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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510951727.2 (22)申请日 2015.12.16 C12N 5/0793(2010.01) (71)申请人 北京大学深圳研究院 地址 518000 广东省深圳市南山区高新区南 区七路深港产学研基地大楼西座 W803 (72)发明人 盛立远 赖琛 甄珍 都贝宁 魏利娜 王巧莉 高志 奚廷斐 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 唐致明 (54) 发明名称 一种鸡胚前脑神经元的培养方法 (57) 摘要 本发明涉及神经元培养， 具体是一种鸡胚前 脑神经元的培养方法， 所述培养方法包括 ： 。
2、鸡胚 前脑神经组织的获取， 用聚乙烯亚胺包被培养装 置， 用含小牛血清的 Neurobasal 培养基培养鸡胚 前脑神经元。本发明的方案可以使鸡胚前脑神经 元在高密度条件下长时间培养 ； 免疫染色结果证 明有神经元和胶质细胞共存， 并且在第 7 天已经 有突触的形成 ； 随着胶质细胞的增殖， 在 MEA 上的 神经网络最后长成非常致密的细胞层， 可存活长 达 6 个月 ； CFBN 神经网络对神经活性物质有很好 的反应性， 可以用作神经毒性检测平台。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 10540073。
3、9 A 2016.03.16 CN 105400739 A 1/1 页 2 1.一种鸡胚前脑神经元的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法包括 ： 用含小牛血清 的 Neurobasal 培养基培养鸡胚前脑神经元。 2.根据权利要求 1 所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法还包括 ： 用聚乙烯亚胺 包被培养装置。 3.根据权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述聚乙烯亚胺包被培养装置具体 为 ： 在细胞培养皿、 24 孔板或者微电极阵列中加入 0.05wt% 聚乙烯亚胺溶液， 放入培养箱过 夜， 第二天用去离子水洗涤， 干燥后待用。 4.根据权利要求 1 所述的培养方法， 其。
4、特征在于， 所述小牛血清的添加量占培养基 2wt%。 5.根据权利要求 1 所述的培养方法， 其特征在于， 所述鸡胚前脑神经元按照以下步骤 获得 ： S11、 取第 79 天的受精鸡蛋， 消毒， 用镊子将鸡蛋头部敲碎， 去壳， 拨开壳膜， 取出鸡胚 放到装有 HBSS 的培养皿 ； S12、 用镊子将鸡胚的头截断， 放入另一个有 HBSS 的培养皿 ； S13、 加鸡胚的头部背面朝上置， 压住中脑部位， 并把前脑的脑膜揭开， 取出两团白色的 组织， 放于有 HBSS 的培养皿， 将贴附在白色组织外面残余的脑膜去掉， 得到前脑组织 ； S14、 将前脑组织放入离心管， 加入冰疗的 HBSS 溶液。
5、 ； S15、 吸出 HBSS 溶液， 加入温热的胰酶 EDTA 溶液消化 ； S16、 加入 M199 培养基终止消化， 反复吹打， 形成均匀的细胞悬液 ； S17、 离心取上清， 加入 M199 培养基， 吹打均匀。 6.根据权利要求 1 所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法具体为 ： 将鸡胚前脑神 经元的细胞悬浮液加入培养装置， 均匀分散， 然后放入培养箱培养， 之后将细胞液全部换成 含小牛血清的 Neurobasal 培养基， 以后每 13 天换一半的培养基。 7.根据权利要求 6 所述的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法具体为 ： S21、 将鸡胚前脑神经元悬浮液的细胞密。
