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1、(10)申请公布号 CN 102702327 A (43)申请公布日 2012.10.03 CN 102702327 A *CN102702327A* (21)申请号 201210204261.6 (22)申请日 2012.06.20 C07K 7/23(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 吉尔生化 （上海） 有限公司 地址 201100 上海市闵行区紫月路 519 号 申请人 上海吉尔多肽有限公司 滨海吉尔多肽有限公司 (72)发明人 徐红岩 竺剑峰 饭岛悠介 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 。
2、31113 代理人 张劲风 (54) 发明名称 一种阿拉瑞林的固液相合成法 (57) 摘要 本发明涉及阿拉瑞林的一种固液结合的合成 方法。 主要解决现有合成方法存在的收率低、 成本 高、 反应条件苛刻、 污染大的技术问题。本发明主 要合成步骤 ： 1） 以脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树 脂为起始树脂采用芴甲氧羰基固相合成法逐一偶 联每一个保护氨基酸， 合成得到侧链全保护的肽 链树脂 ； 2） 对侧链全保护的肽链树脂进行切割， 得到全保护的肽链片段 pGluP-9 ； 3） 对全保护的 肽链片段pGluP-9进行C端乙胺化， 得到阿拉瑞林 的全保护片段 ； 4） 对阿拉瑞林的全保护片段。
3、切割 除去侧链保护基， 得到阿拉瑞林粗品肽。 本发明具 备大规模化生产能力， 操作简易、 工艺稳定、 生产 成本低， 总收率超过 40%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种阿拉瑞林的固液相合成法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1） 以脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂为起始树脂采用芴甲氧羰基固相合成法逐一偶 联每一个保护氨基酸， 合成得到侧链全保护的肽链树脂 ； 2） 对侧链全保护的肽链树脂进行切割， 得到全保护的肽链片段 pGluP。
4、-9 ； 3） 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化， 得到阿拉瑞林的全保护片段 ； 4） 对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基， 得到阿拉瑞林粗品肽。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1） 具体内容包括如下步骤 ： 1）取脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂用二氯甲烷浸泡， 使树脂充分溶胀， 抽干， 以 N,N- 二甲基甲酰胺作溶剂， 加入芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰 基） 精氨酸、 N- 甲基吗啉或二异丙基乙胺， 用 O- 苯并三唑 -N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸 盐 /1- 羟基。
5、苯并三唑、 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 /1- 羟基苯 并三唑、 O-(7- 偶氮苯并三氮唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基 -7- 偶 氮苯并三唑中的一种混合物为缩合剂， 反应 0.5-2 小时， 茚三酮法检测反应终点， 抽干， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 抽干， 获得芴甲氧羰基 -（2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋 喃 -5- 磺酰基） 精氨酸 - 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂 ； 2） 在步骤 （1） 获得的树脂中， 加入脱帽试剂， 反应 10-30 分钟， 。
6、抽干， 用 N,N- 二甲基甲 酰胺洗涤5-10次， 抽干， 以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂， 加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸、 N-甲基吗啉或二异丙基乙胺， 以及用O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟 基苯并三唑、 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 /1- 羟基苯并三唑、 O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟基-7-偶氮苯并三 唑中的一种混合物为缩合剂， 反应 0.5-2 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 N,N- 二甲基甲酰胺 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护。
7、反应， 再加入具有芴甲氧羰基保护基团 的氨基酸， 如此反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 再用 甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得焦谷氨酸 -( 三 苯甲基 ) 组氨酸 -（叔丁氧羰基） 色氨酸 -（叔丁氧基） 丝氨酸 -（叔丁氧基） 酪氨酸 -D- 丙氨 酸 - 亮氨酸 - （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰基） 精氨酸 - 脯氨酸 -2 氯 - 三苯 甲基 - 氯树脂 ； 所说的具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸， 依次包括 ： 芴甲氧羰基亮氨酸， 芴甲氧羰基 -D- 丙氨。
8、酸， 芴甲氧羰基叔丁氧基酪氨酸， 芴甲氧羰基叔丁氧基丝氨酸， 芴甲氧 羰基叔丁氧羰基色氨酸， 芴甲氧羰基三苯甲基组氨酸。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂的取代 度在 0.3mmol/g-1.2mmol/g 之间， 芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰 基） 精氨酸的量为树脂摩尔量的 1-5 倍 ； 脱帽试剂为体积比 10-30% 的哌啶 /N,N- 二甲基甲 酰胺混合溶液， 每一步保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的 1-5 倍， 缩合试剂的量是树脂摩 尔量的 1-5 倍， N- 甲基吗啉或二异丙。
9、基乙胺的量是树脂摩尔量的 2-10 倍， 每一步反应终点 的检测方法所采用的是茚三酮检测法。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂的取代 度为 0.6mmol/g， 芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰基） 精氨酸的量 为树脂摩尔量的2倍 ； 脱帽试剂为体积比20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液， 每一步 保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的 2 倍， 缩合试剂为 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲 权 利 要 求 书 CN 102702327 A 2 2/2 页 3 基脲鎓。
