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1、(10)申请公布号 CN 103710289 A (43)申请公布日 2014.04.09 CN 103710289 A (21)申请号 201310746712.3 (22)申请日 2013.12.25 CGMCC No. 8525 2013.12.09 C12N 1/20(2006.01) C12P 5/02(2006.01) C12R 1/39(2006.01) (71)申请人 天津凯英科技发展有限公司 地址 300000 天津市南开区卫津南路 76 号 二楼 (72)发明人 张建 李玉庆 薛二军 陈剑 (74)专利代理机构 天津市三利专利商标代理有 限公司 12107 代理人 李蕊 (。
2、54) 发明名称 一种荧光假单胞菌 KY-03 与应用 (57) 摘要 本发明提供了一种荧光假单胞菌KY-03， 保藏 号为CGMCC No.8525， 所述荧光假单胞菌KY-03能 够在不影响厌氧消化反应体系稳定性的基础上， 显著提高厌氧产沼的效率及污泥有机质分解率， 与化学方法相比具有成本低、 持续时间久、 无二次 污染等优点， 培养使用方便， 可为工业废水生物处 理技术， 尤其是厌氧消化技术的进一步推广和普 及做出积极的贡献， 在污水处理领域具有广泛的 应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103710289 A CN 103710289 A 1/1 页 2 1. 一种荧光假单胞菌 KY-03， 其特征在于 ： 保藏号为 CGMCC No.8525。 2. 根据权利要求 1 所述的荧光假单胞菌 KY-03， 其特征在于 ： 分离自牛的反刍胃中， 在 筛选平板上表现为白色， 边缘整齐、 湿润粘稠， 革兰氏染色呈阴性。 通过16S rDNA和Biolog 微生物分类鉴定系统鉴定， 确定为荧光假单胞菌， 命名为荧光假单胞菌 KY-03， 16SrDNA 序 列分析。
4、结果为序列表中 1 所示序列， 即 ： 5 -AATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAGACAATCACGTA TTAGGTAACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGA TCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA-3 。 3.根据权利要求1或2所述的荧光假单胞菌KY-03， 其特征在于 ： 具有较强的复杂有机 质降解能力。 4. 权利要求 1-3 之一所述的荧光假单胞菌 K。
5、Y-03 对厌氧消化产沼反应的增效用途。 5. 根据权利要求 4 所述的荧光假单胞菌 KY-03 的应用， 其特征在于 ： 将所示菌株荧光 假单胞菌 KY-03 接种至增菌培养基中， 30振荡培养至对数增长期， 菌浓约为 106 1010个 /ml， 离心取菌液上清， 按照 DNS 还原糖比色国标法 GB/T 23881-2009 测定上清液对纤维素 等有机质的分解代谢能力， 并以 0.1 0.5% 的接种量接种于厌氧消化反应体系中， 实现该 菌株对厌氧消化反应的增效作用。 权 利 要 求 书 CN 103710289 A 2 1/3 页 3 一种荧光假单胞菌 KY-03 与应用 技术领域 0。
6、001 本发明涉及生物技术领域， 尤其是一种荧光假单胞菌 KY-03 与应用。 背景技术 0002 污泥是伴随污水处理过程产生的必然产物， 其中含有大量的有机质， 丰富的氮、 磷 营养物、 重金属以及各种病原微生物， 必须得到妥善的处理和处置。目前多采用厌氧消化 （Anaerobic Digestion） 技术处理剩余污泥， 该技术是微生物在厌氧条件下分解代谢有机 质最终产生甲烷等气体的生物过程， 由于其高效的能量回收和较低的环境影响是目前国际 上应用最为广泛的污泥处理方法， 是进行污泥减量化、 无害化、 资源化生产以及实现节能减 排目标的可靠途径， 具有设施简单、 成本较低等特点 ； 但同时。
7、还存在厌氧微生物生长条件苛 刻， 增殖速率缓慢， 以及发酵产生恶臭气体等局限性。 0003 目前普遍将厌氧消化原理定义为 “水解酸化产气” 三阶段理论， 参与反 应的废水和污泥中含有大量较难降解的有机质如纤维素等成分， 需要经过水解和酸化转化 为可被厌氧微生物利用的有效成分。这也是制约厌氧消化反应速率的重要因素， 不同研究 者也针对不同阶段分别提出了优化解决的方案。陈天虎等 （2011） 通过向厌氧消化系统中 投加 15% 游离三价铁氧化物粉体， 通过释放铁离子促进厌氧菌活性和提高甲烷产量 ； 吕凡 等 （2013） 报道了一种增效菌， 在开始反应 10 15 天后向厌氧消化反应系统中投加， 。
