一种人TSH受体全长CDNA的细胞株及其构建方法.pdf

本发明涉及一种细胞株及其构建方法。其技术方案如下：一种人TSH受体全长cDNA的细胞株，它由下列方法制得：(1)扩增hTSHR基因编码区的全部序列；(2)将hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体；(3)将hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化菌DH5α；(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。本发明优点表现在：将扩增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T载体，酶切鉴定确定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，并再次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。

1、  一种人TSH受体全长cDNA的细胞株，它由下列方法制得：
(1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列；
(2)将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以Kpn I/Xba I双酶切鉴定；
(3)将步骤(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；
(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；
(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。

2、  根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于：其制备方法还包括步骤(6)：用G418筛选步骤(5)得到的表达株。

3、  根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于：步骤(1)PCR中所用的引物如下：
上游引物为：5′-cta agaGAG TCC CGT GGA AAA TGA-3′
方框内为Kpn I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，
下游引物为：5′-ccc gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3′
方框内为Xba I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。

4、  一种人TSH受体全长cDNA的细胞株构建方法，包括以下步骤：
(1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列；
(2)将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以Kpn I/Xba I双酶切鉴定；
(3)将步骤(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；
(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；
(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。

5、  根据权利要求4所述的细胞株构建方法，其特征在于：还包括步骤(6)：用G418筛选步骤(5)得到的表达株。

6、  根据权利要求4所述的细胞株构建方法，其特征在于：步骤(1)PCR中所用的引物如下：
上游引物为：5′-cta agaGAG TCC CGT GGA AAA TGA-3′
方框内为Kpn I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，
下游引物为：5′-ccc gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3′
方框内为Xba I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。

一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种细胞株，尤其涉及一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法。
背景技术
促甲状腺激素(thyrotropin or thyrotrophin)又称甲状腺刺激激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)，它是由垂体前叶分泌的一种重要的糖蛋白激素，通过其特异的受体(即TSH受体)发挥促甲状腺的作用。TSH受体是一种重要的自身抗原，其相应的自身抗体在自身免疫性甲状腺疾病的发生过程中起着重要作用。