6、度调节为 3*106/mL， 滴 20L 悬浮液于微电极 阵列中央电极处， 最终密度为 15002000 个 /mm2； S22、 将微电极阵列放入 100mm 的培养皿， 然后放入 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱培 养 ； S23、 待细胞完全贴壁后加入 1mL M199 培养基， 放入培养箱继续培养 ； S24、 24h 后将细胞液全部换成含小牛血清的 Neurobasal 培养基， 之后每 3 天换一半的 培养基。 8.根据权利要求7所述的培养方法， 其特征在于， 步骤S21后在微电极阵列套上带有聚 全氟乙丙烯膜的密封环。 权 利 要 求 书 CN 105400739 A 2。
7、 1/6 页 3 一种鸡胚前脑神经元的培养方法 技术领域 0001 本发明涉及神经元培养， 具体是一种鸡胚前脑神经元的培养方法。 背景技术 0002 鸡胚前脑神经元 （CFBN） ， 类似于哺乳类大脑皮层神经元， 来源广泛， 操作简单， 成 本低廉， 常用作体外神经细胞毒性检测的模型之一。早在 1993 年， Weiss 等人就用 CFBN 模 型做过多中心体外细胞毒性检测评价 （MEIC） ， 发现和啮齿类动物 （鼠科） 的体外实验数据高 度相关， 并且和啮齿类动物的体内实验数据也具有可比性。但是相比于啮齿动物的大脑皮 层细胞培养， 目前对专门对 CFBN 细胞培养的报道很少。Heidema。
8、nn 等的研究方法主要针对 低密度、 短时间的细胞培养。但是低密度的神经网络很难用微电极阵列 （MEA） 检测出电生 理信号。根据啮齿类皮层细胞体外神经网络的发育过程， 电生理信号需要在 34 周才能保 持稳定， 才能用作电生理神经毒性的检测。因此， 需要探索一种 CFBN 长期培养的方法。 0003 虽然鸟类的脑部三维结构比哺乳类的简单， 但是当他们被提取出来并且在体外进 行二维平面培养， 神经元的基本功能如轴突和树突的分化， 突触的行成， 电信号的传递， 突 触的可塑性等都被保持了， 并且在这个水平下， 鸟类和哺乳类享有共同的电信号传递通道 和受体， 因此， 假设在体外培养的鸡胚神经网络和。
9、哺乳类 （啮齿动物） 也应该具有相似的性 质。1981 年， Louis 等在电镜下观察到了体外培养的 CFBN 的突触结构。1993 年， Tokioka 等用膜片钳检测出体外培养 CFBN 中的突触后电流， 表明形成了的功能性神经网络。并且用 N- 甲基 -D- 天门冬氨酸 （NMDA） 受体的拮抗剂 CNQX 检测出兴奋性突触后电流， 用 - 氨基 丁酸 （GABA） 受体的拮抗剂检测到抑制性突触后电流。另外， 多巴胺能， 胆碱能的受体也都 在体外 CFBN 中检测到。但是， 目前基于 MEA 技术研究 CFBN 的神经网络的电生理还未见报 道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一。
10、种鸡胚前脑神经元高密度长时间培养的方法。 0005 为达到上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 一种鸡胚前脑神经元的培养方法， 所述培养方法包括 ： 用含小牛血清的 Neurobasal 培 养基培养鸡胚前脑神经元。 0006 进一步地， 所述培养方法还包括 ： 用聚乙烯亚胺包被培养装置。 0007 进一步地， 所述聚乙烯亚胺包被培养装置具体为 ： 在细胞培养皿、 24 孔板或者微 电极阵列中加入 0.05wt% 聚乙烯亚胺溶液， 放入培养箱过夜， 第二天用去离子水洗涤， 干燥 后待用。 0008 0.05wt% 聚乙烯亚胺溶液是聚乙烯亚胺的水溶液。 0009 进一步地， 所述小牛血清的添加。
