一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法.pdf

本发明涉及一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法。反应体系为液/液两相或液/液/固三相，两相时游离酶溶液(水相)构成固定相或流动相，三相时由固定化酶与水(流态化型的液相)构成固定相或流动相。一方面两液相在螺旋缠绕的管柱的行星式离心运动所产生的强度和方向周期变化的作用力和在波纹管内径向和轴向周期变化力的共同作用下，进行高频率的混合与澄清，强化酶或微生物与脂肪酸底物的接触及传递速率，提高底物的转化率；另一方面通过操作方式的选择和萃取、反萃过程的耦合，减少高浓度底物或产物积累所导致的酶活抑制，加速反应，提高底物的转化率。同时提出实现放大生产时对仪器所进行的改造。

1.  一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)游离酶溶液、固相载体固定化酶悬液、胶团或反胶团包被酶液的制备；
(2)根据生物柴油合成反应体系的组成成分与分相特点，确定固定相和流动相的组成，包括酶的形式、底物和产物在水相和有机相中的溶解情况、两相流体的粘度和分层时间、操作的简便程度等；
(3)分别配制未加入酶制剂的固定相和流动相，超声脱气15min，静置30min以上，对于固定相和流动相之间有一定的互溶比例的溶剂，在分液漏斗中将两相混匀，静置分层2h以上，分出轻相与重相，然后再超声脱气备用；
(4)将酶制剂加入到选定的含酶相中，分散均匀，根据酶活调整酶制剂添加量；
(5)通过恒流泵将固定相以8.0～10.0mL/min的流速泵入高速逆流反应器的螺旋管柱中，直至泵满，并从出口流出；
(6)启动高速旋转螺旋管柱，轻相作固定相时正向旋转，重相作固定相时反向旋转，转速300～900rpm，根据固定相保留情况进行转速调整；
(7)以0.5～2.0mL/min的流速泵入流动相，根据固定相保留情况和完成目标转化率所需要的反应时间调整流动相流速；
(8)为解决现有设备理论塔板数有限的问题，流动相采用回流操作；
(9)反应一定时间后，萃取或反萃或直接收集含有产物的液体，挥干溶剂或去除水分，获得产物并进行转化率分析。

2.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是高速逆流反应器的柱管类型包括直管、波形管、螺旋管及截面异形管等。

3.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是高速逆流反应器的柱管内径2.6～20.0mm。

4.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是步骤2)所述生物柴油合成反应的类型包括酯化、酯交换反应。

5.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是步骤2)所述反应底物的组成成分包括各种动植物油脂、由动植物油脂转化来的甘油二酯、甘油单酯、长链脂肪酸以及各种低碳醇(甲醇、乙醇、丙醇等)。

6.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是步骤2)所述组成固定相和流动相的其它溶剂包括各种水性缓冲液、石油醚、正己烷、正庚烷、异辛烷、环己烷等常用有机溶剂。

7.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是步骤2)所述催化用酶包括各种游离态或固定化(固体载体、胶团、反胶团)的脂肪酶、酯酶。

8.  如权利要求1所述一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法，其特征是步骤9)所述转化率检测方法包括酸碱滴定、气相色谱分析、液相色谱分析等。