研究发现，TRAb具有异质性：有些TRAb和TSHR结合后发挥类似TSH的作用(刺激cAMP产生、摄碘及甲状腺球蛋白合成)，称为甲状腺刺激性抗体(thyroid stimulating antibodies，TSAb)；有些TRAb同TSH受体结合后抑制TSH介导的受体活化，称为甲状腺刺激阻断性抗体(thyroidstimulation-blocking antibody，TBAb)；还有一些TRAb同TSH受体结合后既无刺激作用也无抑制作用，称为中性TSH受体抗体(neutral TSHreceptor antibodies)。一般认为，如果TSH受体抗体以TSAb为主，临床上表现为Graves病；如果以TSBAb为主，临床上则表现为原发性甲状腺功能减退症。
目前临床常用的方法为Rees Smith等建立的体外竞争受体法，这种方法是以待测血清与¹²⁵I标记的TSH竞争结合TSH受体制剂，根据竞争的强弱判断待测血清TSH受体抗体水平。用这种方法测定的TSH受体抗体也称为TSH结合抑制免疫球蛋白(TSH binding inhibiting immunoglobulins，TBII)。TBII的主要缺点是只能反映抗体与TSH竞争TSH受体的能力，不能区分抗体的功能是刺激性还是阻断性。
随着人TSH受体的克隆，Vassart等将人TSH受体cDNA克隆到pSVL真核表达载体中，并将此载体转染到CHO细胞并筛选合适的稳定表达细胞，得到适于TSAb和TSBAb测定的细胞株，称为JP26细胞。该JP26细胞价格贵，不易获得，表达纯度不高，缺乏高效稳定表达。但在国内，有文献提及原核表达载体的构建，而涉及TSHR体外真核表达系统的研究较少，仅有一篇报道从人甲状腺组织中提取RNA，通过逆转录获得人TSHR膜外区cDNA，构建了TSHR膜外区真核表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞表达hTSHR膜外区蛋白分子(非全长cDNA)。由于国内缺乏高效稳定表达人TSH受体cDNA的细胞株，致使TSAb和TSBAb的测定难以开展，极大地阻碍了AITD的诊断、治疗和研究。
发明内容
本发明的目的在于：
(1)提供一种人TSH受体全长cDNA的细胞株；
(2)提供一种人TSH受体全长cDNA细胞株的构建方法。
本发明的技术方案如下：
1、一种人TSH受体全长cDNA的细胞株，它由下列方法制得：
(1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列；
(2)将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以Kpn I/Xba I双酶切鉴定；
(3)将步骤(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；
(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；
(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。
其中还包括步骤(6)：用G418筛选步骤(5)得到的表达株。
步骤(1)PCR中所用的引物如下：
上游引物为：5′-cta agaGAG TCC CGT GGA AAA TGA-3′
方框内为Kpn I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，
下游引物为：5′-ccc gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3′
方框内为Xba I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。
2、一种人TSH受体全长cDNA的细胞株构建方法，包括以下步骤：
(1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列；
(2)将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以Kpn I/Xba I双酶切鉴定；
(3)将步骤(2)得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3.1质粒；
(4)将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；
(5)pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染CHO细胞。
其中还包括步骤(6)：用G418筛选步骤(5)得到的表达株。
步骤(1)PCR中所用的引物如下：
上游引物为：5′-cta agaGAG TCC CGT GGA AAA TGA-3′
方框内为Kpn I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，