11、量占培养基 2wt%。 0010 进一步地， 所述鸡胚前脑神经元按照以下步骤获得 ： S11、 取第 79 天的受精鸡蛋， 消毒， 用镊子将鸡蛋头部敲碎， 去壳， 拨开壳膜， 取出鸡胚 说 明 书 CN 105400739 A 3 2/6 页 4 放到装有 HBSS 的培养皿 ； S12、 用镊子将鸡胚的头截断， 放入另一个有 HBSS 的培养皿 ； S13、 加鸡胚的头部背面朝上置， 压住中脑部位， 并把前脑的脑膜揭开， 取出两团白色的 组织， 放于有 HBSS 的培养皿， 将贴附在白色组织外面残余的脑膜去掉， 得到前脑组织 ； S14、 将前脑组织放入离心管， 加入冰疗的 HBSS 溶液 。
12、； S15、 吸出 HBSS 溶液， 加入温热的胰酶 EDTA 溶液消化 ； S16、 加入 M199 培养基终止消化， 反复吹打， 形成均匀的细胞悬液 ； S17、 离心取上清， 加入 M199 培养基， 吹打均匀。 0011 进一步地， 所述培养方法具体为 ： 将鸡胚前脑神经元的细胞悬浮液加入培养装置， 均匀分散， 然后放入培养箱培养， 之后将细胞液全部换成含小牛血清的 Neurobasal 培养 基， 以后每 13 天换一半的培养基。 0012 进一步地， 所述培养方法具体为 ： S21、 将鸡胚前脑神经元悬浮液的细胞密度调节为 3*106/mL， 滴 20L 悬浮液于微电极 阵列中央电。
13、极处， 最终密度为 15002000 个 /mm2； S22、 将微电极阵列放入 100mm 的培养皿， 然后放入 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养箱培 养 ； S23、 待细胞完全贴壁后加入 1mL M199 培养基， 放入培养箱继续培养 ； S24、 24h 后将细胞液全部换成含小牛血清的 Neurobasal 培养基， 之后每 3 天换一半的 培养基。 0013 进一步地， 步骤 S21 后在微电极阵列套上带有聚全氟乙丙烯膜的密封环。 0014 本发明具有以下有益效果 ： 1 细胞需要产生足够的细胞外基质才能使他们贴附在培养皿表面， 由于神经元产生细 胞外基质的能力比较弱， 因此。
14、需要在培养表面包被一层胞外基质促进贴附。常用的有天然 的胞外基质如胶原蛋白、 层粘连蛋白、 纤连蛋白等， 但是一些带正电的多聚化合物如多聚赖 氨酸 （PLL） 、 多聚鸟氨酸等， 因为价格操作方便， 应用范围更大。在传统的方案中， 使用 PLL 作为表面包被材料， 但是高密度下培养 CFBN 很容易结团， 尤其是在玻璃表面上。发明人经 过研究发现， 聚乙烯亚胺 （PEI） 却能让细胞贴附并且铺展得很好， 这可能跟这两种聚合物表 面的正电荷分布有关， PEI 对于贴附性不强的细胞系能更明显的促进贴附和轴突生长 ； 而 且 PEI 被广泛用于细胞病毒转染， 对细胞的毒性较 PLL 小。对于 CFB。
15、N 高密度长时间培养， 相比于 PLL， PEI 能避免细胞结团更适合培养表面包被。 0015 2在传统方案中， 使用 M199 培养基培养 CFBN 生长。然而， M199 不能使细胞长 时间培养， 并且在后期出现了轴突珠， 这是神经轴突退化的表现。发明人经过研究， 选用 了专门为胚胎神经元设计的 Neurobasal 培养基， 调整了渗透压和一些氨基酸的比例。在 Neurobasal 中培养的神经元轴突更加丰富， 细胞存活时间更长， 并且和啮齿类原代皮层神 经元在形貌没有区别。 0016 3在 Neurobasal 培养基中， B27 添加剂是用于替代血清， 发明人经过研究， 再添 加 2。
