNuc阳性细胞的核，以及蓝色 (DAPI染色)显示细胞核。
图17显示以图15相同的方式移植后以及移植12周后的组织染色结果。 绿色显示TH阳性细胞的细胞体，红色显示hNuc阳性细胞的核,以及蓝色 (DAPI染色)显示细胞核。
(发明的详细说明)
本发明解释如下。本发明说明书中的术语与其在相关领域通常具有的含 义相同，除非特别指明。
在本说明书中，“多巴胺能神经元”是指具有能够产生多巴胺(3,4-二羟基 苯基乙基胺)的能力的神经细胞。多巴胺能神经元不需要在所有时间都产生 多巴胺，其只需要具有多巴胺产生能力。产生的多巴胺的量没有特别限定。
体内的多巴胺能神经元中，尤其是存在在中脑例如黑质致密部 (substantianigraparscompacta)、腹侧被盖部(ventraltegmentum)等中的多巴胺 能神经元，能够通过体外特定细胞标记物例如酪氨酸羟化酶(TH),FOXA2 (forkheadboxA2),NURR1(NuclearReceptor-related1)基因/蛋白等的表达来 特征化。此外，上述存在于中脑中的多巴胺能神经元也能够通过体外特定细 胞标记物例如TH,FOXA2,LMX1A(LIMhomeoboxtranscriptionfactor1 alpha),NURR1基因/蛋白等的表达来特征化。
本发明的通过将底板细胞进行本发明的方法而得到的“多巴胺能神经 元”是存在于中脑的多巴胺能神经元(i.e.，中脑多巴胺能神经元)。
在本说明书中，“神经前体细胞”是指在分化后能够产生多巴胺能神经元 的细胞，具体指例如底板细胞、表达标记物例如中间丝蛋白Nestin (intermediatefilamentproteinNestin)等特征化的神经外胚层细胞等，最优选是 底板细胞。
在本说明书中，“底板细胞(floorplatecell)”是指位于从脊髓到间脑、神 经管的腹侧正中的形态特殊化的组织细胞(organizercell)。在底板细胞中，尤 其是位于腹侧中脑的底板细胞，特征在于体外特定的细胞标记物例如 FOXA2,LMX1A基因/蛋白等的表达。
在本说明书中，“干细胞”是指能够在体外被培养且能够分化成构成生物 体的多种系列的细胞。它具体包括ES细胞、来自胎儿原始生殖细胞的多能 性干细胞(EGcell:ProcNatlAcadSciUSA.1998,95:13726-31)、来自精巢 的多能性干细胞(GScell:Nature.2008,456:344-9)、来自体细胞的人工多能性 干细胞(inducedpluripotentstemcell；iPS细胞)、以及人多能性体性干细胞(神 经干细胞)，优选iPS细胞和ES细胞，更优选iPS细胞。
作为ES细胞，可以使用来自任何温血动物的ES细胞，优选哺乳动物。 哺乳动物的示例包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、 马、山羊、猴和人。ES细胞的优选示例包括来自人的ES细胞。
ES细胞的具体示例包括，通过培养着床以前的早期胚而建立的哺乳动 等的ES细胞，通过培养由体细胞的核的核移植而制备的早期胚而建立的ES 细胞，和通过基因工程方法将这些ES细胞的染色体上的基因进行改变而得 到的ES细胞。
各ES细胞能够根据相关领域通常采用的方法或已知的文献来制备。
小鼠ES细胞是由Evans等(1981,Nature292:154-6)和MartinGR.等 (1981,ProcNatlAcadSci78:7634-8)在1981年建立的，能够从例如Sumitomo DainipponPharmaCo.,Ltd.(Osaka,Japan)等购买。
人ES细胞是由Thomson等(Science,1998,282:1145-7在1998年建立的， 可以从WiCellResearchInstitute(website:http://www.wicell.org/,Madison, Wisconsin,USA),USNationalInstituteofHealth,KyotoUniversity等获得，且 能够从例如Cellartis(website:http://www.cellartis.com/,Sweden)等购买。
作为iPS细胞，可以使用来自温血动物优选哺乳动物的iPS细胞。哺乳 动物的示例包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、马、 山羊、猴和人。iPS细胞的优选示例包括来自人的iPS细胞。
iPS细胞的具体示例包括将多个基因导入到体细胞例如皮肤细胞而得到 的获得了ES细胞同样的多分化能的细胞等。例如，通过引入Oct3/4基因、 Klf4基因、c-Myc基因和Sox2基因而得到的iPS细胞，和通过引入Oct3/4 基因、Klf4基因和Sox2基因而得到的iPS细胞(NatBiotechnol2008；26: 101-106)。除了这些，还可以列举进一步降低转基因的方法(Nature.2008Jul 31；454(7204):646-50)，使用低分子量化合物的方法(CellStemCell.2009Jan 9；4(1):16-9,CellStemCell.2009Nov6；5(5):491-503)，使用转录因子蛋白代 替基因的方法(CellStemCell.2009May8；4(5):381-4)等。
制备的iPS细胞能够不依赖于其制备方法而用于本发明中。
人iPS细胞株的示例包括，具体来说，253G1株(在36岁女性的皮肤 成纤维细胞中表达OCT4/SOX2/KLF4而制备的iPS细胞株),201B7株(在36 岁女性的皮肤成纤维细胞中表达OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC而制备的iPS细 胞株),1503-iPS(297A1)(在73岁女性的皮肤成纤维细胞中表达 OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC而制备的iPS细胞株),1392-iPS(297F1)(在56岁 男性的皮肤成纤维细胞中表达OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC而制备的iPS细胞 株),NHDF-iPS(297L1)(在新生儿男性的皮肤成纤维细胞中表达 OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC而制备的iPS细胞株)等。
1.多巴胺能神经元的制备方法
本发明提供多巴胺能神经元的制备方法，该方法包括使底板细胞进行下 述步骤(1):
(1)在含有(i)cAMP(cyclicadenosinemonophosphate)类似物和(ii)MEK 抑制剂的培养基中进行培养的步骤(此后有时称为本发明的制备方法)。
得到用于本发明的制备方法的神经前体细胞的方法没有特别限定，所述 细胞能够直接从作为对象的动物胚胎中回收。为了得到大量的神经前体细 胞，优选其以干细胞作为原料来制备。
由干细胞得到神经前体细胞的方法没有特别限定，可以采用其本身已知 的方法，包括在低分子量BMP抑制剂的存在下培养多能性干细胞的方法， 与基质细胞共培养而分化诱导的方法(SDIAmethod)等。
本发明的制备方法中所用的神经前体细胞可以为任何，只要其能够在分 化后产生多巴胺能神经元，但底板细胞最优选用作起始细胞。因此，下面具 体描述将干细胞分化为底板细胞的方法。
1-1.将干细胞分化为底板细胞的方法
该分化方法包括在含有底板细胞分化诱导因子的培养基中培养干细胞 的步骤。