一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法
技术领域
本发明涉及一种利用高速逆流反应器合成生物柴油的方法。
背景技术
高速逆流色谱(high speed counter current chromatography，HSCCC)是由美国国立卫生研究院(NIH)的Yoichiro Ito博士于上世纪80年代发明的一种色谱分离纯化技术。这种色谱装置由轻巧的聚四氟乙烯管缠绕成螺旋管，管内没有固体支撑物，螺旋管在自转的同时，围绕与自转轴成一定角度(平行、垂直或成一定角度)的公转轴旋转，产生了周期性变化的离心力场，管内的两相液体在阿基米德螺旋力的作用下，不断的混合、澄清，其中一相得以保留，另一相作为流动相被泵系统不断从管路的末端推出。目标产物与杂质在液/液两相间进行分配，根据分配系数的不同实现分离。目前高速逆流色谱作为一种分离纯化技术已经广泛应用于生物、医药、农林、能源、环境、化工、海洋科学等各个领域。
将高速逆流色谱分离纯化装置作为生物催化反应器使用，具有以下优势：
1)结构简单，便于放大。高速逆流色谱是液/液分配系统，没有固体支撑物，以轻巧的软螺旋空管作为反应柱，固定相和流动相都是流体，只要简单地延长螺旋管就可以将反应放大，另外也可以增加管径，这样可以提高固定相的保留率，制备型高速逆流设备通过创新，管径可达20mm，设备体积一般0.3m³，最大的也小于2m³，有利于多机生产，扩大生产规模；
2)进料方式灵活，传质速率快。原料物不需要严格的预处理，可处理带固体悬浮物的物料，反应器是一组螺旋空管，无内部构件，相的混合和澄清是靠轴向流动和径向周期变化的强离心力产生双向多角度的强烈振荡来实现，传质速率快并且易于通过流动相流速和螺旋管转速调节，两相有四个进出口，可方便组成逆流、并流操作，固定相可选择轻相或重相，因此操作上可多种组合，灵活性大；
3)无机械搅拌，无固相载体。无机械搅拌的反应器应用于酶催化反应，有利于延长酶的寿命，保持酶活，而无固相载体，避免了待分离样品与固相载体接触而可能产生的化学变性和不可逆吸附，从而降低成本。
生物柴油是生物质能的一种形式，其主要成分为通过动植物油脂转化而来的高级脂肪酸的低碳烷基酯混合物，以其物化性能与石化柴油相近，并可以直接代替石化柴油或与普通石化柴油以任意比例互溶代替石化柴油使用而得名。与得自于石油的石化柴油相比，得自于动植物油脂的生物柴油具有环境友好、在使用过程中降低有害废弃物排放等多方面环保优点，加之占世界能源消耗量40％的石油因资源量极为有限，造成原油和燃料油市场价格巨幅波动，生物柴油作为一种优质生物质可再生能源，自二十世纪九十年代以来在世界范围内形成了研究开发热潮，并已经形成快速发展的产业。随着生物技术的发展，近年来采用生物酶催化剂合成生物柴油的技术得到研究和发展，而生物酶技术还无法达到工业化实用水平，需要研究新的酶和不使用化学催化剂或使用可完全回收催化剂的生物柴油绿色化生产技术。发展生物柴油不可能像石油工业那样大规模集中生产，原因是资源多样与分布面积广阔，原料收集加工等成本相对高，因此国外有报导采用国家统一标准(我国也正在做)，分散生产，甚至可以农庄或个人为生产单元，高速逆流反应器现今已放大到一定规模，如管径可达到20mm，这将是一个很好的推广单元。目前尚未有利用高速逆流反应器进行生物柴油合成的报道。
发明内容
本发明的目的在于利用高速逆流反应器的液/液两相分配(或液/液/液、液/液/固、液/液/气等多相分配)，为生物柴油的合成反应提供一个场所，同时耦合产物的分离纯化过程，开发出连续、高效的生物柴油合成的生产工艺。一方面通过液/液两相间高频率的混合与澄清，增加酶或微生物与脂肪酸底物的接触面积，提高底物与产物在两相间的传质效率；另一方面通过操作方式的选择和萃取、反萃过程的耦合，减少高浓度底物或产物积累所导致的酶活抑制，加速反应，提高转化率。
本发明在放大作工业单元时，管径需放大至10～20mm，但目前高速逆流色谱仪均用均径直管，增加管长则分离时间过长，增大直径则使转鼓转速降低，分辨率降低。本发明中的工业规模部分，采用波纹状异形管绕制，管内增加周期性变化的径向和轴向力，增加两相接触混合，强化传质，增加流动相的微观停留时间，提高单位体积的柱效率，使放大成为现实。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