下游引物为：5′-ccc gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3′
方框内为Xba I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。
依照上述技术方案：本发明的具体实施方法是：
以人甲状腺组织cDNA为模板，以hTSHR基因特异的引物进行PCR扩增，得到目的基因片段特异性条带，目的片断与pGEM-T载体连接后采用蓝白斑法筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，以Kpn I和Xba I作双酶切，经电泳、测序鉴定得到目的基因。将经测序证实的Kpn I和Xba I双酶切片段连接入质粒pcDNA3.1的Kpn I/Xba I酶切位点之间，构建成pcDNA3.1-hTSHR重组质粒。经转化细菌筛选阳性克隆，扩大培养，抽提质粒DNA，再以Kpn I和Xba I作双酶切，酶切产物电泳可见2300bp左右的条带，说明目的基因已克隆入pcDNA3.1。再对质粒DNA进行测序，测定结果与基因库登录序列进行比对分析。测序结果显示，克隆入pcDNA3.1的目的片段与hTSHR基因的编码区序列完全一致，进一步证明pcDNA3.1-hTSHR真核表达载体已构建成功。将pcDNA3.1-hTSHR质粒转染CHO细胞，进行表达，用G418筛选阳性表达株，破碎细胞，用Western法对细胞表达蛋白进行鉴定，证明细胞可以表达hTSHR。
本发明所公开一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法，其优点表现在：将扩增好的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，酶切鉴定确定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，并再次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。从而完成真核表达载体的构建。通过脂质体介导，用重组质粒pcDNA3.1-hTSHR转染CHO细胞，以G418筛选稳定表达株，经Western印记法鉴定出被转染细胞成功表达hTSHR。从而得到高效稳定表达hTSHR的细胞株。为TSAb和TSBAb的测定奠定了基础，也为进一步研究人TSH受体的结构和功能打下了基础。
附图说明
图1：RT-PCR产物电泳结果(M示分子量标准；泳道1和2为RT-PCR产物)。
图2：pcDNA3.1-hTSHR重组质粒DNA的Kpn I/Xba I双酶切结果。泳道1：DNA分子量标准，泳道2：抽提的质粒DNA，泳道3：抽提的质粒DNA经Kpn I/Xba I双酶切产物，泳道4：RT-PCR产物。
图3：G418筛选后的阳性细胞株。
图4：稳定表达hTSHR基因的细胞株的Western blot结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一、材料与方法
(一)材料
1.质粒
(1)pcDNA3.1质粒(Invitrogen公司产品)
(2)pGEM-T载体(Promega公司产品)
2.菌株
(1)大肠杆菌DH5α(华舜生物工程有限公司产品)
(2)CHO细胞(中国科学院细胞所)
3.试剂盒
(1)RNA抽提试剂(Promega公司产品)
(2)逆转录试剂盒(Promega公司产品)
(3)质粒DNA抽提试剂盒(Qiagen公司产品)
(4)PCR纯化和胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)
(5)质粒小抽试剂盒(Qiagen公司产品)
(6)ECL+plusTM Western blotting system试剂盒(Amersham公司)
4.cDNA文库及引物设计软件
(1)GenBank登陆号：NM_001729。
(2)Primer 5.0软件
5.酶
(1)Pfu DNA聚合酶(Promega公司产品)
(2)T4 DNA连接酶(Promega公司产品)
(3)限制性内切酶入Kpn I和Xba I(New England Biolabs公司产品)
(4)胰蛋白酶(Gibco公司产品)
(5)RNase H
6.引物
(1)Oligo-(dT)₁₅
(2)PCR上游引物(上海生物工程公司合成)
(3)PCR下游引物(上海生物工程公司合成)
7.器材
(1)剪刀
(2)镊子
(3)匀浆管
(4)锡纸
(5)研钵
(6)Eppendorf管
(7)离心管
(8)吸管
(9)细胞培养瓶
(11)6孔板
(12)10cm盘
(13)96孔盘
(14)牛皮纸
(15)克隆环
(16)刮刀
8.试剂
(1)二乙基焦碳酸酯(diethyl pyrocarnonate，DEPC)水：吸出DEPC1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
