技术领域
本发明属于微藻养殖领域，尤其涉及一种极地雪藻固定化保种方法。
背景技术
雪藻snowalgae是生活在两极及相似极端环境中的一类特殊的单细胞微藻类群，已发现 有几十种，分属不同门类。大部分分布在雪地几厘米深的表层，冰雪融化时形成雪地藻华snow algalbloom，因细胞富含虾青素而呈深红色，因此又称血雪bloodsnow。其中极地雪藻 Chlamydomonasnivalis是一种淡水单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门Chlorophata、 绿藻纲Chlorophyceae、团藻目Volvocales。研究发现，细胞内的虾青素有抗紫外辐射功效。 极地雪藻最适生长温度是8-10℃，在营养丰富和低光强下保持绿色并快速生长，而在营养贫 乏和高光强等极端环境下细胞生长缓慢并开始大量积累红色类胡萝卜素一虾青素。极地雪藻 还具有生产高不饱和脂肪酸的潜在前途，在理想的培养条件下，极地雪藻含有的不饱和 脂肪酸占总脂肪酸的80％以上。
在微藻的培养和应用中，保种工作十分重要，它是微藻培养和进一步应用的基础和关键。 由于藻种极易受污染，分离和纯化技术较复杂而且耗时较长，因此在微藻保种中要尽量减少 接种次数，避免藻种被杂藻、细菌或原生动物污染。传统的保种方法是用褐藻酸钠或琼脂作 为主要固定剂，接种后的固体培养基置于温度为3-6℃，光照强度为1000-1500lx的条件下保 存。该方法存在很多缺点：保种时间短，为1-2年，营养盐消耗快，培养基易老化，需频繁 更换培养基，工作量大，细胞存活率低，仅为37％左右，易因污染而导致保种失败。
本发明是用蛋白胨代替传统的褐藻酸钠或琼脂作为主要固定剂，而且在培养基中增加了 碳酸氢钠、柠檬酸铁、山梨酸钾、葡萄糖、海泥抽提液、土壤抽出液、络合剂乙二胺四乙酸 等营养成分，营养更加全面并添加了乙二醇作为抗冻剂，接种后的培养基置于温度为-50±2 ℃、光照强度200-400lx的低温、弱光培养箱中保存。采用本方法保存极地雪藻能显著提高 藻细胞的存活率，存活率由原来的37％提高到了94％，大大降低了工作量，不易污染，种质 纯正，大大延长保种时间，长达6-8年而且保种成本降为原来的1/3。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种极地雪藻固定化保种方法，方法如下：
一种极地雪藻固定化保种所用软蛋白胨固体培养基，配方如下：
A溶液：NH4NO340毫克，NaNO35毫克，尿素5毫克，KH2PO41.8毫克，Na2SiO38毫克， NaHCO3500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海 藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰 乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三 聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡 水1000毫升；
B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4· 5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克， Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；
将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存； C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶，置于4℃低温冰箱备用；
从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液 1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调 节值到7.5左右，按重量比6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入重量 比0.5‰的乙二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧 瓶中，分装量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养 基置于高压灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，即可。
一种极地雪藻固定化保种方法，步骤如下：
(1)极地雪藻预先进行提纯和液体培养，以确保接种时藻种处于指数生长期，所述液体 培养是本领域常规的培养方法，只要能确保接种时藻种处于指数生长期即可；
(2)液体培养基的配制
A溶液：NH4NO340毫克，NaNO35毫克，尿素5毫克，KH2PO41.8毫克，Na2SiO38毫克， NaHCO3500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海 藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰 乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三 聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡 水1000毫升；
B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4· 5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克， Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；
C溶液：即f/2维生素溶液：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克， 蒸馏水1000毫开；
将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存； C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶(所述C溶液不要煮沸，因维生素遇高温易分 解变性)，置于4℃低温冰箱备用；