在本分化方法(分化诱导方法)中，干细胞通常在培养瓶中培养。此处所 用的培养器的示例包括烧瓶，组织培养瓶，皿，陪替培养皿(petridish),组织 培养皿,multidish,微板,微孔板,multiplate,多孔板,chamberslide,陪替培养 皿,管,托盘,培养袋,和滚瓶(rollerbottle)。优选皿，陪替培养皿,组织培养 皿multidish,微板,微孔板,multiplate,多孔板等。培养器优选施用有用适合 干细胞的维持和培养的涂层。具体地，优选使用用饲养细胞或细胞外基质组 分涂覆的培养器。饲养细胞没有特殊限定，例如可以提到成纤维细胞(小鼠 胚胎成纤维细胞(MEF)，小鼠成纤维细胞(STO)等)。饲养细胞优选用本身已 知的方法失活，例如放射线照射(伽玛射线等)，用抗-癌剂处理(丝裂霉素C 等)等。细胞外基质组分的示例包括纤维蛋白，例如明胶，胶原蛋白，弹性 蛋白(elastin)等,糖胺聚糖(glucosaminoglycan)和蛋白聚糖(proteoglycan)例如 透明质酸，硫酸软骨素等，细胞粘合性蛋白例如纤连蛋白(fibronectin),玻连 蛋白(vitronectin),层连蛋白(laminin)等,基底层组分例如Matrigel等，等。
在分化方法中所用的底板细胞分化诱导因子没有特别限定，只要其是诱 导分化成底板细胞的物质即可，可以使用任何作为底板细胞分化诱导因子已 知的物质。所述物质包括低分子量的化合物，肽，蛋白等。底板细胞分化诱 导因子的示例包括BMP抑制剂例如Noggin，LDN-193189(4-(6-(4-(哌嗪-1- 基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉盐酸盐)，dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-1- 基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-a]嘧啶)等；TGFβ家族抑制剂例如 SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-yl)-5-(2-吡啶)-1H-咪唑-2-基]-苯甲 酰胺),A-83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-4-喹啉-4-基吡 唑)等；GSK3β抑制剂例如CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基 -1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈),BIO(6-溴-靛玉红 (indirubin)-3’-肟)等；Smoothened激动剂例如purmorphamine(N-(4-吗啉代苯 基)-2-(1-萘基氧基)-9-环己基-9H-嘌呤-6-胺),SAG(N-甲基-N’-(3-吡啶苄 基)-N’-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷)等，以及生长因子例如 Sonichedgehog(SHH)，成纤维细胞生长因子-8(FGF8)等。这些能够从Axon MedchemBV,WakoPureChemicalIndustries,Ltd.,EnzoLifeSciences,Inc., MerckBioscience,Tocrisbioscience,Stemgent,Inc,Sigma,R&D,PeproTech, Inc.等购买，相同的名称或相同的商品名表示相同的物质，结构和性质是同 样的，与制造商无关。即使它们不能作为产品而商业获得，本领域技术人员 也能够根据已知的方法制备它们。
本发明人发现，通过在含有LDN193189、SB431542、purmorphamine 和CHIR99021(SHH是任选含有的)的培养基中进行初次培养3-5天，然后在 含有LDN193189和CHIR99021的培养基中进行5-8天的二次培养的分化方 法，干细胞向底板细胞的分化能够有效的被诱导。
因此，通过组合使用LDN193189、SB431542、purmorphamine和 CHIR99021作为上述的底板细胞分化诱导因子，即使不在培养基中添加蛋白 组分例如SHH等，干细胞也能够有效的诱导分化为底板细胞，底板细胞以 及进一步地多巴胺能神经元能够比以前低成本的制备。
在该分化方法中，底板细胞分化诱导因子在培养基中的浓度根据所用的 因子的种类进行适当地确定，例如当用作底板细胞分化诱导因子时， LDN193189、purmorphamine和CHIR99021的浓度为，每种通常为0.05-10 μM，优选0.1-5μM。当SB431542用作底板细胞分化诱导因子时，浓度通常 为1-20μM，优选5-15μM。当SHH用作底板细胞分化诱导因子时，浓度通 常为10-500ng/ml，优选100-300ng/ml。
用于该分化方法的培养基没有特别限定，只要其含有上述底板细胞分化 诱导因子即可，通常，其是用于干细胞培养的培养基(下文有时也称作基础 培养基)中添加有底板细胞分化诱导因子。
上述基础培养基没有特别限定，只要其能用于动物细胞的培养即可，例 如Neurobasal培养基,Neurobasal-A培养基,NeuralProgenitorBasal培养基, NS-A培养基,BME培养基,BGJb培养基,CMRL1066培养基,GlasgowMEM 培养基,ImprovedMEMZincOption培养基,IMDM培养基,Medium199培养 基,EagleMEM培养基,αMEM培养基,DMEM培养基,DMEM/F12培养基, ham培养基,RPMI1640培养基,Fischer’s培养基,以及它们的混合培养基等。 这些基础培养基可以从Invitrogen,SIGMA,WakoPureChemicalIndustries, Ltd.,SumitomoDainipponPharmaCo.,Ltd.等购买，培养基的相同名称或商品 名表示相同的培养基组成，而与制造商无关。由于分化诱导为底板细胞能够 有效地进行，优选DMEM/F12培养基,Neurobasal培养基,以及它们的混合培 养基用作基础培养基。
在该分化方法中使用的培养基可以是含血清培养基或不含血清培养基。 作为此处使用的不含血清培养基，是指不含无调整的或未精制的血清的基础 培养基，含有精制的血液由来成分、动物组织由来成分(e.g.,生长因子)的 培养基对应于不含血清培养基。当用于该分化方法的培养基是含血清培养基 时，哺乳动物的血清例如胎牛血清等可以用作血清。培养基中的血清浓度通 常是0.01-20wt％，优选0.1-10wt％。
在该分化方法中所用的培养基也可以含有血清代替物。血清代替物的示 例包括白蛋白(e.g.,脂质富集白蛋白),转铁蛋白,脂肪酸,胶原前体,微量元素 (e.g.,锌,硒),B-27补充物(B-27supplement),N2补充物(N2supplement),敲 除血清替代物(knockoutSerumReplacement),2-巯基乙醇,3’硫代甘油 (3’thiolglycerol),和它们的等价物。在培养基中它们的浓度与前述的培养基 中的血清的浓度相同。
在该分化方法中，N2补充物(supplement)和B-27补充物 (supplement)(BrewerG.J.等,J.Neurosci.Res.(1993)35,567)是优选作为血清 代替物而添加到培养基中。