16、% 的小牛血清， 发现血清能导致细胞有轻微的结团， 但是这样的结团使神经轴突更加粗 壮有力。并且 MEA 检测电信号时发现， 在添加血清之后神经网络的电信号发育得更快， 并且 信号强度更好。 说 明 书 CN 105400739 A 4 3/6 页 5 0017 4在微电极阵列套上一层聚全氟乙丙烯 （FEP） 膜， FEP 膜可以让 CO2透过， 而不让 水分子透过， 能很好的保持培养液的渗透压， 再加上胶质细胞的支持作用， 鸡胚前脑神经元 可以存活长达 6 个月。 0018 综上所述， 本发明的方案可以使鸡胚前脑神经元在高密度条件下长时间培养 ； 免 疫染色结果证明有神经元和胶质细胞共存， 。
17、并且在第 7 天已经有突触的形成 ； 随着胶质细 胞的增殖， 在 MEA 上的神经网络最后长成非常致密的细胞层， 可存活长达 6 个月 ； CFBN 神经 网络对神经活性物质有很好的反应性， 可以用作神经毒性检测平台。 附图说明 0019 图 1 是实施例 2 体外培养的鸡胚神经网络形貌变化过程 ； 图 2 是实施例 3 鸡胚前脑细胞免疫染色结果 ； 图 3 是实施例 4 不同的培养表面包被条件对细胞生长的影响 ； 图 4 是实施例 5 不同的培养基对细胞生长的影响 ； 图 5 是实施例 6 血清对细胞生长的影响。 具体实施方式 0020 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明 ： 实施例 。
18、1 鸡胚前脑神经组织解剖 （1） 取第 7 天到第 9 天的白色来航鸡受精鸡蛋， 喷 70% 酒精消毒， 将所有解剖用具放入 解剖超净台 ； （2） 用钝的中号镊子将鸡蛋头部 （大头） 敲碎， 并且小心地去掉蛋壳， 拨开壳膜， 取出鸡 胚放到装有冰凉的 HBSS（Gibco） 的 35mm 培养皿里 ； （3） 用 5 号镊子将鸡胚的头截断， 放入另一个新的有 HBSS 的 35mm 培养皿里 ； （4） 将鸡胚的头部背面朝上置， 左手用 5 号镊子压住中脑部位， 右手用 5 号镊子把前脑 的脑膜揭开， 然后把两团白色的组织夹出 ； （5） 把两团白色的组织再转移到一个新的有HBSS的35mm。
19、培养皿里， 将贴附在白色组织 外面残余的脑膜去掉， 这两团月牙状的白色组织即前脑组织 ； （6） 将前脑组织放入 1.5mL 的离心管里， 加入 1mL 冰凉的 HBSS 并转移至细胞培养超净 台 ； （7） 吸出 HBSS 溶液， 加入温热的 1mL0.25% 胰酶 EDTA 溶液 （Sigma） ， 放入 37培养箱中 消化 3min ； （8） 加入 1mL10% 小牛血清 （FBS， Gibco） 的 M199 培养液 （Sigma） 终止消化， 用 1mL 枪头 反复吹打组织约 10 次， 形成均匀的细胞悬液 ； （9） 1000rpm 离心 5min ； （10） 吸出上清液， 加。
20、入 M199 培养液， 含 2%B27（Gibco） ， 1% 双抗 （Gibco） ， 吹打均匀。 0021 实施例 2 微电极整列培养鸡胚前脑神经元 （1） 微电极阵列 （60MEA200/30iR-Ti， Multichannel System， Germany） 表面处理 ： 说 明 书 CN 105400739 A 5 4/6 页 6 清洗 ： 如果是已经培养过细胞的 MEA 重复利用， 先用蒸馏水泡 10min， 使细胞溶胀破裂， 然后再用蒸馏水将表面的细胞冲掉。加入 0.5mL 胰酶溶液， 在 37放置 30min， 洗掉多余的 细胞碎片。再加入带酶的中性洗衣粉水， 在室温下浸泡。
21、过夜， 然后用蒸馏水冲洗干净。若还 有非常顽固的碎片， 则超声3min， 再用蒸馏水冲洗干净。 最后用去离子水润洗表面两次放至 表面干燥。 0022 灭菌 ： 紫外灭菌 30min。 0023 等离子处理 ： 放入等离子表面处理仪 （PDC-32G, Harrick） ， 待抽真空至 200mTORR 以下， 通入少量氧气， 以低功率档处理 23min。 0024 包被 ： 在等离子处理之后 10min 之内， 加入 700L0.05wt%PEI 溶液， 放入 37培 养箱过夜。第二天用去离子水清洗三次， 表面干燥待用。 0025 （2） 种细胞 ： 将鸡胚前脑神经元悬浮液的细胞密度调节为 3。
