一种富锌酵母及其生产方法.pdf

本发明提供了一种富锌酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)Z1.4CCTCC M 205126。该菌株耐锌性能稳定，生长速率快，对锌的利用率高，含锌高可以达到80000mg/kg，其中生物锌含量可达90％。

1、  一种富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z1.4 CCTCC M205126。

2、  权利要求1所述富锌酵母的生产方法，其包括：菌种活化、扩大培养和发酵培养。

3、  如权利要求2所述的方法，其还包括在发酵培养后对培养物进行分离、干燥和包装。

4、  如权利要求2或3所述的方法，其中菌种活化的方法是：将所述富锌酵母菌种接种到含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁固体斜面上，在26～35℃培养24～48小时。

5、  如权利要求2或3所述的方法，其中扩大培养包括：
一级液体种子培养：将活化的菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在26～35℃培养24～48小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的卡氏培养瓶中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m³的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。

6、  如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵罐发酵培养的方法是：发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为5％～15％，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

7、  如权利要求5所述的方法，其还包括在二级发酵罐种子发酵培养，培养方法是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为1％～10％，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

8、  如权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵罐发酵培养的方法是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为5％～15％，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。

9、  如权利要求3所述的方法，其中分离采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。

10、  如权利要求3所述的方法，其中，干燥
a)采用60～140℃流化态干燥；或
b)采用100～180℃喷雾干燥；或
c)用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥；或
d)采用冷冻干燥法干燥。