在这种情况下，N2supplement在培养基中的浓度优选是0.1-10wt％， 更优选是0.5-2wt％，B-27supplement的浓度优选是0.1-10wt％,更优选是 1-5wt％。
所述的敲除血清替代物(knockoutSerumReplacement)能够从Invitrogen 购买。其他的血清代替物能够从Invitrogen,SIGMA,WakoPureChemical Industries,Ltd.,SumitomoDainipponPharmaCo.,Ltd.等购买，试剂或添加剂 的相同名称或商品名表示相同的组成，而与制造商无关。
该分化方法中使用的培养基也可以含有磷酯，氨基酸(e.g.,非必须氨基 酸),维生素,生长因子,细胞因子,抗氧化剂,2-巯基乙醇,丙酮酸,缓冲剂, 无机盐,抗生素(e.g.,青霉素和链霉素或抗菌剂(e.g.,两性霉素B)等。在培 养基中它们的浓度与前述在培养基中血清的浓度相同。
其他培养条件例如培养温度、CO2浓度等可以适当确定。培养温度没有 特别限定，可以是例如约30-40℃,优选约37℃。CO2浓度是例如约1-10％, 优选约5％。
在该分化方法中，干细胞向底板细胞的分化可以通过评价被底板细胞特 异性表达的蛋白和基因(在本说明书中，上述蛋白和基因有时称作底板细胞 标记物)来确认。上述的底板细胞标记物的评价可以通过如下来进行，例如， 利用抗原-抗体反应的蛋白表达的评价方法，利用定量RT-PCR的基因表达的 评价方法等。上述底板细胞标记物(其分化成中脑)的示例包括FOXA2和 LMX1A基因/蛋白。
1-2.由神经前体细胞制备多巴胺能神经元的方法(本发明的制备方法)
通过上述分化方法得到的神经前体细胞例如底板细胞等，通过在含有 (i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂的培养基中培养的步骤，能够进一步分化 为多巴胺能神经元。当底板细胞用作神经前体细胞时，通常用于从底板细胞 分化诱导为多巴胺能神经元时，向培养基中添加神经营养因子例如脑由来的 神经营养因子(BDNF)、glial细胞株由来的神经营养因子(GDNF)等，然而， 在本发明的制备方法中，这种添加变为不是必须的。
本发明的制备方法中所用的cAMP类似物没有特别限定，只要其是具有 与cAMP相似结构的化合物，并且在与细胞接触时能够提高细胞内cAMP 浓度。
上述cAMP类似物的示例包括8-溴-cAMP,二丁酰基-cAMP,N6-苯甲酰 基-cAMP,8-硫代甲基-cAMP等。这些可以从Sigma,MerckBioscience,Wako PureChemicalIndustries,Ltd.等购买，相同的名称或相同商品名表示相同的物 质并且结构和性质是等同的，而与制造商无关。即使它们不能作为产品商业 获得，本领域技术人员也可以根据已知的文献制备它们。
作为本发明的制备方法中所用的cAMP类似物，优选二丁酰基-cAMP。
cAMP类似物在培养基中的浓度根据所使用的cAMP类似物的种类进行 适当确定，二丁酰基-cAMP作为cAMP类似物的浓度通常为0.01-5mM,优 选0.1-1mM。
本发明的制备方法中所用的MEK抑制剂是指具有MAP激酶(Mitogen 活化蛋白激酶/ERK激酶；MEK)抑制活性的物质,以及MEK信号传导通路的 上游因子的抑制剂(e.g.,FGF受体抑制剂)也包括在本发明的MEK抑制剂的 范围内，只要它抑制MEK的活性。
上述MEK抑制剂的示例PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二 氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺),PD184352(2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N- 环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺),SU5402(3-[4-甲基-2-(2-氧代-1,2-二氢-吲 哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸),PD173074(N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基] 氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N’-(1,1-二甲基)脲)等。 这些能够从AxonMedchemBV,WakoPureChemicalIndustries,Ltd.,Enzo LifeSciences,Inc.,MerckBioscience,Tocrisbioscience,Stemgent,Sigma等购 买，相同的名称或相同商品名表示相同的物质并且结构和性质是等同的，而 与制造商无关。即使它们不能作为产品商业获得，本领域技术人员也可以根 据已知的文献制备它们。
此外，用于MEKmRNA的反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide), siRNA等也能够用作MEK抑制剂。它们可以商业获得，或者能够根据之前 的报道进行合成。
作为用于本发明的制备方法的MEK抑制剂，优选PD0325901,PD184352 或SU5402。
MEK抑制剂在培养基中的浓度根据所用的MEK抑制剂的种类来适当 确定，PD0325901或PD184352用作MEK抑制剂的浓度通常是0.1-10μM,优 选1-5μM。SU5402用作MEK抑制剂的浓度通常是0.1-20μM,优选5-15μM。
在本发明的制备方法中，cAMP类似物和MEK抑制剂可以同时加入到 培养基中，或者以间隔的方式(staggeredmanner)加入到培养基，只要它们能 诱导从神经前体细胞分化为多巴胺能神经元。cAMP类似物和MEK抑制剂 简便并且优选地同时添加到培养基。
本发明的制备方法中所用的培养基，通过将cAMP类似物和MEK抑制 剂添加到上述1-1示例的分化方法中示例的基础培养基而制备(当需要时任 选含有各种上述示例的添加剂、血清或血清代替物)。
本发明的制备方法中所用的培养基可以使用与前述底板细胞的制备方 法中所用的基础培养基同种的培养基来制备，或者使用不同种的基础培养基 来制备。然而，优选使用同种的基础培养基来制备。
通过在上述cAMP类似物和MEK抑制剂之外，还添加抗坏血酸或其盐 至本发明的制备方法中所用的培养基，可以更有效地制备高品质多巴胺能神 经元。
可在本发明的制备方法中使用的抗坏血酸盐的示例包括但不限于，抗坏 血酸钠,抗坏血酸钾,抗坏血酸钙等。
抗坏血酸或其盐添加到培养基中时的浓度通常为0.01-10mM,优选 0.05-1mM。
抗坏血酸或其盐可以与cAMP类似物和MEK抑制剂同时加入到培养 基，或者可以以间隔的方式分开加入到培养基中，只要能够诱导从神经前体 细胞分化为多巴胺能神经元。抗坏血酸或其盐简便地并且优选地与cAMP类 似物和MEK抑制剂同时加入到培养基。
在本发明的制备方法中，通过在除了上述cAMP类似物和MEK抑制剂 之外，还添加有激活素受体样激酶-4,7的活化剂的培养基中培养神经前体细 胞，能够更有效地制备高品质的多巴胺能神经元，而且分化为多巴胺能神经 元的分化诱导时期可以缩短。激活素受体样激酶-4,7的活化剂没有特别限定， 只要它活化激活素受体样激酶-4和/或激活素受体样激酶-7，例如可以提到 nodal,GDF-1,Vg1,激活素等。优选是激活素(特别是，激活素A).