(2)75％乙醇(DEPC水配制)
(3)10×PCR缓冲液(500mmol/L KCl；15mmol/L MgCl₂；100mmol/L Tris·HCl；pH 8.3)
(4)琼脂糖：Sigma公司产品
(5)10×连接缓冲液
(6)LB液体培养基(在100ml蒸馏水中加入胰蛋白胨1g，NaCl 1g，酵母提取物0.5g，用NaOH调节pH值7.2-7.6，高压灭菌备用。)
(7)LB固体培养基琼脂(在100ml LB液体培养基加入1.5-2g琼脂糖醋，加热溶化，高压灭菌备用。)
(8)氨苄青霉素(上海生物工程公司产品)
(9)10×T4缓冲液
(10)CaCl₂
(11)10％FBS
(12)F12培养基
(13)D-Hanks液：称取KCl 0.4g；KH₂PO₄ 0.06g；NaCl 8.0g；NaHCO₃ 0.35g；Na₂HPO₄·12H₂O 0.132g；D-葡萄糖1.0g；酚红(0.1％)1ml，加ddH₂O至1000ml，高压灭菌10分钟。
(14)OMEM
(15)Lipofectamine 2000：Invitrogen公司产品
(16)6×Lysis缓冲液
(17)TBST(TBS+0.05％Tween20)
(18)SDS-PAGE
①12％SDS-PAGE电泳分离胶：30％丙烯酰胺4ml；Tris-HCl 5ml；10％APS 100ul；10％SDS 100ul；TEMED 4μl；去离子水3.3ml混合。
②5％SDS-PAGE电泳积层胶：30％丙烯酰胺0.85ml；Tris-HCl0.625ml；10％APS 50ul；10％SDS 50ul；TEMED 5μl；去离子水混合。
③5×SDS-PAGE上样缓冲液：0.125mol/l Tris-HCl；20％甘油，4％SDS；0.2mol/L DTT；0.02％溴酚蓝。
④凝胶电泳缓冲液：Tris 3.03g；甘油14.4g；SDS1.0；加ddH₂O至1000ml)
⑤SDS-PAGE染色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10ml冰乙酸；25g考马斯亮蓝R250。
⑥SDS-PAGE脱色液：90ml甲醇∶水(1∶1，V/V)；10ml冰乙酸。
(19)内参Actin一抗
(20)辣根过氧化酶交联的驴抗兔IgG(Santa公司产品)
9.Marker
(1)DNA DL2000marker(大连Takara公司产品)
(2)蛋白质Marker(上海生物工程公司产品)
10.主要仪器
(1)倒置显微镜(Olympus公司产品)
(2)紫外分光光度仪
(3)CO₂细胞培养箱(Hereus公司产品)
(4)台式离心机(Beckman公司产品)
(5)Perkin-Elmer-Cetus 9700热循环仪
(6)低温离心机(Sigma公司产品)
(6)SDS-聚丙烯胺凝胶垂直电泳装置(Bio-Rad公司产品)
(7)电转膜仪(Bio-Rad公司产品)
(9)SmartspecTM3000分光光度计(Bio-Rad公司产品)
(10)超净工作台(上海医疗器械厂产品)
(11)FR-200紫外分析扫描装置(上海复日科技有限公司产品)
(12)微量加样器(Eppendorf公司产品)
(13)电泳仪(上海复日科技有限公司产品)
(14)TN2-C恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)
(15)超声细胞破碎仪
(16)恒温水浴箱
11.人甲状腺组织(取自外科切除的手术标本)
(二)方法
1.甲状腺组织总RNA抽提
(1)实验器具的处理与准备
①塑料制品(包括枪头、Eppendorf管、匀浆管等)：先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)
②玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC水过夜，再烤干)
③匀浆器(包括剪刀、镊子)：先洗净后，再高压(不需要泡DEPC)
(2)人甲状腺组织取自外科切除的手术标本，术中取少量甲状腺组织(约0.5g)，立即置液氮中。
(3)将组织直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，加入5ml Trizol液，转入离心管。样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％。
(4)研磨液室温放置5分钟，使其充分裂解，12,000rpm，离心5分钟，弃沉淀。然后加入1.0ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒(禁用漩涡振荡器)，混匀后室温放置15分钟。4℃，12,000rpm，离心15分钟。
(5)吸取上层水相于一新的离心管，加入2.5ml异丙醇混匀，室温放置10分钟。4℃，12,000rpm，离心10分钟。
(6)弃去上清液，加入5ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃，8000g，离心5分钟。