一种富锌酵母及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种微生物，具体地说涉及一种富锌酵母，本发明还涉及该菌种的选育方法以及使用这种菌种进行工业生产的方法。
背景技术
锌是人体和动物的必需微量元素，在生物体内，锌既是许多酶的组成成分，又可以影响某些非酶的有机分子配位体的机构构型，对维持人体正常的生理机能起着非常重要的作用。人体缺锌会引起许多疾病，如侏儒症、糖尿病、高血压、生殖器及第二性征发育不全，男性不育等疾病。人体正常的生理代谢会损失一部分锌，而食物中补充的锌又不足以满足人体的正常代谢的锌，因而导致人们普遍缺锌。富锌酵母作为一种良好的补锌原料，其生物利用率高，毒副作用小，而且酵母中含有丰富的氨基酸和维生素，这些都能促进锌的吸收。
近年来国内外对富锌酵母研究比较多，但含量都不是很高，主要的问题是：(1)对富锌酵母的菌种筛选不够，筛选出来的菌种对锌的富集能力不强，酵母中的锌含量不高(2)有机锌含量低，有部分只是酵母和锌简单的吸附或混合，未将无机锌转化为有机锌；(3)一些方法不适合大生产，重复性很差，有些能生产，但是产率很低，生产成本较高；(4)对锌的利用率低。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种锌含量较高的富锌酵母菌种以及利用该菌种进行工业生产的方法。
由于无机锌对酵母的生长有一定的抑制，一般的酵母很难在含有高锌的条件下生长，即使有生长速率但对锌的利用率不高。本发明通过筛选、驯化、诱变，选育出锌含量高、生长速率快、产率高、对锌的利用率高的富锌酵母菌种，将其中优选的一株命名为Z1.4。该酵母菌株已经于2005年10月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学，邮编430072)进行了生物保藏，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)，保藏编号为CCTCC M205126。
具体地说，通过如下方法选育菌种：
1)筛选耐高锌的酵母菌种：将不同的酵母菌种接种到不同浓度的含锌培养基中，筛选能够在高锌培养基中能够生长的菌种。挑选出耐锌的菌种作为驯化的菌种。
2)将耐锌的菌种接种到高浓度锌的培养基上进行培养，并逐渐提高培养基中锌的浓度，维持锌在较高的浓度。挑选出耐高锌而又稳定的菌种作为诱变菌种。
3)将挑选出来的菌种接种到不同浓度的氯化锂的培养基中诱变。
4)将诱变的菌种再进行分离筛选，利用摇瓶和小型发酵罐进行发酵选出锌含量高、生长速率快、产率高、对锌的利用率高的耐高锌的酵母菌种，即为富锌酵母菌种。
5)筛选培养基配方
麦芽汁培养基含糖量5～25％，含锌(氨基酸螯合锌)浓度为150～5000μg/ml，pH值为4～6.5。
6)筛选培养条件
温度26～35℃，搅拌培养18～48小时。
另一个方面，本发明提供了生产上述富锌酵母产品的方法，包括菌种活化、扩大培养、发酵罐培养，发酵罐培养结束后对培养物进行分离、干燥、包装后即得成品。
其中，菌种活化可采用本领域技术人员熟知的常规方法进行，如采用斜面菌种培养活化。
其中，扩大培养可包括一级液体种子培养、二级液体种子培养以及发酵罐种子培养。
其生产流程如下：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。
具体地说可采用如下方法：
1)斜面菌种培养：将耐高锌的富锌酵母菌种接种到含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁固体斜面上，在26～35℃培养24～48小时。
2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的麦芽汁专用培养瓶中，在26～35℃培养24～48小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、pH值为4～6.5的卡氏培养瓶中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m³的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，接种量为1％～10％，在26～35℃培养18～48小时。
5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌)浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，接种量为5％～15％，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。
6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷雾干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。
8)包装：可以采用多种形式的包装成为高锌含量的富锌酵母。锌含量达到2000～80000mg/kg。
在发酵罐种子培养和发酵罐发酵培养中需要添加适量的氮源和磷源，氮源选自硫酸氨、碳酸氢铵、氨水、磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨，或是这些物质的组合。磷源为选自磷酸、磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨，或是这些物质的组合。优选为磷酸氨、磷酸氢氨和磷酸氢二氨。优选氮源和磷源的使用量均为培养基重量的1～10％。锌源选自硫酸锌、氯化锌、硝酸锌、葡萄糖酸锌、氨基酸锌等，优选氨基酸螯合锌，使用量为培养基重量的1～10％，从发酵开始至发酵14小时流加完
如果是连续的生产可以增加一级发酵罐二级种子发酵，发酵条件是：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的二级种子发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。然后进行离心机或板框进行分离，在4～10℃储罐或冷库中保存，然后根据需要接种到发酵罐中再进行下一级培养。此时发酵罐发酵的条件优选为：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖量为5～25％、铁浓度为150～5000μg/ml、补充适当的氮源和磷源、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。
本发明使用的耐高锌的富锌酵母菌种，耐锌性能稳定，生长速率快，对锌的利用率高，含锌高可以达到2000～80000mg/kg。而现有技术生产的富锌酵母锌含量通常在1000mg/kg以下，最高才到2000mg/kg。此外，本发明生产高锌含量的富锌酵母可以是酵母活细胞，而现有技术生产的富锌酵母大多是没有活性富锌酵母。并且，本发明生产的高锌含量的富锌酵母生物锌含量高，可以达到90％。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。除非特别指明，本发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试剂。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明精神和实质的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：本发明对酿酒酵母菌种的筛选
1)筛选耐高锌的酵母菌种：将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)接种到不同浓度的含锌培养基中，筛选能够在高锌培养基中能够生长的菌种。挑选出耐锌的菌种作为驯化的菌种。
2)将耐锌的菌种接种到高浓度锌的培养基上进行培养，并逐渐提高培养基中锌的浓度，维持锌在较高的浓度。挑选出耐高锌而又稳定的菌种作为诱变菌种。
3)将挑选出来的菌种接种到不同浓度的氯化锂的培养基中诱变。
4)将诱变的菌种再进行分离筛选，利用摇瓶和小型发酵罐进行发酵选出锌含量高、生长速率快、产率高、对锌的利用率高的耐高锌的酵母菌种，即为富锌酵母菌种。经筛选得到一株锌含量高、生长速率快、产率高、对锌的利用率高的耐高锌的酵母菌种，将其命名为Z1.4，并进行保藏。
5)筛选培养基配方
麦芽汁培养基含糖量10％，含锌(氨基酸螯合锌)量150～5000μg/ml，pH值为5.5。
6)筛选培养条件
温度30℃，搅拌培养24小时。
实施例2：富锌酵母产品的生产
生产高锌含量富锌酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：
1)斜面菌种培养：将耐高锌的富锌酵母菌种接种到含糖量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。