激活素是24kD肽性细胞增殖和分化因子，属于TGFβ(转化生长因子β) 家族,其中两个β亚单元通过SS键构成了二聚体(Ling,N.,等,(1986)Nature 321,779-782；Vale,W.,等,(1986)Nature321,776-779)。激活素已知包括激活 素A,B,C,D和AB。在本发明的制备方法中，可以使用任何激活素A,B,C, D,AB。当激活素用于本发明的制备方法时，激活素A尤其优选用作激活素。 作为激活素，可以使用来自任何哺乳动物例如人、小鼠等的激活素。当激活 素用于本发明的制备方法中时，优选使用与所用的神经前体细胞相同动物种 由来的激活素。例如，当使用来自人的神经前体细胞作为起始原料时，优 选使用来自人的激活素。这些激活素可以商业获得。
本发明的制备方法中的激活素在培养基中的浓度，根据所使用的激活素 的种类适当决定，激活素A用作激活素的浓度通常是.1-200ng/ml，优选5-150 ng/ml，更优选10-100ng/ml。
激活素可以与AMP类似物和MEK抑制剂同时添加到培养基中，或者 可以以间隔方式分开加入到培养基中，只要从神经前体细胞分化为多巴胺能 神经元能够诱导。激活素简便地并且优选与cAMP类似物和MEK抑制剂同 时加到培养基中。
本发明的制备方法通过在适合培养神经前体细胞的培养温度(通常 30-40℃，优选约37℃)，在通气1-10％(优选5％)二氧化碳的CO2温育箱中 培养而进行。
在本发明的制备方法中，神经前体细胞向多巴胺能神经元的分化可以通 过评价被多巴胺能神经元特异性表达的蛋白和基因的表达变化来确认(在本 说明书中，上述蛋白和基因有时称为多巴胺能神经元标记物)。上述多巴胺 能神经元标记物的表达变化的评价，可以通过如下来进行，例如，利用抗原 -抗体反应的蛋白表达的评价方法，利用定量RT-PCR的基因表达的评价方法 等。上述多巴胺能神经元标记物(其存在于中脑)的示例包括酪氨酸羟化酶 (TH),FOXA2,LMX1A和NURR1基因/蛋白。
此外，本发明的制备方法得到的多巴胺能神经元是否具有与体内多巴胺 能神经元同等的功能，这可以通过评价多巴胺的释放、对于氧化应激和药物 刺激的应答性来确认。
使用本发明的制备方法，使用上述1-1的分化方法得到的底板细胞以外 的底板细胞或神经前体细胞作为起始原料，也可以有效地制备高品质的多巴 胺能神经元。
在本发明的制备方法中，通过有效诱导神经前体细胞分化为多巴胺能神 经元，可以大量制备高品质的多巴胺能神经元。由于多巴胺能神经元具有 与体内多巴胺能神经元相似的表型特征和功能，当用作在用于治疗由于多巴 胺的降低产出(释放)而引起的疾病的细胞移植治疗的药物时，它能获得高 移入率，所述疾病例如神经退行性疾病例如帕金森氏病等。此外，它作为开 发该疾病的治疗药物的工具有用。
本发明的制备方法的过程中得到的细胞和本发明的多巴胺能神经元可 以冻结保存和解冻。细胞的冷冻和解冻方法是相关领域已知的，并且没有特 别限制，只要它们不影响细胞的分化能、生存能、多巴胺生产能力即可。例 如，本发明的多巴胺能神经元可以通过用PBS清洗、用细胞分散溶液(e.g., Accutase(注册商标)InnovativeCellTechnologies)从培养皿中剥离，去除细胞 分散溶液，将细胞悬浮在冻结保存溶液(e.g.,cellbanker2(LSIMedience Corporation))中，从而保存在-80℃。解冻的示例包括：在恒温槽中在37℃ 解冻，通过离心清洗冻结溶液，以及悬浮在培养基中而使用的方法等。当在 本发明的制备方法的过程中得到的细胞是冷冻的和解冻的时，Nurr1阳性多 巴胺能神经元也能由解冻后的细胞诱导。
2.含有多巴胺能神经元的药物
本发明提供含有通过本发明的上述制备方法制备的多巴胺能神经元的 药物(有时在本说明书中简称为本发明的药物)。
如本文所用的，多巴胺能神经元没有特别限定，只要它是通过本发明的 制备方法得到的细胞。
在该药物中，多巴胺能神经元可以原样使用，也可以是通过过滤器滤过 等而浓缩得到的细胞块例如粒料(pellet)而使用。而且，该药物也可以添加有 保护剂例如DMSO(二甲基亚砜)等，冻结保存。为了更安全的使用该药物， 该药物可以在这样的条件下进行处理以使得保留作为多巴胺能神经元的功 能，病原体蛋白变性，例如加热处理、辐射处理等。例如，为了防止多巴胺 能神经元以大于所需的量生长，可以与上述处理组合对该药物进行下述等处 理：丝裂霉素C预处理等所致的生长抑制，将哺乳类天然不具备的代谢酶的 基因导入到该细胞，然后根据需要给与非活性型的药物，仅在导入有哺乳类 天然不具有的酶基因的细胞中，使该药物转变为毒物，使细胞死亡的方法(自 杀基因疗法)等。
由于本发明的该药物是安全的，具有低毒性，它可以给药于哺乳动物 (e.g.,人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、猴)。
作为本发明药物的给药形式(移植方法)，可以提到在NatureNeuroscience, 2,1137(1999)orNEnglJMed.；344:710-9(2001)中描述的方法。优选地，本 发明的药物给药(移植)至脑的多巴胺缺乏区域。
使用患者本人的细胞或者组织适合型允许范围的多巴胺供体的细胞而 制备得到的多巴胺能神经元，优选用作本发明的药物。当由于年龄、体质等 无法得到足够的细胞时，也可以将用聚乙二醇或硅(silicon)等胶囊、多孔性 的容器包埋的细胞进行移植，以避免排斥。本发明药物的剂量(移植的量)和 给药频率(移植的次数)可以根据接受给药的患者的年龄、体重、症状等进行 适当确定。
通过给药(移植)本发明的含有多巴胺能神经元的药物，其能够有效地在 患者体内移入，从而在患者体内有效地产生(释放)多巴胺。因此，本发明的 药物用于治疗由于多巴胺的降低产生(释放)所致的疾病，例如，神经退行性 疾病例如帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病、癫痫和精神分裂症 等。
3.其他用途
由于本发明的多巴胺能神经元具有与体内多巴胺能神经元相似的表型 特征，它可以用来筛选药物化合物，优选用于治疗退行性疾病的化合物。例 如，受试化合物是否可以用作药物，这可以通过添加单独的受试化合物或者 添加其与其他药物的组合至本发明的多巴胺能神经元中，并且测量神经细胞 的形态学或功能的变化来进行评价。作为测量功能变化的方法的实例，包括 测量从所述神经细胞产生的或释放的多巴胺的量。本文所用的多巴胺能神经 元优选是显示与所治疗对象的疾病相同的表型(phenotype)的细胞，尤其优选 是由来自所述疾病的体细胞所制备的干细胞进行诱导分化，从而制备的多巴 胺能神经元。
受试化合物的示例包括肽、蛋白、抗体、非肽化合物、合成化合物、发 酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物提取物、血浆等。本文所使用的受 试化合物可以形成盐。作为所述盐，可以使用：与药理学可接受的(e.g.,无 机酸、有机酸)或碱(e.g.,碱金属、碱土金属、铝盐)等形成的盐，作为这样 的盐的示例包括：与无机酸形成的盐(e.g.,盐酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐、硫 酸盐)，与有机酸(e.g.,乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石 酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐，钠盐， 钾盐，钙盐，镁盐，钡盐和铝盐。
使用上述筛选而得到的药物可以利用药理学可接受的添加剂根据已知 的方法制成制剂。
上述制剂的剂型的示例包括口服制剂，例如根据需要用糖包衣的片剂、 胶囊、elixir、微囊等；非胃肠道剂例如注射剂等。制剂中的活性成分(通过 上述筛选方法选出的化合物)的量例如是0.1-90wt％.