在高速逆流反应器中进行生物柴油的合成，若采用游离态的酶作生物催化剂，则反应体系为两相，若采用固定化酶、微生物作为生物催化剂或由反胶团包被的非水酶催化反应，则反应体系为三相，酶在相界面处发挥催化作用。通过调整四个进出口与泵系统的连接方式，流动相与固定相可逆流也可并流，通过调整螺旋管的旋转方向和转速，轻相和重相都可以作为固定相或流动相，反应温度通过水浴夹套调控，操作十分灵活。
具体步骤如下：
(1)游离酶溶液、固相载体固定化酶悬液、胶团或反胶团包被酶液的制备；
(2)根据生物柴油合成反应体系的组成成分与分相特点，确定固定相和流动相的组成，需要考虑的因素包括酶的形式、底物和产物在水相和有机相中的溶解情况、两相流体的粘度和分层时间、操作的简便程度等；
(3)分别配制未加入酶制剂的固定相和流动相，超声脱气15min，静置30min以上，若固定相和流动相之间有一定的互溶比例，则事先在分液漏斗中将两相混匀，静置分层2h以上，分出轻相与重相，然后再超声脱气备用；
(4)将酶制剂加入到选定的含酶相中，分散均匀，酶制剂的添加量根据酶活调整；
(5)通过恒流泵将固定相以8.0～10.0mL/min的流速泵入高速逆流反应器的螺旋管柱中，直至泵满，并从出口流出；
(6)开始高速旋转螺旋管柱，轻相作固定相时正向旋转，重相作固定相时反向旋转，转速300～900rpm，根据固定相保留情况进行转速调整；
(7)以0.5～2.0mL/min的流速泵入流动相，根据固定相保留情况和完成目标转化率所需要的反应时间进行流动相流速调整；
(8)为解决现有设备理论塔板数有限的问题，流动相采用回流操作；
(9)反应一定时间后，根据工艺的需要进行萃取或反萃，或者直接收集含有产物的液体，挥干溶剂或去除水分，获得产物并进行转化率分析。
本发明提供的高速逆流反应器合成生物柴油的方法，适用于利用各种游离或固定化的酶，从动植物油脂及其转化的甘油单酯、甘油二酯以及长链脂肪酸和低碳醇合成生物柴油。
本发明提供的高速逆流反应器合成生物柴油的方法，与常规机械搅拌、流态化、气升式、液升式等反应装置相比，具有结构简单易于规模放大、进料方式灵活、传质速率快、酶活保持较高和底物不可逆吸附低等优点。反应过程与分离过程耦合，简化了操作，并减少了高浓度底物与产物对酶活的抑制，提高了转化率。
具体实施方式
实施例1、在高速逆流反应器中进行脂肪酶催化油酸与甲醇合成生物柴油的反应，上相为固定相。
设备仪器：高速逆流反应器，直管，管内径5.0mm，柱体积300mL
水浴温度：40℃
反应体系：石油醚-磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)体系NOVO Lipozyme TL 100L，30,000U/mL酶液
上相组成：将350g油酸和50mL甲醇溶于1L石油醚(60～90℃)。
下相组成：1mL酶液溶于1L磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄)。
流动相采用回流操作，提高转化率。
运行方法：
通过恒流泵系统，以8.0mL/min流速用上相固定相充满反应柱管，然后开始旋转主机内的螺旋管柱，正向旋转850rpm，以1.0mL/min流速泵入下相流动相。收集从螺旋管柱出口流出的反应混合液，静置分层，每2h将流出的下相含酶流动相分出，回流至反应器入口，继续循环使用。
反应24h后停止主机旋转，停泵，用氮气将螺旋管柱内所有反应混合液吹出，静置分层，用NaOH滴定的方法检测上相有机相中减少的油酸的量，计算转化率。橄榄油水解法检测反应前后水相脂肪酶酶活的回收率。
运行结果：
上相固定相保留55～60％，24h酯化率76％，酶活回收92％。
实施例2、在高速逆流反应器中进行脂肪酶催化油酸与甲醇合成生物柴油的反应，下相为固定相。
设备仪器：高速逆流反应器，直管，管内径5.0mm，柱体积300mL
水浴温度：40℃
反应体系：石油醚-磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)体系NOVO Lipozyme TL 100L，30,000U/mL酶液