22、*106/mL， 滴 20L 悬浮 液于微电极阵列中央电极处， 最终密度为 15002000 个 /mm2。套上带有聚全氟乙丙烯膜的 密封环。将整个微电极阵列放入 100mm 的培养皿里， 然后放入 37、 5%CO2、 95% 湿度的培养 箱培养， 待细胞完全贴壁之后 （约 20min） ， 加入 1mL M199 培养基， 放入培养箱继续培养。 0026 （3） 细胞培养 ： 种细胞 24h 之后， 将细胞液全部换成 Neurobasal 培养液 （含 2% 小 牛血清， 2%B27， 1%GluMax， 0.5%AA） 。以后每 3 天换一半的液体。 0027 图 1 是 CFBN 神经。
23、网络在体外发育的形貌变化过程， 图 1-A 是第 1 天， 图 1-B 是第 7 天， 图 1-C 是第 14 天， 图 1-D 是第 21 天， 图 1-E 是第 28 天。第 1 天， 细胞贴壁并开始长出 突起， 随后逐渐形成非常丰富的神经网络。由于培养基中加入了 2% 的血清， 因此刚开始有 部分的结团现象。 在一周之后， 胶质细胞开始迅速增殖， 逐渐形成了非常致密的平整的多细 胞层。鸡胚神经网络可以存活长达六个月。 0028 实施例 3 为了确认培养体系里边的细胞类型， 用免疫染色来标记神经元和胶质细胞的特异性蛋 白。其中 MAP2， 微管相关蛋白 2， 是神经元特异性的骨架蛋白， 主。
24、要分布在胞体和树突上。 GFAP， 胶质细胞原纤维酸性蛋白， 是胶质细胞的标志性结构蛋白。 Synapsin I是突触相关的 蛋白。 0029 （1）固定 ： 用 PBS 清洗细胞表面碎片， 加入 4% 多聚甲醛 （含 4% 蔗糖）室温固定 15min。 0030 （2） 破膜 ： 吸出多余多聚甲醛， 并用 PBS 清洗一次。加入 1%Triton100 破膜 10min。 0031 （3） 封闭 ： 吸出 Triton100 破膜液， 并用 PBS 清洗一次。加入 1% 白蛋白 （BSA） 封闭 非特异性基团。 0032 （4） 一抗 ： 吸出封闭液。根据表 1 列的加入用于双染的一抗组合，。
25、 放在 4冰箱作 用整晚。 0033 （5） 二抗 ： 吸出一抗溶液， 用 PBS 清洗三次。根据表 1 加入相应的二抗组合溶液作 用 2h。 0034 （6） 封片 ： 吸出二抗溶液， 用 PBS 清洗三次。在载玻片上滴入 50L 含 DAPI 的长 期封闭液， 将有细胞的玻片小心倒扣在载玻片上， 尽量不留气泡。等 DAPI 封闭液晾干之后， 在玻片周围涂上指甲油。 0035 （7） 观察 ： 用Zeiss荧光显微镜在40倍油镜下观察染色情况并用多通道荧光拍照。 说 明 书 CN 105400739 A 6 5/6 页 7 0036 免疫染色结果如图 2 所示， 图 2-A、 图 2-B 显。
26、示的是 MAP2， 图 2-C 显示的是 GFAP， 图 2-D 显示的是 Synapsin I， 图 2-E 显示的是 MAP2 与 GFAP 混合， 图 2-F 显示的是 MAP2 与 Synapsin I混合。 从图2-A、 图2-C、 图2-E可以看出培养体系里神经元和胶质细胞共存。 突 触是神经元电信号传递的结构基础， 当突触执行功能时， 将会有很多功能相关的蛋白表达， 如 Synapsin I， 突触蛋白 I， 主要分布在突触前膜。并且， 随着神经网络的发育越来越成熟， 形成的突触结构越多， 突触相关蛋白表达越多。从图 2-B、 图 2-D、 图 2-F 可以看出， 在第七 天时，。