(7)尽量弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于DEPC子水中，必要时可55℃-60℃水溶解10分钟。
(8)紫外分光光度仪测定RNA的A₂₆₀和A₂₈₀值。
2.cDNA第一链的合成。
(1)在0.5mlEppendorf管中，加入甲状腺组织总RNA 2μg，补充适量的DEPC水使总体积达11μl。在管中加10μMOligo-(dT)₁₅引物1μl，轻轻混匀、离心。
(2)70℃加热10min，立即将Eppendorf管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCR缓冲液2μl；25mM MgCl₂ 2μl；10mM dNTP 1μl；0.1M DTT 2μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
(3)加入Superscript II 1μl，在42℃水浴中孵育50min。
(4)于70℃加热15min以终止反应。
(5)将管插入冰中，加入RNase H 1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。
3.PCR.(PCR产物电泳结果见图1)
(1)根据GenBank中hTSHR基因的cDNA序列(GenBank登陆号：NM_001729)，选用Primer 5.0软件设计上下游引物，并分别在上下游引物中嵌入限制性内切酶Kpn I和Xba I的酶切位点。
上游引物为：5′-cta agaGAG TCC CGT GGA AAA TGA-3′
(方框内为Kpn I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列)。
下游引物为：5′-ccc gcc cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3′
(方框内为Xba I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列)。
(2)以人甲状腺组织cDNA第一链为模板进行聚合酶链反应(PCR)，扩增片断长度为2337bp。于Perkin-Elmer-Cetus 9700热循环仪上进行PCR反应，反应体系为：总体积50μl，含1μl人甲状腺组织cDNA，10×PCR缓冲液5μl，10μmol/l上下游引物各1μl，2.5mmol/ldNTP 4μl，Pfu DNA聚合酶0.5μl。PCR反应采用Touch-down法，PCR条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度在起始的10个循环中为60℃～55℃，每次递减0.5℃，退火时间为45秒，72℃延伸4分钟；在以后的30个循环中，退火温度固定为55℃，退火时间为45秒，72℃延伸4分钟；最后于72℃延伸10分钟，于4℃中保存。
(3)扩增结束后，取反应液5～10μl进行琼脂糖凝胶电泳，以DL 2000Marker为对照，确认反应产物。
4.人TSH受体基因PCR产物的回收与纯化：
(1)目的DNA PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，100mV，20分钟，分离2337bp的人TSH受体全长cDNA片段。
(2)在紫外灯下用洁净锋利的刀片割胶回收人TSH受体全长cDNA片段。
(3)按凝胶块大小∶溶胶液＝1∶3(w/v)的比例加入适量的溶胶液S1，置50℃恒循环水浴加热，每2分钟颠倒即管一次混匀，至凝胶充分溶解。
(4)按凝胶块大小∶异丙醇＝1∶3(w/v)的比例加入适量异丙醇，颠倒混匀。
(5)将混合物移入吸附柱，12000rpm，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。
(6)在吸附柱中再加500pl的W1(洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。
(7)在吸附柱中再加500pl的W1(洗涤液)，静置1分钟后，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中，再离心1分钟。
(8)将吸附柱放入一个1.5ml的清洁无菌的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入30μlTE(PH8.0)，离心1分钟，收集洗脱液。
(9)使用分光光度计测定OD₂₆₀值，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。通过以上步骤得到hTSHR cDNA。
5.将hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体