(3)软蛋白胨固体培养基制备
从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液 1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调 节值到7.5左右，按6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入0.5‰的乙 二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧瓶中，分装 量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养基置于高压 灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，次日待用。
(4)软蛋白胨固体培养基接种和培养
将软蛋白胨固体培养基放在六孔电热水浴锅中，调至42℃，此时软蛋白胨固体培养基呈 液化状态；于无菌超净工作台上，用液枪吸取0.1毫升藻种液，迅速注射到呈液化状态的培 养基中，摇匀，立即放到常温、流动的自来水中降温(30秒内完成)；然后将接种完毕的固 体培养基置于10±1℃的培养箱内培养，光强4000-5000lx，约15-20天，可见长出的藻细胞 团。
(5)低温保存
在超净工作台环境中挑选藻种群生长良好的三角烧瓶，在其表面覆盖0.2厘米厚的液体 培养基(用A溶液200毫升，B溶液1毫升，C溶液1毫升混合而成的单细胞培养液)，置 于-50±2℃的低温培养箱中，200-400lx弱光照射，在此培养条件下，藻种可保存6-8年。
有益效果极地雪藻传统的固定化保种方法是用褐藻酸钠或琼脂作为主要固定剂，接 种后的培养基置于温度3-6℃，光照强度1000-1500lx的环境中保存。该方法存在很多缺点： 保种时间短，为1-2年，营养盐消耗快，培养基易老化，需频繁地更换培养基，工作量大， 细胞存活率低，仅为37％左右，易因污染而导致保种失败。我发明的新方法是用蛋白胨代替 传统的褐藻酸钠或琼脂作为主要固定剂，而且在培养基中我增加了碳酸氢钠、柠檬酸铁、山 梨酸钾、葡萄糖、海泥抽提液等营养成分，有利于极地雪藻的存活，并添加了乙二醇作为抗 冻剂，接种后的培养基置于温度为-50±2℃、光强200-400lx的低温、弱光条件下保存。采用 新方法保存极地雪藻能显著提高藻细胞的生命活力，细胞存活率高达92％，大大降低工作量， 不易污染，种质纯正，大大延长保种时间，长达6-8年而且保种成本降为原来的1/3。
具体实施方式
极地雪藻培养基制备方法
1)九二0植物生长刺激素为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每 克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释；
2)因柠檬酸铁(FeC6H5O7·5H2O)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃， 并不断搅拌至全部融化；
3)各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
4)各种营养盐特别是f/2微量元素溶液和f/2维生素溶液均需预先配成母液备用；但放置时 间不要超过7天，且最好放进4℃冰箱冷藏保存备用；
5)人尿制备方法：取人尿1000毫升，烧瓶煮沸后冷却备用；
6)海泥抽取液制备方法：取比较肥沃又不於黑的海泥，以1份泥加2分淡水，充分搅拌均 匀，静置1-2分钟，取上层泥浆于铝锅中，按每1000毫升泥浆加1克NaOH的量加入 NaOH，煮沸20-30分钟。煮时需不断搅拌均匀，煮后静置24小时取上清液备用；
7)土壤抽出液制备方法：取土壤1千克，加蒸馏水1000毫升，再加入NaOH2-3克，煮沸 120分钟，冷却后过滤，将清液置于暗处静置2天，取上清液备用。
8)所有药品纯度均需化学纯级别。
极地雪藻固定化保种方法
1藻类生物材料预先进行提纯和液体培养，以确保接种时藻种处于指数生长期。
2液体培养基的配制
A溶液：NH4NO340毫克，NaNO35毫克，尿素5毫克，KH2PO41.8毫克，Na2SiO38毫克，NaHCO3500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海藻酸丙二醇酯 15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰乳酸钠8毫克， 焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三聚甘油单硬脂酸 酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡水1000毫升。
B溶液即f/2微量元素溶液：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4·5H2O10 毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克，Na2EDTA 4.35克，蒸馏水1000毫升。
C溶液即f/2维生素溶液：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克，蒸馏 水1000毫升。
将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存。C溶 液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶(不要煮沸，因维生素遇高温易分解变性)，置于4 ℃低温冰箱备用。
3软蛋白胨固体培养基制备
从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液1000 毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中。混合液用1％的氢氧化钠溶液调节值 到7.5左右，按6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入0.5‰的乙二醇， 搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化。培养液分装于100毫升的三角烧瓶中，分装量30毫 升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口。将上述配制好的固体培养基置于高压灭菌锅 中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，次日待用。