上相组成：将350g油酸和50mL甲醇溶于1L石油醚(60～90℃)。
下相组成：1mL酶液溶于1L磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄)。
流动相采用回流操作，提高酶的利用率，减少酶的用量。
运行方法：
通过恒流泵系统，以8.0mL/min流速用下相固定相充满反应柱管，然后开始旋转主机内的螺旋管柱，反向旋转750rpm，以0.8mL/min流速泵入上相流动相。待螺旋管柱出口有连续的上相流出，直接将流出液回流至反应器入口，提高反应转化率，每隔2h，从反应器出口取少量流动相样品，用NaOH滴定的方法监测减少的油酸的量，计算转化率，从而监测反应进程。
反应24h后停止主机旋转，停泵，用氮气将螺旋管柱内所有反应混合液吹出，静置分层，用NaOH滴定的方法检测上相有机相中减少的油酸的量，计算总转化率。橄榄油水解法检测反应前后水相脂肪酶酶活的回收率。
运行结果：
下相固定相保留34～37％，第一个2h后酯化率11％，24h总酯化率85％，酶活回收96％。
实施例3、在高速逆流反应器中进行固定化脂肪酶催化棕榈酸与乙醇合成生物柴油的反应，上相为固定相。
设备仪器：高速逆流反应器，波纹管，管内径10.0mm，柱体积350mL
水浴温度：40℃
反应体系：异辛烷-磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)体系Novyzym 4352,500U/g固定化酶颗粒，粒径0.3mm
上相组成：将200g棕榈酸酸和30mL乙醇溶于1L异辛烷。
下相组成：4.0g固定化酶颗粒悬浮于1L磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄)。
流动相采用回流操作，提高转化率。
运行方法：
通过恒流泵系统，以8.0mL/min流速用上相固定相充满反应柱管，然后开始旋转主机内的螺旋管柱，正向旋转800rpm，以0.5mL/min流速泵入下相流动相。收集从螺旋管柱出口流出的反应混合液，静置分层，每2h将流出的下相含酶流动相分出，回流至反应器入口，继续循环使用。
反应24h后停止主机旋转，停泵，用氮气将螺旋管柱内所有反应混合液吹出，静置分层，用NaOH滴定的方法检测上相有机相中减少的棕榈酸酸的量，计算转化率。橄榄油水解法检测反应前后水相脂肪酶酶活的回收率。
运行结果：
上相固定相保留64～69％，24h酯化率80％，酶活回收96％。
实施例4、在高速逆流反应器中进行固定化脂肪酶催化棕榈酸与乙醇合成生物柴油的反应，下相为固定相。
设备仪器：高速逆流反应器，波纹管，管内径10.0mm，柱体积350mL
水浴温度：40℃
反应体系：异辛烷-磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)体系Novyzym 4352,500U/g固定化酶颗粒，粒径0.3mm
上相组成：将200g棕榈酸酸和30mL乙醇溶于1L异辛烷。
下相组成：4.0g固定化酶颗粒悬浮于1L磷酸缓冲液(pH 7.8，0.02MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄)。
流动相采用回流操作，提高酶的利用率，减少酶的用量。
运行方法：
通过恒流泵系统，以8.0mL/min流速用下相固定相充满反应柱管，然后开始旋转主机内的螺旋管柱，反向旋转700rpm，以0.5mL/min流速泵入上相流动相。待螺旋管柱出口有连续的上相流出，直接将流出液回流至反应器入口，提高反应转化率，每隔2h，从反应器出口取少量流动相样品，用NaOH滴定的方法监测减少的棕榈酸的量，计算转化率，从而监测反应进程。
反应24h后停止主机旋转，停泵，用氮气将螺旋管柱内所有反应混合液吹出，静置分层，用NaOH滴定的方法检测上相有机相中减少的棕榈酸的量，计算总转化率。橄榄油水解法检测反应前后水相脂肪酶酶活的回收率。
运行结果：
下相固定相保留30～33％，第一个2h后酯化率8％，24h总酯化率92％，酶活回收99％。