(1)连接：在0.5ml反应管中加入：pGEM-T 50ng；纯化的人TSH受体基因PCR产物10-50ng；T4DNA连接酶3weiss units；10×连接缓冲液1μl。补ddH₂O至总体积为10μl，4℃过夜。
(2)转化
①将50μl感受态大肠杆菌DH5α于冰浴上解冻。
②将10μl连接产物与感受态大肠杆菌DH5α混匀，冰浴30分钟。
③42℃热休克90秒钟，立即冰浴3-5分钟。
④加入400μl预冷的LB液体培养基，37℃轻摇培养45-60分钟。
⑤将转化后的DH5α涂布于含100mg/l氨苄青霉素及X-Gal、IPTG的LB平板上，用蓝白斑法筛选阳性克隆。
(3)37℃培养16h后，挑取白色菌落，扩大培养。
6.提取质粒DNA。(按照Qiagen公司说明书)
(1)挑取单菌落，接种于3ml的LB培养液中(含100mg/l氨苄青霉素及X-Gal、IPTG)37℃，200rpm，振摇过夜。
(2)将培养好的菌液分于1.5ml的无菌Eppendorf管中，4000rpm离心5分钟，彻底弃去上清，收获细菌。
(3)在细菌沉淀中加入悬浮液P1(含RNaseA)250μl，旋涡震荡至彻底悬浮。
(4)再加入250μl碱裂解液P2，立即温和颠倒离心管5-10次，混匀，室温静置4分钟。
(5)加入350μl中和液P3，立即温和颠倒，混匀5-10次。
(6)4℃，13000rpm离心10分钟，为尽量避免蛋白质污染，将上清小心移入一新Eppendorf管，同样条件再次离心5分钟。
(7)将上清移入吸附柱，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中(瞬时离心速度10000rpm，以下各步均同)。
(8)在吸附柱中加500μl的B1(结合缓冲液)，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。
(9)在吸附柱中加500μ1的W1(洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中。
(10)在吸附柱中再加500μl的W1(洗涤液)，离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放进同一个收集管中，再离心1分钟。
(11)将吸附柱放入一个1.5ml的清洁无菌的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入50μl TE(PH8.0)，37℃水浴2分钟，离心1分钟，管底即得提取的质粒DNA溶液。
7.以Kpn I/Xba I双酶切鉴定。将酶切鉴定的质粒作DNA序列测定(上海博亚生物技术有限公司)，并将测序结果与GenBank中的hTSHR cDNA序列及氨基酸序列进行比对。
通过以上步骤得到hTSHR cDNA。
8.将hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA 3.1质粒(pcDNA 3.1-hTSHR重组质粒DNA的Kpn I/Xba I双酶切结果见图2)
(1)将测序正确的pGEM-T-hTSHR重组质粒用Kpn I和Xba I双酶切，胶回收hTSHR cDNA片段。
(2)使用限制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切pcDNA3.1质粒，胶回收载体片段。
(3)冰浴中按顺序加入ddH₂O 7μl，10×T4缓冲液2μl，载体片段0.1μg，250bp BTC cDNA片段0.4μg，T4DNA连接酶1μl(2U)，总体积20μl。弹匀Eppendorf管，短暂离心以集中样品，于4℃中连接过夜。
通过以上步骤得到重组的pcDNA3.1-hTSHR。
9.将重组的pcDNA3.1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5α
(1)用氯化钙(CaCl₂)制备新鲜感受态细菌DH5α：
①从于37℃培养16～20小时的新鲜平板上挑取1个DH5α单菌落(直径2-3mm)，转到1个含5ml LB培养基的20ml试管中，于37℃以300转/分振摇培养过夜。
②在无菌条件下转移菌液至4个无菌的、用冰预冷的1.5mlEppendorf管中，每管1ml菌液，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。
③于4℃中以4,000转/分离心10分钟，以回收细胞。
④弃上清，将管倒置1分钟以使最后残留的少量培养液流尽。
⑤用预先灭菌冰浴的0.1M CaCl₂ 1ml悬浮每份细胞沉淀，在冰上放置30分钟后，于4℃中以3,500转/分离心5分钟。
⑥弃上清，用0.1M CaCl₂ 0.6ml重悬沉淀，按200μl/管分装，于4℃放置数小时备用。
(2)质粒转化：
①取200μl新鲜制备感受态细菌DH5α，加入全量连接产物10μl，置于1.5ml Eppendorf管中，混匀，冰浴30分钟。
②于42℃热休克90秒后，立即冰浴2分钟。
③加入无抗生素的LB液态培养基800μl，于37℃摇床上温育45分钟，使细菌复苏。