4软蛋白胨固体培养基接种和培养
将软蛋白胨固体培养基放在六孔电热水浴锅中，调至42℃，此时软蛋白胨固体培养基呈液化 状态。于无菌超净工作台上，用液枪吸取0.1毫升即100μl藻种液，迅速注射到呈液化状态的 培养基中，摇匀，立即放到常温、流动的自来水中降温(30秒内完成)。然后将接种完毕的 固体培养基置于10±1℃的培养箱内培养，光强4000-5000lx，约15-20天，可见长出的藻细 胞团。
5低温保存
在超净工作台环境中挑选藻种群生长良好的三角烧瓶，在其表面覆盖0.2厘米厚的液体培养 基(用A溶液200毫升，B溶液1毫升，C溶液1毫升混合而成的单细胞培养液)，置于-50 ±2℃的低温培养箱中，200-4001x弱光照射，在此培养条件下，藻种可保存6-8年。
一种极地雪藻固定化保种所用软蛋白胨固体培养基，配方如下：
A溶液：NH4NO340毫克，NaNO35毫克，尿素5毫克，KH2PO41.8毫克，Na2SiO38毫克， NaHCO3500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海 藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰 乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三 聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡 水1000毫升；
B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4· 5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克， Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；
将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存； C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶，置于4℃低温冰箱备用；
从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液 1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调 节值到7.5左右，按重量比6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入重量 比0.5‰的乙二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧 瓶中，分装量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养 基置于高压灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，即可。
一种极地雪藻固定化保种方法，步骤如下：
(1)极地雪藻预先进行提纯和液体培养，以确保接种时藻种处于指数生长期，所述液体 培养是本领域常规的培养方法，只要能确保接种时藻种处于指数生长期即可；
(2)液体培养基的配制
A溶液：NH4NO340毫克，NaNO35毫克，尿素5毫克，KH2PO41.8毫克，Na2SiO38毫克， NaHCO3500毫克，九二0植物生长刺激素8国际单位，山梨酸钾10毫克，葡萄糖50毫克、海 藻酸丙二醇酯15毫克，环己基氨基磺酸钠20毫克，蜂胶9毫克，麦芽糖醇8毫克，硬脂酰 乳酸钠8毫克，焦磷酸铁4毫克，柠檬酸钾6毫克，乙酸钠5毫克，山梨糖醇液1毫升，三 聚甘油单硬脂酸酯10毫克，人尿1毫升，海泥抽取液1毫升，土壤抽出液2毫升，煮沸纯净淡 水1000毫升；
B溶液：即f/2微量元素溶液：ZnSO4·4H2O23毫克，MnCl2·4H2O178毫克，CuSO4· 5H2O10毫克，FeC6H5O7·5H2O3.9克，Na2MoO4·2H2O7.3毫克，CoCl2·6H2O12毫克， Na2EDTA4.35克，蒸馏水1000毫升；
C溶液：即f/2维生素溶液：维生素B120.5毫克，维生素B1100毫克，维生素H0.5毫克， 蒸馏水1000毫升；
将上述A、B溶液煮沸消毒后，装入高压灭菌过的棕色试剂瓶中置于4℃冰箱低温保存； C溶液配制完后装入高压灭菌过的棕色试剂瓶(所述C溶液不要煮沸，因维生素遇高温易分 解变性)，置于4℃低温冰箱备用；
(3)软蛋白胨固体培养基制备
从冰箱中取出上述A和B两种溶液进行混合，使用前两个棕色瓶均充分摇匀，取A溶液 1000毫升，B溶液1毫升，混合于1500毫升的三角烧瓶中；混合液用1％的氢氧化钠溶液调 节值到7.5左右，按6‰的比例称重蛋白胨，加入三角烧瓶中，搅拌均匀，再加入0.5‰的乙 二醇，搅拌3分钟，后置于电热炉上加热融化；培养液分装于100毫升的三角烧瓶中，分装 量30毫升，三角烧瓶瓶口用无菌培养容器封口膜封口；将上述配制好的固体培养基置于高压 灭菌锅中灭菌，温度121℃，灭菌20-30分钟，取出冷却，次日待用。
(4)软蛋白胨固体培养基接种和培养
将软蛋白胨固体培养基放在六孔电热水浴锅中，调至42℃，此时软蛋白胨固体培养基呈 液化状态；于无菌超净工作台上，用液枪吸取0.1毫升藻种液，迅速注射到呈液化状态的培 养基中，摇匀，立即放到常温、流动的自来水中降温(30秒内完成)；然后将接种完毕的固 体培养基置于10±1℃的培养箱内培养，光强4000-5000lx，约15-20天，可见长出的藻细胞 团。
(5)低温保存
在超净工作台环境中挑选藻种群生长良好的三角烧瓶，在其表面覆盖0.2厘米厚的液体 培养基(用A溶液200毫升，B溶液1毫升，C溶液1毫升混合而成的单细胞培养液)，置 于-50±2℃的低温培养箱中，200-400lx弱光照射，在此培养条件下，藻种可保存6-8年。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前 述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。