上述添加剂的示例包括粘合剂例如明胶、玉米淀粉、黄原胶(tragacanth)、 阿拉伯胶等；赋形剂例如结晶纤维素等；溶胀剂例如玉米淀粉、明胶、海藻 酸等；润滑剂例如硬脂酸镁等；甜味剂例如蔗糖、乳糖、多糖等；风味剂例 如薄荷,Gaultheriaadenothrixoil,樱桃等；液体载体例如脂肪油、注射用水、 植物油(e.g.,蓖麻油、椰子油、大豆油),缓冲剂(e.g.,磷酸缓冲剂、乙酸钠缓 冲剂)等；增溶剂(e.g.,乙醇、丙二醇、聚乙二醇)；非离子表面活性剂(e.g.,聚 山梨酯80TM,HCO-50)；稳定剂(e.g.,苯甲酸苄基酯、苄醇)；安抚剂(e.g.,苯 扎氯铵,盐酸普鲁卡因)；稳定剂(e.g.,人血清白蛋白、聚乙二醇)；防腐剂(e.g., 苄醇、苯酚)；抗氧化剂。
前述注射用水的示例包括盐水、含葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、氯化 钠的等渗溶液等。
由于上述筛选而得到的药物(优选地，退行性疾病的治疗药物)是安全的， 具有低毒性，它能够口服或非胃肠道给药于例如哺乳动物(e.g.,人、小鼠、 大鼠、兔、羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、猩猩(chimpanzee))。
药物的剂量和给药频率可以根据其作用、靶疾病、给药对象、给药途径 等来适当确定。
本发明的多巴胺能神经元也能够用于化合物的毒性评价。例如，受试化 合物是否具有毒性可以通过将受试化合物单独或与其他药物组合的方式加 入到本发明的多巴胺能神经元，测量神经细胞的形态或功能改变。作为测量 功能改变的方法的示例，包括测量由神经细胞产生或释放的多巴胺的量。
受试化合物的示例包括肽、蛋白、抗体、非肽化合物、合成化合物、发 酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆。此处的受试化 合物可以形成盐例如在上述筛选中提到的那些。
本发明的制备方法得到的多巴胺能神经元也能够用于核实药物研发靶 标和分析疾病机理等。
在另一实施方式中，本发明也提供用于由神经前体细胞制备多巴胺能神 经元的试剂和试剂盒，其包含：(i)cAMP类似物和(ii)MEK抑制剂。
上述试剂和试剂盒可进一步包含(1)抗坏血酸或其盐，和/或(2)激活素受 体样激酶-4,7的活化剂。
作为上述的cAMP类似物、MEK抑制剂和激活素受体样激酶-4,7的活 化剂，可以提到适用于本发明的制备方法的那些。
本说明书中引用的任何出版物中的内容，包括专利和专利申请，都固有 的通过引证来全部引入到本文中，达到其在本文中公开的程度。
本发明通过下述实施例进行更详细的说明，但本发明并不以任何方式受 限于下示的实施例。
实施例
[参考例1]
未分化的人iPS细胞的维持和培养
作为人iPS细胞，使用253G1株(NatureBiotechnology2008；26:101-106) 或201B7株(Cell.2007；131:861-872)。
处于未分化的状态的iPS细胞(253G1株或201B7株)以两种方式来维持 和培养：(i)使用饲养细胞的方法，(ii)不使用饲养细胞的方法。
(i)使用饲养细胞的方法
作为饲养细胞,使用小鼠成纤维细胞(mousefibroblasts)(MEFs, KITAYAMALABESCo.,Ltd.)，其经过了丝裂霉素C(WakoPureChemical Industries,Ltd.)处理而失去增殖活性，其被接种到明胶涂覆的板上。在该方 法中，将添加有4ng/mlbFGF(碱性成纤维细胞生长因子)(PeproTech)和0.5x 青霉素-链霉素(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)的用于灵长类动物ES细 胞的培养基(ReproCELLIncorporated)用作培养基，将细胞在37℃在5％CO2进行培养。将培养基每天交换，细胞每6-7天传代。就上述传代而言，采用 用于灵长类动物EScell的细胞剥离溶液(manufacturedbyReprocellInc.)，将 细胞块状的iPS细胞从板上剥离，剥离的iPS细胞接种于新的饲养细胞。
(ii)不使用饲养细胞的方法
在不使用饲养细胞的方法中，使用玻璃粘连蛋白(vitronectin)(Life Technologies)-涂覆的板。在该方法中,添加有0.5x青霉素-链霉素(WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)的Essential8(LifeTechnologies)用作培养基，细胞在 37℃在5％CO2.培养。每天交换培养基，细胞每6-7天传代。就上述传代而 言，使用添加有0.5mMEDTA的PBS将细胞块状的iPS细胞从板上剥离， 将剥离的iPS细胞接种在涂覆了玻璃粘连蛋白的新的板上。
[参考例2]
人iPS细胞的预培养
就分化诱导为底板细胞的预培养而言，将通过在参考例1中描述的方法 (i)或(ii)培养而维持的未分化的人iPS细胞接种在96孔板。
(i)当使用在饲养细胞上维持的iPS细胞时
将以细胞块的形式维持的iPS细胞用灵长类动物ES细胞用的细胞剥离 溶液处理10sec，轻轻地移液以一定程度地除去MEFs。然后，细胞用PBS 清洗，用Accutase(InnovativeCellTechnologies)在37℃处理5min，并且解 离直到得到单一细胞。然后，将分散在培养基中的iPS细胞以每孔1.5-2x104细胞的密度接种在96孔板，在37℃在5％CO2培养(预培养)一天。作为用 于接种的培养培养基，使用了添加有10μMY27632((R)-(+)-反-4-(1-氨基乙 基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺)(WakoPureChemicalIndustries,Ltd)的用于 灵长类动物的ES细胞的培养基。
(ii)当使用了未采用饲养细胞而保持的iPS细胞时
将以细胞块的形式维持的iPS细胞用添加有0.5mMEDTA的PBS处理 10min，并且解离直到得到单一细胞。然后，将分散在培养基中的iPS细胞 以每孔1.5-2x104细胞的密度接种在96孔板，在37℃在5％CO2培养(预培 养)一天。作为用于接种的培养培养基，使用添加有10μMY27632(WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)的Essential8。作为上述96孔板，使用以DMEM/F12 (LifeTechnologiesCorporation)稀释1/30-1/40的Matrigel(BD)在37℃涂覆过 夜的板。
[参考例3]
由人iPS细胞分化诱导成底板细胞
人iPS细胞向底板细胞的分化是通过下述方法来进行诱导的。