④室温下以4,000转/分离心5分钟，弃部分上清，保留约200μl，吹打、悬浮沉淀细菌。
⑤取含氨苄青霉素的LB固体培养基琼脂平皿涂板(全部200μl菌液)，置37℃恒温培养箱，待菌液吸收后，倒置平皿，于37℃中培养12～16小时。转化进了质粒的细菌则能在此氨节选择培养基上长出单菌落。
(3)质粒扩增：
①选择数个单菌落克隆。
②挑取少量菌落，溶于ddH₂O中，以菌液为模板，PCR扩增hTSHR cDNA片段。
③选择扩增出BTC cDNA片段的菌落克隆，溶于含氨苄青霉素的100ml LB液体培养基中，于37℃中振摇培养过夜。
10.质粒抽提纯化：
(1)LB培养基于4℃中以5,000转/分离心15分钟。
(2)弃上清，加入QIAGEN-tip100质粒DNA纯化试剂盒中P1液4ml，吹打溶解沉淀；加P2液4ml，轻柔充分混匀，室温放置5分钟；加入预冷P3液4ml，轻柔充分混匀，于冰上放置15分钟。
(3)于4℃中以15,000转/分离心30分钟，留上清，重复离心一次。
(4)放Qiagen-tip 100柱，加QBT液10ml过柱后，将上清过柱，而后加QC液40ml过柱。
(5)加5ml洗脱液QF洗柱，存于灭菌离心管中，加异丙醇3.5ml，充分混匀，于4℃中以15,000转/分离心30分钟，弃上清；加70％乙醇2ml，充分混匀，于4℃中以15,000转/分离心10分钟。
(6)弃上清，室温下风干沉淀质粒，用TE液50μl溶解质粒。
(7)取质粒溶液2μl，加TE液98μl，分光光度计测定OD₂₆₀值，计算质粒浓度。
11.质粒鉴定：
(1)用限制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切重组质粒3小时。
(2)琼脂糖凝胶电泳酶切产物，观察电泳结果。
(3)质粒送上海博亚生物技术有限公司进行DNA序列测定。
通过以上步骤得到pcDNA 3.1-hTSHR质粒。
12.CHO细胞的培养
(1)CHO细胞的传代：CHO细胞用含10％FBS的F12培养基培养。当CHO细胞密度达80％左右时及时传代。传代时，先用D-Hanks洗二遍，加0.25％胰蛋白酶，轻轻晃动使胰蛋白酶与细胞充分浸润。倒掉多于的胰蛋白酶，继续消化2分钟，加适量含10％FBS的F12培养基吹匀，用含10％FBS的F12培养基稀释到合适的密度，重铺于培养瓶内，37℃，5ml/l CO₂放置培养。
(2)CHO细胞的冻存：当CHO细胞传代培养增殖到一定量时，需要部分冻存一般选择生长状态良好，密度80％左右的细胞冻存。冻存时，先用D-Hanks洗二遍。加0.25％胰蛋白酶，轻轻晃动使胰蛋白酶与细胞充分浸润。倒掉多于的胰蛋白酶，继续消化2分钟。加少量含10％FBS的F12培养基把贴于壁上的细胞轻轻吹下来，尽量吹匀，保持细胞密度尽量大一些，然后按细胞混合液∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1的比例放入冻存管。顺序在4℃放10分钟，-20℃放16小时，最后放-80℃长期保存。
13.pcDNA3.1-hTSHR质粒的转染
(1)准备：转染前将对数生长的CHO细胞重铺于6孔板中，待细胞长至70％覆盖率时准备转染。
(2)转染：取4ugDNA加入含250μl OMEM的Eppendorf管中，轻轻混合。取10μl Lipofectamine^TM2000加入另一含250μl OMEM的Eppendorf管中，室温孵育5分钟，然后把含DNA和Lipofectamine^TM2000的OMEM混合在一起，室温孵育20分钟。CHO细胞用D-Hanks洗一次，用F12培养基洗一次，加2ml含10％FBS的F12培养基，滴加转染液，37℃，5ml/l CO₂放置培养5小时后弃转染液，换含10％FBS的F12培养基。继续培养20小时后用0.25％胰蛋白酶消化细胞，把转染后的细胞按一定比例接种至10cm盘。通过以上步骤得到TSH受体全长cDNA的表达株。
14.G418筛选稳定表达株(G418筛选后的阳性细胞株见图3)
(1)G418浓度的确定：空白细胞接种一个12孔板或者是6孔板，按照0，200ng/μl，400ng/μl，600ng/μl，800ng/μl，1000ng/μl的G418浓度梯度进行筛选，原则上选择刚好能杀死空白细胞的最低G418浓度。经验上来说，800-1000ng/μl的G418浓度比较适合CHO细胞稳定株的筛选。在本实验中，我们发现CHO细胞转染hTSHR以后实际需要使用50-100ng/μl维持筛选浓度，否则细胞将全部死亡。推测是与hTSHR目的基因的质粒本身有关。
(2)分盘：细胞转染24小时后需要分盘。第一次分盘时可以做一个接种比例的摸索。按照1∶200，1∶500，1∶2000的比例，用确定好的G418浓度筛选，2-4天后观察，此时单克隆已基本成形，选择单克隆之间位置较远的接种比例。
15.挑取单克隆：
在单克隆的生长过程中，每两天或者三天换液。克隆生长时间一般在6天到10天为宜。CHO细胞生长速度很快，第六天的时候各个单克隆的界限还分得比较开，但是当培养时间延长后，一些克隆中的细胞会在分裂的过程中迁移到其他地方，又长出一个小克隆，所以经常会发生在一个很纯的阳性克隆里面夹杂一定比例的阴性细胞。解决的方法是在早期的时候就挑出单克隆。选择6-7天挑选一次。