8、可有 效提高难降解有机质的水解 ； 袁文祥 （2011） 分别比较了还原型辅酶 （NADPH） 、 乙酰辅酶 A （Acetyl Coenzyme A） 、 对氨基苯甲酸 （Para-aminobenzonic） 等生物促进剂对厌氧消化的 增效作用， 证实 NADPH 具有显著增效作用 ； 甄广印等 （2012） 则分析了碱性镁盐添加剂对厌 氧产沼及其稳定性的影响。 0004 目前多采用投加化学药剂、 生物酶等方法， 或者在反应的中期向系统中投加菌剂， 一方面增加了高昂的污泥处理处置成本， 也使剩余污泥中的化学成分更为复杂， 同时对运 行中的厌氧消化系统会产生不必要的干扰。 发明内容 0005。
9、 本发明所要解决的技术问题在于提供一种荧光假单胞菌 KY-03， 可在厌氧条件下 显著提高厌氧消化反应体系中复杂有机质的降解。 0006 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述荧光假单胞菌 KY-03 的应用。 0007 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案是 ： 0008 一 种 荧 光 假 单 胞 菌 (Pseudomonas fluorescens)KY-03， 其 保 藏 号 为 CGMCC No.8525（保藏单位 : 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳 区北辰西路 1 号院 3 号、 保藏日期 ： 2013 年 12 月 9 日、 保藏编号 ： 。
10、CGMCC No.8525） 。 0009 优选的， 上述荧光假单胞菌 KY-03， 分离自牛的反刍胃中， 在筛选平板上表现为白 色， 边缘整齐、 湿润粘稠， 革兰氏染色呈阴性。通过 16S rDNA 和 Biolog 微生物分类鉴定系 统鉴定， 确定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)， 命名为荧光假单胞菌KY-03， 其 说 明 书 CN 103710289 A 3 2/3 页 4 系统进化树如图 1 所示， 16S rDNA 序列分析结果为序列表中 1 所示序列， 即 ： 0010 5 -AATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGC。
11、TTATTCTGTCGGTAACGTCAAGACAATCAC GTATTAGGTAACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCT GGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA-3 。 0011 优选的， 上述荧光假单胞菌 KY-03， 所述核苷酸序列属于细菌 16S rDNA 序列的 V3 可变区。 0012 优选的， 上述荧光假单胞菌 KY-03， 具有较强的复杂有机质降解能力。 0013 上述荧光假单胞菌 KY-03， 对厌氧消化产沼反应的增效用途。
12、。 0014 优选的， 上述荧光假单胞菌KY-03的应用， 将所示菌株荧光假单胞菌KY-03接种至 增菌培养基中， 30振荡培养至对数增长期， 菌浓约为 106 1010个 /ml， 离心取菌液上清， 按照DNS还原糖比色国标法GB/T 23881-2009测定上清液对纤维素等有机质的分解代谢能 力， 并以 0.1 0.5% 的接种量接种于厌氧消化反应体系中， 实现该菌株对厌氧消化反应的 增效作用。 0015 本发明的有益效果是 ： 0016 本发明提供了荧光假单胞菌 KY-03（保藏号为 CGMCC No.8525） ， 能够在不影响厌 氧消化反应体系稳定性的基础上， 显著提高厌氧产沼的效率。
13、及污泥有机质分解率， 与化学 方法相比具有成本低、 持续时间久、 无二次污染等优点， 培养使用方便， 可为工业废水生物 处理技术， 尤其是厌氧消化技术的进一步推广和普及做出积极的贡献， 在污水处理领域具 有广泛的应用前景。 附图说明 0017 图 1 为 ： 本发明所述荧光假单胞菌 KY-03 的系统进化树 ； 0018 图 2 为 ： 本发明所述荧光假单胞菌 KY-03 对市政污泥产气增效结果图， 其中， 上面 曲线为市政污泥 + 菌， 下面曲线为市政污泥 ； 0019 图 3（A） 为 ： 市政污泥每日产气量统计图 ； 0020 图 3（B） 为 ： 市政污泥加入本发明所述荧光假单胞菌 K。