将上述参考例2中所述的预培养后的培养基交换成含有诱导分化成底 板细胞的因子(LDN193189(0.5μM,AxonMedChemB.V.)、SB431542(10μM, WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)、purmorphamine(0.5μM,Merck)、SHH (200ng/ml,R&Dsystems)和CHIR99021(1μM,AxonMedChem))的分化诱导 培养基(培养的第0天)，将细胞在37℃在5％CO2下培养5天。然后，将 培养基交换为含有0.5μMLDN193189和1μMCHIR99021的分化诱导培养 基，将细胞在37℃在5％CO2培养5-8天(合计10-13天)。此处，作为上述 分化诱导培养基，使用(a)含有2％B27(LifeTechnologiescorporation)和2 mMGlutaMaxI(LifeTechnologiescorporation)的Neurobasal(Life Technologies)(此后表示为Neuro/B27)，或者(b)含有1％N2(WakoPure ChemicalIndustries,Ltd.)和2％B27(LifeTechnologiescorporation)的 DMEM/F12(此后表示为N2B27)。在上述培养期间，培养基每3-4天进行交 换。
为了检测由于在诱导分化成底板细胞的因子(LDN193189,SB431542, purmorphamine,SHH和CHIR99021)的存在或不存在下，底板细胞标记物的 表达变化，将培养第13天的细胞回收，使用RNeasy(Qiagen)纯化总的RNA 级分。使用PrimeScriptRT反应试剂盒(TakaraBioInc.),合成了cDNA，进 行了定量RT-PCR，并且测量了底板细胞标记物FOXA2和LMX1A的基因表 达水平。结果示于图1。当加入全部5种LDN193189,SB431542,SHH, purmorphamine和CHIR99021时(图1中的All)，FOXA2和LMX1A显示 高表达。因此，可清楚地获知，底板细胞能够通过添加全部上述5种而有效 地诱导。即使当将SHH从上述5种中排除(图中的-SHH)时，FOXA2和 LMX1A的表达也上升至一定程度。因此，可考虑即使不使用SHH，也就是 说，仅加入作为分化诱导因子的化合物的情况下，底板细胞也能够被诱导。 此外，即使当除了上述5种之外，还添加作为将由人ES/iPS细胞分化成的 神经外胚层向中脑区方向诱导的因子而广泛使用的FGF8时，FOXA2和 LMX1A的表达几乎不变(图1中的All+FGF8)。因此，FGF8被认为是对 于该系统来说不是必需的。
然后，为了检测FOXA2和LMX1A蛋白在培养的第13天的表达，进 行了采用抗-FOXA2抗体和抗-LMX1A抗体的免疫荧光染色。将细胞通过使 用全部5种LDN193189、SB431542、SHH、purmorphamine和CHIR99021 来进行培养直到第13天，添加4％多聚甲醛(WakoPureChemicalIndustries, Ltd.)，将细胞在室温温育30min以固定细胞。将细胞与作为第一抗体的抗 -FOXA2抗体(sc-6544,SantaCruzBiotechnology,Inc.)和抗-LMX1A抗体 (AB10533,NihonMilliporeK.K.)反应，与作为第二抗体的与第一抗体的免疫 动物相对应的Alexa488-标记的第二抗体(Invitrogen)和Alexa568-标记的第二 抗体顺次反应，在荧光显微镜下观察。结果示于图2。即使当前述(a)和(b) 中的任一用作分化诱导培养基时，大部分细胞被观察到表达FOXA2和 LMX1A蛋白这两者。
由上述结果可以清楚地获知，底板细胞能够通过在添加有LDN193189, SB431542,SHH,purmorphamine和CHIR99021的分化诱导培养基中培养5 天，之后在添加有LDN193189和CHIR99021的分化诱导培养基中培养5-8 天而有效地诱导。
[实施例1]
由底板细胞至多巴胺能神经元的分化诱导
通过与参考例1-3中描述的类似的方法诱导底板细胞，在培养的第13 天，将培养基交换为(A)添加有3种因子0.1mM抗坏血酸(SIGMA)、0.5mM 二丁酰基-cAMP(SIGMA,后文也表示为dbcAMP)和3μMPD0325901的 Neuro/B27，或者(B)添加有2种因子0.1mM抗坏血酸和0.5mMdbcAMP的 Neuro/B27，并且将细胞在37℃在5％CO2培养30天以上。在上述培养期 间每3-4天交换培养基。
[实验例1]
多巴胺能神经元分化诱导后的中脑多巴胺能神经元标记物基因和标记 物蛋白的表达的分析
在培养的第45天，回收细胞，并且检测了对于中脑多巴胺能神经元的 分化、成熟以及机能维持极为重要的作为转录因子已知的NURR1的表达变 化。其结果示于图3。通过添加2种因子抗坏血酸和dbcAMP的分化诱导， NURR1的表达上升，并且通过在上述两种因子之外还添加PD0325901，该 表达进一步大幅上升。
然后，通过使用抗-TH抗体、抗-NURR1抗体和抗-FOXA2抗体的免疫 荧光染色检测了中脑多巴胺能神经元标记物TH、NURR1和FOXA2蛋白 的表达。通过与参考例1-3中描述的类似方法诱导了底板细胞，分化诱导是 通过在培养的第13天起，将培养基交换为(A)添加有3种因子抗坏血酸、 dbcAMP和PD0325901的Neuro/B27，或者是(B)添加有2种因子抗坏血酸和 dbcAMP的Neuro/B27来进行的，在培养的第45-52天添加4％PFA，并且将 细胞在室温固定30min。细胞与作为第一抗体的抗-TH抗体(AB152,Nihon MilliporeK.K.),抗-NURR1抗体(PP-N1404-00,PerseusProteomics)和抗 -FOXA2抗体(sc-6544,SantaCruz)反应，进一步地与作为第二抗体的与第一 抗体的免疫动物相对应的Alexa488-标记的第二抗体、Alexa568-标记的第二 抗体和Alexa647-标记的第二抗体顺次反应，在荧光显微镜下观察。结果示 于图4、图5和图6。在这两种情况下，都观察到了相似的细胞表达TH蛋 白，通过添加PD0325901(实施例1,(A))，采用了NURR1蛋白的染色清楚 地变为强阳性(图4)，并且观察到了很多同时表达TH、NURR1和FOXA2 蛋白的细胞(图5)。图6显示在高倍率观察时的染色图像。用253G1和201B7 株得到了几乎同样的上述结果。
因此清楚地获知，通过采用上述(A)Neuro/B27诱导底板细胞的分化， 与不添加cAMP类似物和MEK抑制剂相比较，中脑多巴胺能神经元能够被 数十倍的高效率地诱导。
[实验例2]
在添加有dbcAMP和PD0325901的培养基中诱导的多巴胺能神经元的 功能的评价
用参考例1-3中描述的类似的方法诱导底板细胞，分化诱导是通过在培 养的第13天起，将培养基交换为(A)添加有3种因子抗坏血酸、dbcAMP和 PD0325901的Neuro/B27，或者是(B)添加有2种因子抗坏血酸和dbcAMP 的Neuro/B27来进行的，在培养的第50天评价了以高-KCl刺激释放多巴胺 的能力。