2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种3环到装有250ml的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有25L的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有8m3的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为20％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150μg/ml，加5％磷酸氢氨、pH值为4.5的种子发酵罐中，在30℃培养48小时。
5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到150吨的含糖(淀粉水解糖和糖蜜各半)量为20％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为150μg/ml、加5％磷酸氢氨、pH值为5.0的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在20℃培养36小时。
6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
7)干燥：采用100℃流化态干燥，干燥的产品具有活性。
8)包装：可以采用多种形式的包装成为高锌含量的富锌酵母。锌含量达到2000mg/kg。
实施例3：富锌酵母产品的生产
生产高锌含量富锌酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：
1)斜面菌种培养：将耐高锌的富锌酵母菌种接种到含糖量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。
2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种4环到装有500ml的含糖(淀粉水解糖)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有40L的含糖(麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为500μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有15m³的含糖(糖蜜)量为15％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为500μg/ml，加1％磷酸氢氨、pH值为5.5的种子发酵罐中，在35℃培养20小时。
5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为15％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为500μg/ml加3％磷酸氢氨、pH值为6.0的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在30℃培养24小时。
6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。
8)包装：可以采用多种形式的包装成为高锌含量的富锌酵母。锌含量达到6700mg/kg。
实施例4：富锌酵母产品的生产
生产高锌含量富锌酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：
1)斜面菌种培养：将耐高锌的富锌酵母菌种接种到含糖量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。
2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有300ml的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖(麦芽汁和糖蜜各半)量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为1000μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m³的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为1000μg/ml，加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，在26～35℃培养18～48小时。
5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为1000μg/ml、加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。
6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。
8)包装：可以采用多种形式的包装成为高锌含量的富锌酵母。锌含量达到13800mg/kg。
实施例5：富锌酵母产品的生产
生产高锌含量富锌酵母的生产流程：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。具体工艺如下：
1)斜面菌种培养：将耐高锌的富锌酵母菌种接种到含糖量为10％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为5000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁固体斜面上，在30℃，培养24小时。
2)一级液体种子培养：将斜面的酵母菌种接种1～4环到装有100～500ml的含糖量为10％％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为5000μg/ml、pH值为5.5的麦芽汁专用培养瓶中，在30℃培养24小时。
3)二级液体种子培养；将一级液体种子培养液接种到装有10～40L的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为10％％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为4500μg/ml、pH值为5.5的卡氏培养瓶中，在30℃培养24小时。
4)发酵罐种子培养：将二级种子培养液接种到装有0.5～15m3的含糖(麦芽汁或糖蜜或麦芽汁和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为4500μg/ml，加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的种子发酵罐中，在26～35℃培养18～48小时。
5)发酵罐发酵培养：将发酵罐种子培养液接种到1～300吨的含糖(淀粉水解糖或糖蜜或淀粉水解糖和糖蜜的混合物)量为5～25％、锌(氨基酸螯合锌)浓度为4500μg/ml、加1～5％磷酸氢氨、pH值为4～6.5的发酵罐中，所用的营养源采用流加方式，锌采用流加方式加入，在26～35℃培养14～36小时。
6)分离：采用叠片式分离机分离再用真空转鼓过滤或者用板框压滤。
7)干燥：采用60～140℃流化态干燥，干燥的产品具有活性；采用100～180℃喷粉干燥或者用0.3～0.6Mpa的蒸汽压力滚筒干燥，干燥产品没有活性是粉状或小片状；也可以采用冷冻干燥法干燥。
8)包装：可以采用多种形式的包装成为高锌含量的富锌酵母。锌含量达到80000mg/kg。
实施例6：富锌酵母产品的生产
本实施例增加一级发酵罐种子培养，生产工艺为：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→一级发酵罐种子培养→二级发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。所增加的一级发酵罐种子培养方法和发酵罐培养大致相同，其他工艺同实施例2，只是发酵罐发酵培养选择淀粉水解糖8％和糖蜜作碳源5％、氨水3％作氮源、磷酸氢氨2％作磷源，培养液中的锌含量为2000μg/ml，pH值为5.2，温度28～32℃鼓风培养26小时。
本实施例生产出来的高锌含量的富锌酵母锌含量达到25900mg/kg。
实施例7：富锌酵母产品的生产
本实施例的生产方法同实施例2，但在干燥过程中采用流化态干燥的方法干燥出具有活性的高锌含量的富锌酵母，干燥工艺是：进风温度120～140℃，出风温度70～100℃，干燥20～50分钟，水分小于7％。
生产工艺：
斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养→分离→干燥→包装。
本实施例生产出来的高锌含量的富锌酵母的活细胞率达到80％以上。
综上所述，本发明的充分利用微生物遗传育种技术，微生物发酵技术，根据酵母菌对锌耐受的特性进行筛选出耐高锌的酵母菌种，再进行驯化、诱变技术选育出锌含量高、生长速率快、产率高、对锌的利用率高的耐高锌的富锌酵母菌种。针对该菌种制定的特定工艺生产出高锌含量的富锌酵母。特点是：耐锌性能稳定，生长速率快，对锌的利用率高；生物锌含量高，可以达到90％；该高锌含量的富锌酵母可以是活性也可是没有活性。具有更广阔的应用空间。