27、 培养体系里已经有突触蛋白表达， 表明形成了功能性的突触结构。 0037 实施例 4 表面包被多聚物的比较 按照实施例2的方法培养鸡胚前脑神经元， 包被物分别是PLL和PEI。 细胞生长状态如 图 3 所示， 图 3-A 是用 PLL 包被第一天， 图 3-B 是用 PEI 包被第一天， 图 3-C 是用 PLL 包被 第二天， 图 3-D 是用 PEI 包被第二天， 图 3-E 是用 PLL 包被第四天， 图 3-F 是用 PEI 包被第 四天。在 PLL 上的细胞明显结团， 突起不丰富， 到第 4 天的时候团块越来越大并开始脱落。 而在 PEI 上的细胞贴附紧密， 分散均匀， 突起丰富。因。
28、此， 在较高密度下用 PEI 包被的表面 比 PLL 表面更适合 CFBN 细胞生长。 0038 实施例 5 培养基的比较 按照实施例 2 的方法培养鸡胚前脑神经元， 培养基分别是 M199 培养基 （含 10% 小牛血 清， 2%B27） 和 Neurobasal 培养基 （含 2%B27） 。细胞生长状态如图 4 所示， 图 4-A 是 M199 培 养基第 2 天， 图 4-B 是 Neurobasal 培养基第 2 天， 图 4-C 是 M199 培养基第 4 天， 图 4-D 是 Neurobasal 培养基第 4 天， 图 4-E 是 M199 培养基第 8 天， 图 4-F 是 。
29、Neurobasal 培养基第 8 天。在 M199 培养基的细胞虽然也正常发育， 并且长出了较为丰富的神经网络， 但到第四 天时细胞的密度明显减少。尤其是到了第八天时， 轴突已经出现明显断裂， 细胞开始凋亡。 而在 Neurobasal 培养液中的细胞铺展很好， 到了第八天仍然有丰富的神经网络。因此， Neurobasal 培养基相对 M199 培养基更适合 CFBN 细胞生长。 0039 实施例 6 加血清的影响 说 明 书 CN 105400739 A 7 6/6 页 8 按照实施例2的方法培养鸡胚前脑神经元。 虽然Neurobasal是专门设计的无血清培养 基， 但是发明人的研究表明小。
30、牛血清里的部分生长因子对细胞的发育有明显的促进作用， 尤其是对神经元的突触行成。相比于通常使用的 10% 的血清比例， 考虑到已有 B27 的补充 作用， 本实施例设计了 2% 血清和无血清做对照。细胞生长状态如图 5 所示， 图 5-A 是无血 清培养基第 2 天， 图 5-B 是 2% 血清培养基第 2 天， 图 5-C 是无血清培养基第 4 天， 图 5-D 是 2% 血清培养基第 4 天， 图 5-E 是无血清培养基第 6 天， 图 5-F 是 2% 血清培养基第 6 天。添 加了 2% 血清的培养的细胞明显的结团， 但是团与团之间的突起更加粗壮， 连接很有力， 并 且细胞未出现脱落情。
31、况。相比之下， 无血清培养的细胞分散均匀， 突起均呈细丝状。由此可 见， 血清确实对细胞的生长状态和生态分布有明显的作用。 0040 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到的变化或替换， 都应 涵盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。 说 明 书 CN 105400739 A 8 1/5 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 105400739 A 9 2/5 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 105400739 A 10 3/5 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 105400739 A 11 4/5 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 105400739 A 12 5/5 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 105400739 A 13 。