(1)克隆环的准备：克隆环用氯仿在摇床上摇2小时，换用甲醇摇10-20分钟，然后顺次用自来水，ddH₂O清洗几遍，放烘箱烘干。在玻璃培养皿底面途上薄薄一层硅脂，克隆环小心地排列在硅脂上，盖上盖子，包上牛皮纸后高压灭菌，在烘干，然后放超净台照紫外过夜备用。
(2)确定单克隆的位置：在显微镜下先肉眼确定单克隆的位置，用Marker笔上下标记出单克隆的位置，把细胞放回超净工作台准备挑取单克隆。
(3)单克隆的挑取：细胞先用D-Hanks洗两遍，在标记单克隆的位置上放上克隆环，确保克隆环放准放稳。环内加100μl 0.25％胰蛋白酶，消化2分钟。加200μl含10％FBS的F12培养基，吹吸数次，把消化好的单克隆细胞放入96孔培养盘继续放大培养。
16.单克隆的培养：
如果能保证单克隆较纯，那么挑取的单克隆可以放96孔培养盘直接扩大培养。如果可能混合进临近的单克隆，即插入位点不一的几个克隆可能混合在一起，则应稀释到96孔培养盘培养，并且确保每个孔只有一个细胞。为了避免假阳性克隆，整个放大培养的过程都要加G418维持筛选压力。我们采用这样的方法目前得到阳性单克隆8个，已经传代到P5。
17.用Western法对细胞进行鉴定。(稳定表达hTSHR基因的细胞株的Western blot结果见图4)
(1)标本处理
①加入适量预冷的6×Lysis Buffer。
②用预冷的刮刀将细胞刮下，冰上裂解细胞10-15分钟。
③超声破碎仪破碎细胞：200W共4次，每次5秒，间隔2秒。
④4℃，12000g，离心15分钟。
⑤取上清，100℃煮5-10分钟。
(2)电泳和电转移
①SDS-PAGE电泳：
a)将50μl目标蛋白与12.5μl 5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸8分钟，4℃暂存。
b)在试管中配好12％分离胶，迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层异丙醇压胶。分离胶聚合完全后，倒去异丙醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。在分离胶聚合的过程中，配制5％的积层胶，迅速灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。在上下电泳槽中加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
c)在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后将样品加入梳孔中。
d)电泳：装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V，当染进入分离胶(这段时间约为20min)后，将电压提高到200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。
e)固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液中固定。
f)染色：除去固定液，加入染色液，室温染色8小时。
g)脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。
②将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)用甲醇浸湿，ddH₂O冲洗，将电泳胶、PVDF膜、滤纸放于Transferring Buffer中平衡后，置于电转移槽中，在4℃，400mA恒流条件下电转移120分钟，将蛋白样品转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。
(3)免疫学测定
①封闭：用TBST(TBS+0.05％Tween20)加5％牛奶配制成封闭液。室温封闭PVDF膜1小时或4℃过夜。
②一抗孵育：用含5％牛奶的TBST分别稀释目标蛋白或者内参Actin一抗。室温下与封闭好的PVDF膜孵育2小时或4℃过夜。
③洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟。
④二抗孵育：用含5％牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗兔/小鼠二抗。于室温下孵育2小时。
⑤洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟。TBS洗膜一次，10分钟。
(4)ECL：将Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒A液与B液40∶1按比例混合，覆盖膜表面，室温下2分钟，吸干膜上多余试剂，保鲜膜封闭后，在暗室中经不同时间多次曝光，显影、定影并洗片。