上述评价是如下进行的。将分化诱导后的细胞的培养基交换为 Neuro/B27，并将细胞培养过夜。第二天将细胞在37℃在5％CO2下在 HBSS(LifeTechnologies，含钙和镁)中温育1小时，将培养基交换为HBSS(对 照)或添加有55mMKCl的HBSS，将细胞在37℃在5％CO2下温育15-30 min。在温育后，回收上清液并且通过过滤器(UFC30HVNB,NihonMillipore K.K.)。加入0.01NHCl和100μMEDTA，将所得的样品保存在-80℃，直到 开始分析。对于分析，采用了微量生物样品分析系统和HTEC500(Eicom Corporation)，电化学检测器EPC-500(EicomCorporation)，根据Eicom Corporation(EicominformationNo.25)的手册测量了样品中所含的多巴胺的 量。结果显示在图7中。通过采用前述的(A)Neuro/B27进行分化诱导，能 够清楚地检测到以高-KCl刺激而引起的多巴胺的释放量的增加。当采用前 述的(B)Neuro/B27进行分化的诱导时，基于批次不同，没有观察到多巴胺 释放。然而，当使用前述(A)Neuro/B27进行分化诱导时，即使是在不同的 批次，以高-KCl刺激而引起的多巴胺的释放量的增加也能检测到良好的重 现性。这暗示PD0325901稳定化了分化系统。尽管应答在253G1和201B7 株之间有一定程度的不同，当加入PD0325901时，可以稳定地检测到以高 -KCl刺激而引起的多巴胺的释放量的增加，从而可以确认在不同细胞株的 以高-KCl刺激而引起的多巴胺的释放量的增加。
[实施例2]
不同MEK抑制剂(包括FGFR抑制剂)的研究
代替前述(A)Neuro/B27中的PD0325901，使用含有PD184352(Axon MedChem)、SU5402(FGF受体(FGFR)抑制剂、WakoPureChemicalIndustries, Ltd.)和PD173074(FGFR抑制剂，AxonMedChem)中的任何的培养基，研 究了能否诱导中脑多巴胺能神经元。
通过与参考例1-3中描述的类似的方法诱导底板细胞，在培养的第13 天，将培养基交换为添加有下述的Neuro/B27：(1)3种因子抗坏血酸、dbcAMP 和PD0325901，(2)2种因子抗坏血酸和dbcAMP，(3)抗坏血酸、dbcAMP 和3μMPD184352，(4)抗坏血酸、dbcAMP和10μMSU5402，或(5)抗坏 血酸、dbcAMP和0.1μMPD173074，并且将细胞在37℃在5％CO2培养 30天以上。在上述培养期间每3-4天交换培养基。
在培养的第45天，回收细胞，检测了NURR1的表达变化。结果示于 图8。在253G1株中，NURR1的表达通过PD0325901、PD184352或SU5402 的加入而升高，在201B7株中，全部4种的添加使得NURR1的表达升高。 另一方面，已知活化MEK通路的PLX4032显示没有效果。
由上述结果，暗示MEK(或上游的FGFR)抑制作用引起NURR1的表达 升高。
[实验例3]
在分化诱导过程中各分化标记物的表达变化
基于上述参考例、实施例和实验例的结果，设定了由图9所示的三步组 成的多巴胺能神经元分化系统，检测了由未分化的iPS细胞的分化诱导过程 中各种分化标记物的表达。
在步骤1中，细胞在添加有0.5μMLDN193189、10μMSB431542、0.5 μMpurmorphamine、200ng/mlSHH和1μMCHIR99021的Neuro/B27中培 养5天。在步骤2中，细胞在添加有0.5μMLDN193189和1μMCHIR99021 的Neuro/B27中培养8天(合计13天)。在步骤3中，细胞在添加有0.1mM 抗坏血酸、0.5mMdbcAMP和3μMPD0325901的Neuro/B27中培养32天(合 计45天)。培养后，通过与参考例3类似的方法测量的各种分化标记物的经 时表达变化。表达分析的结果示于图10。
作为对照，将细胞培养在没有添加分化诱导因子的条件下(图中的-)、仅 排除SHH的条件下(图中的-SHH)、或仅排除purmorphamine(图中的-Pur)的 条件下。而且，对于在步骤2以后所有都按照图9中示出的条件进行了分化 诱导的组，也进行了研究。
在全部加入的条件下(图中的All)，底板细胞标记物FOXA2的表达上升 直到分化诱导的第7天，并且表达水平维持直到分化表达完成。分化为中脑 的底板细胞标记物LMX1A的表达伴随分化诱导而经时持续上升。多巴胺能 神经元标记物TH和NURR1的表达自培养的第20天起急剧增加。另一方 面，在仅排除了SHH(图中的-SHH)的条件下，观察到了与在全部添加的条 件下(图中的All)类似的表达模式，这暗示SHH不是必需的。然而，由于在 仅排除了purmorphamine(图中的-Pur)的条件下，FOXA2的表达低，因此 additionofpurmorphamine的添加被认为是对于底板细胞的诱导来说是必需 的。
[实施例3]
底板细胞分化诱导成多巴胺能神经元的效率
除了PD0325901以外，还寻找在步骤3中促进分化成多巴胺能神经元 的因子。作为结果，发现当在步骤3中添加激活素A时，分化成多巴胺能 神经元的效率提高。
用于参考例1-3中描述的类似的方法诱导底板细胞，在培养的第12天， 将培养基交换为添加有一种或更多种0.1mM抗坏血酸、0.5mMdbcAMP、 3μMPD0325901和20ng/ml激活素A(R&D)的Neuro/B27，或者是不添加 抗坏血酸、dbcAMP、PD0325901和激活素A的Neuro/B27来作为对照，将 细胞再培养14天(合计26天)。在培养后将细胞回收，并且以与参考例3 类似的方法检测了TH和NURR1的表达。结果示于图11。当仅添加激活素 A时，TH和NURR1的表达几乎不上升。然而，当激活素A与抗坏血酸和 dbcAMP一起添加时，TH和NURR1的表达显著上升，当PD0325901与抗 坏血酸、dbcAMP和激活素A一起添加时，表达进一步大幅上升。另一方面， 当添加抗坏血酸、dbcAMP和PD0325901时，在培养的第26的时间点，表 达水平比添加抗坏血酸、dbcAMP和激活素A时低。
接下来，多巴胺能神经元标记物TH和NURR1蛋白的表达通过采用抗 -TH抗体和抗-NURR1抗体的免疫荧光染色来检测。诱导了底板细胞，在培 养的第12天，将培养基交换为添加有一种或更多种0.1mM抗坏血酸、0.5 mMdbcAMP、3μMPD0325901和20ng/ml激活素A的Neuro/B27，或者是 没有添加分化诱导因子的Neuro/B27作为对照，将细胞再培养14天(合计 26天)。培养后，加入4％PFA，将细胞在室温固定30min。将细胞与作为 第一抗体的抗-TH抗体和抗-NURR1抗体反应，然后，顺次与作为第二抗体 的对应于第一抗体的免疫动物的Alexa488-标记的第二抗体和Alexa568-标记 的第二抗体反应，在荧光显微镜下进行观察。结果示于图12。观察到抗坏 血酸、dbcAMP、激活素A和PD0325901的同时添加显著增加了表达TH和 NURR1蛋白的细胞。这些结果与TH和NURR1基因表达变化的结果很好的 一致。