14、Y-03 的每日产气量统计图。 0021 保藏信息 0022 分类名词 ： 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 0023 保藏单位名称 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0024 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 0025 保藏日期 ： 2013 年 12 月 9 日 0026 保藏号 ： CGMCC No.8525 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。 0028 下述实施例中不同的培养基及溶液配方如下 ： 0029 1. 筛选培养基 ： 纤维素 15 30g， 磷酸二氢钾 2g， 硫。
15、酸铵 1 2g， 硫酸镁 0.2 1g， 氯化钙 0.2 1g， 硫酸亚铁 3 6mg， 硫酸锰 1 2mg， 氯化锌 1.0 1.7mg， 氯化钴 1 2mg， 蒸馏水 1000mL， pH7.0。 说 明 书 CN 103710289 A 4 3/3 页 5 0030 2. 增菌培养基 ： 蒸馏水 1000mL， 蛋白胨 5.0 10g， 牛肉膏 2 5g， NaCl5 15g， pH7.2。 0031 实施例 1 0032 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)KY-03 的筛选和鉴定。 0033 实验材料来自天津市某屠宰场采集到的牛的瘤胃及反刍胃内容物样品。 。
16、0034 取样品稀释液 0.1ml， 涂布于筛选培养基平板上， 在 30恒温箱中培养， 挑取单菌 落接种至筛选培养基， 强化培养 48h 以上， 重复划线纯化 2-3 次， 得到纯化菌株 ； 经过 16S rDNA 和 Biolog 微生物分类鉴定系统鉴定， 确定为荧光假单胞菌， 系统进化树如图 1 所示。 0035 实施例 2 0036 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)KY-03 对纤维素等大分子有机质的降 解试验。 0037 处理对象为筛选培养基， 运行方式为摇瓶振荡培养。具体实施步骤如下 ： 实施例 1 所述荧光假单胞菌 KY-03 接种至增菌培养基， 3。
17、0振荡培养至对数增长期 （菌浓约为 106 1010个 /ml） ， 以 1 5% 接种量接种于液体筛选培养基中， 30振荡培养 1 天， 维持溶氧为 1.0 3.0ppm ； 离心取上清作为粗酶液， 按照 DNS 比色法 （GB/T 23881-2009） 测定该菌株降 解纤维素等大分子复杂有机质产生还原糖的量。结果显示， 每 mL 该菌株粗酶液可产生还原 糖 12 16mg/h。 0038 实施例 3 0039 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)KY-03 对市政污泥厌氧消化的增效实 验。 0040 处理对象为厌氧市政污泥， 采用 400mL 模拟厌氧反应体系。
18、运行。具体实施步骤如 下 ： 实施例 1 所述荧光假单胞菌 KY-03 接种至增菌培养基， 30振荡培养至对数增长期 （菌 浓约为1061010个/ml） 以0.10.5%接种量接种于模拟厌氧反应系统中， 中温 （352） 厌氧条件下运行。对反应体系的产气效率进行监测， 并与未接种组进行对比分析， 结果显 示， 在 25 47h 处该菌对反应体系产气增效可达 27 28%， 整个反应期 （约 480h） 总体可提 高产气量 13.8%， 至反应结束后， 如图 2、 图 3（A） 、 图 3（B） 所示， 按城市污水处理厂污泥检 验方法 （CJ/T221-2005） 测得有机质降解率较未接种的处。
19、理组提高了 2.3% ； 在此基础上， 每 日产气量统计结果显示， 接种该菌后同处理组内产气量标准偏差显著降低， 表明产气稳定 性得到了提高。 0041 上述参照实施例对该一种荧光假单胞菌 KY-03 与应用进行的详细描述， 是说明性 的而不是限定性的， 可按照所限定范围列举出若干个实施例， 因此在不脱离本发明总体构 思下的变化和修改， 应属本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103710289 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 103710289 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103710289 A 7 2/2 页 8 图 3（A） 图 3（B） 说 明 书 附 图 CN 103710289 A 8 。