由上述结果可以清楚地获知，通过在在底板细胞诱导后添加抗坏血酸、 dbcAMP、PD0325901和激活素A，相比于通常，中脑多巴胺能神经元能够 在较短的分化诱导期间内(合计26天)有效的诱导。
[实验例4]
分化诱导的第26的冻结保存
通过与参考例1-3中描述的类似的方法诱导中脑底板细胞，在培养的第 12天，将培养基交换为添加有0.1mM抗坏血酸、0.5mMdbcAMP、3μM PD0325901和20ng/ml激活素A(R&D)的Neuro/B27，将细胞再培养14天 (合计26)。培养后，细胞用PBS清洗，通过用Accutase(InnovativeCell Technologies)在37℃处理20-30min而分散。离心洗净后，将细胞以大约2x 106细胞/ml/管的浓度悬浮在cellbanker2(JujiFieldInc.)，在-80℃冻结保存。
通过浸渍于37℃恒温槽中来将冻结保存的细胞解冻，在离心洗净后， 以2x104每孔的密度接种于96孔板中，在37℃在5％CO2培养2周。作为 上述96孔板，使用添加了用DMEM/F12(LifeTechnologiesCorporation)稀释 1/30-1/40的Matrigel，或者是以DMEM/F12稀释为浓度10μg/ml的Laminin (TrevigenInc.)，在37℃涂覆过夜的板。作为所述培养培养基，使用添加有 一种或更多种0.1mM抗坏血酸、0.5mMdbcAMP、3μMPD0325901和20 ng/ml激活素A的Neuro/B27，或者使用没有添加抗坏血酸、dbcAMP、 PD0325901和激活素A的Neuro/B27作为对照。
将解冻后培养2周的细胞回收，以与参考例3相似的方法检测T多巴胺 能神经元标记物TH、NURR1、FOXA2和LMX1A的表达变化。结果示于 图13。当同时添加抗坏血酸、dbcAMP、激活素A和PD0325901时，各分 化标记物显示最高的表达。当没有添加这些因子时(图中的-)，分化标记物的 表达水平低，这表明在解冻后，分化因子是必需的。这种情况下，针对Y27632 (10μM)的有无也进行了研究，该标记物的表达水平几乎没有没有差别。
接下来，通过采用抗-TH抗体和抗-NURR1抗体的免疫荧光染色检测了 TH和NURR1蛋白的表达。向解冻后培养了2周的细胞中加入4％PFA， 将细胞在室温固定30min。将细胞与作为第一抗体的抗-TH抗体和抗 -NURR1抗体反应，顺次与作为第二抗体的与第一抗体的免疫动物相对应的 Alexa488-标记的第二抗体和Alexa568-标记的第二抗体反应，在荧光显微镜 下观察。结果示于图14。
由上述结果可以清楚地获知，分化诱导的第26天的细胞能够被冻结保 存，通过在解冻后用添加了抗坏血酸、dbcAMP、激活素A和PD0325901的 培养，表达TH和NURR1蛋白的中脑多巴胺能神经元能够有效诱导。
[实验例5]
移植实验
通过参考例1-3中描述的类似的方法诱导中脑底板细胞，在培养的第12 天，将培养基交换为添加有0.1mM抗坏血酸、0.5mMdbcAMP、3μM PD0325901或0.1mM抗坏血酸、0.5mMdbcAMP、3μMPD0325901、20 ng/ml激活素A的Neuro/B27，将细胞再培养14天(合计26天)。培养后， 将细胞用PBS清洗，在37℃用TrypLEExpress(LifeTechnologies)处理10min 而分散。用Neuro/B27培养基将细胞浓度调整为1x105细胞/μl，将细胞保持 在冰上，直到移植。
移植到小鼠纹状体的实验如下进行。将12只8-周龄的雄性NODSCID 小鼠(CharlesRiverLaboratoriesJapan,Inc.)分成对照组和激活素A组(每 组6只小鼠)。将用添加有抗坏血酸、dbcAMP、PD0325901而培养的细胞用 于移植到对照组，将用添加有抗坏血酸、dbcAMP、PD0325901、激活素A 而培养的细胞用于移植到激活素A组。在戊巴比妥(50mg/kg,ip)麻醉下，将 小鼠的头手术区域的毛剪掉，施用isodine。数分钟后，用浸渍于0.1％Osvan 水溶液的Menban将isodine擦取出，对皮肤消毒，将小鼠固定于脑定位固定 装置(DavidKopf,DavidKopfInstrumentsinUSA)。将头皮从正中切开，剥 离骨膜，暴露出小鼠的Bregma和Lambda。纹状体的坐标参考“立体坐标中 的小鼠脑(Themousebraininstereotaxiccoordinates)”(AP:+0.5mm；ML:+1.8 mm)，用电钻(φ0.5mm)在头盖骨上开孔，Hamilton注射器从头盖骨表面插入 深度DV:-3.5mm，将细胞(1x105细胞/μl,2μl)用10min移植。移植后，头 部的切口被缝合，且让小鼠恢复。在一周后4周、8周、和12周，从每组 中抽样2只小鼠。将小鼠异氟烷(isoflurane)吸入麻醉下，小鼠被断头放血， 将头部用4％多聚甲醛(para-formaldehyde)固定24hr。将头盖骨去除后，将 脑用30％蔗糖溶液脱水24hr。然后，将脑冻结包埋，使用cryostat(Leica CM3050S)制作了冷冻切片(40μm)。多巴胺能神经元的组织染色使用抗-TH 抗体和抗-人特异性Nuclei抗体(MAB1281,NihonMilliporeK.K.)(hNuc)进 行。
移植4周后，在对照组的小鼠纹状体中轻微地观察到TH/hNuc双阳性 细胞(不超过5％(图15,左),而激活素A组，观察到很多TH/hNuc双阳性 细胞(不少于40％,图15,右)。移植8周后，在对照组的脑切片中TH/hNuc 双阳性细胞相比于4周时增加，在激活素A组中TH/hNuc双阳性细胞相比 于4周时进一步增加，为50％以上(图16)。移植12周后,在对照组的脑切 片中TH/hNuc双阳性细胞相比于8周时进一步增加，为小于10％。在激活 素A中,TH/hNuc双阳性细胞相比于8周时没有显示显著的增加(图17)。
基于上述结果，可以明显地获知，在诱导后，在添加有抗坏血酸、 dbcAMP、PD0325901和激活素A的培养基中培养后的中脑底板细胞，在小 鼠纹状体中被有效地分化成多巴胺能神经元，并且持续定着(colonized)3个 月以上。
本申请是基于在日本提交的专利申请No.2013-163062(申请日：2013 年8月6日)，其内容全部引入于本文中。
工业实用性
根据本发明，能够由神经前体细胞有效地制备高品质的多巴胺能神经 元。本发明制备的多巴胺能神经元具有与体内多巴胺能神经元相似的表型特 征和功能，因为它显示出通过常规方法制备的多巴胺能神经元中所没有观察 到的对于氧化应激和药物刺激的应答性等。因此，本发明制备的多巴胺能神 经元能够获得高移入率并且对于用于治疗由于多巴胺的降低产出(释放)而引 起的疾病(例如神经退行性疾病，例如帕金森氏疾病等)的细胞移植是极为有 用的，而且，而且也能够用于各种应用，例如筛选用于预防和/或治疗所述 疾病的化合物，化合物的毒性评价，药物研发靶标的核实，疾病机制的分析 等。