10、六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑， 其用量是树脂摩尔量的2倍， 二异丙基乙胺的量是树 脂摩尔量的 4 倍。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 2） 包括如下步骤 ： 在侧链全保护的肽链树脂加入切肽试剂， 反应 1-3 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集 滤液， 减压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9。 6. 根据权利要求5所述的方法， 其特征在于所用的切肽试剂为体积比为1%-5%的三氟 乙酸 / 二氯甲烷混合溶液。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于所用的切肽试剂为体积比为2%的三氟乙酸 / 二氯甲烷混合溶。
11、液。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 3） 包括如下步骤 ： 将全保护的肽链片段 pGluP-9 溶于 N,N- 二甲基甲酰胺溶液中， 加入乙胺盐酸盐、 二异 丙基乙胺， 用 ( 苯并三唑 -1- 氧 )- 三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基苯并三唑、 二异 丙基碳二亚胺 /1- 羟基苯并三唑、 O- 苯并三唑 -N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 / 1- 羟 基苯并三唑中一种混合物为缩合剂， 搅拌反应 12-24 小时， 乙胺盐酸盐的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1-5 倍， 缩合剂的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1-5 倍，。
12、 二异丙基乙 胺的用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的3-15倍， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色 固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的全保护片段。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 缩合试剂选用 ( 苯并三唑 -1- 氧 )- 三吡 咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基苯并三唑， 搅拌反应 18 小时， 乙胺盐酸盐的用量是肽链 片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， 缩合剂的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， 二异丙 基乙胺的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 6 倍。 10. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 。
13、所述的步骤 4） 包括如下步骤 ： 将阿拉瑞林的全保护片段中加入去保护试剂， 去保护试剂选用体积比三氟乙酸 : 水 : 三异丙基硅烷 =95:2:3 的混合试剂， 或者是体积比为三氟乙酸 : 苯甲硫醚 : 苯酚 : 乙二硫 醇 : 水 =87.5:5:2.5:2.5:2.5 的混合试剂， 反应时间是 1-3 小时， 反应结束后， 加乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品。 权 利 要 求 书 CN 102702327 A 3 1/6 页 4 一种阿拉瑞林的固液相合成法 技术领域 0001 本发明涉及一种阿拉瑞林的合成方法， 特别涉及一种阿拉瑞林的固。
14、液相合成法。 背景技术 0002 阿拉瑞林， 中文名称为醋酸阿拉瑞林， 又名丙氨瑞林， 英文名称 Alarelin Acetate, 多 肽 序 列 为 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHC2H5, 分 子 式 C56H78N16O12, 分子量为 1167.30, 结构式如下 : 本品为人工合成的促性腺激素释放激素 （GnRH） 的九肽类似物， 用药初期可刺激垂 体释放促黄体生成素 （LH） 和促卵泡素 （FSH） 引起卵巢源性甾体激素短暂升高 ； 重复用药可 抑制垂体释放 LH 和 FSH 使血中的雌二醇水平下降达到药物去卵巢的作用这种抑制作。
15、用可 用于治疗子宫内膜异位症等激素依赖性疾病。 发明内容 0003 本发明的目的是提供了一种高收率、 低成本、 反应条件温和、 环境污染小、 有利于 实现产业化的阿拉瑞林的固液相结合的合成方法。主要解决现有合成方法存在的收率低、 成本高、 反应条件苛刻、 污染大的技术问题。 0004 为实现上述目的， 本发明采取以下技术方案 ： 一种阿拉瑞林的固液相合成方法， 包括如下步骤 ： 1） 以H-Pro-2Cl-Trt-Cl树脂为起始树脂采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护 氨基酸， 合成得到侧链全保护的肽链树脂 ； 2） 对侧链全保护的肽链树脂进行切割， 得到全保护的肽链片段 pGluP-9 。
16、； 3） 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化， 得到阿拉瑞林的全保护片段 ； 4） 对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基， 得到阿拉瑞林粗品肽 ； 按照本发明， 依次连接每一个保护氨基酸， 获得侧链全保护的肽链树脂， 其间依次脱除 Fmoc- 保护基团的方法包括如下步骤 ： 1） 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂用 DCM 浸泡， 使树脂充分溶胀， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 依次 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 NMM 或 DIEA， 用 HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种混合 物为缩合剂， 反应 0.5-2。
17、 小时， 茚三酮法检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 获得 说 明 书 CN 102702327 A 4 2/6 页 5 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 ； H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 取 代 度 为 ： 0.3mmol/g1.2mmol/g， 更 为 优 化 的 方 案 为 0.6mmol/g ； Fmoc-Arg(pbf)-OH的量为树脂摩尔量的1-5倍， 更为优化的方案为树脂摩尔量的2倍。 0005 2）在步骤 （1）的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入脱帽试剂， 反应 10。
18、-30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 5-10 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具有 Fmoc 保护的氨基 酸、 NMM 或 DIEA， 以及用 HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种混合物为缩合剂， 反 应 0.5-2 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱 保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥 , 获得 pG。
19、lu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf )-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 ； 脱帽试剂的配比为 10%-30% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液， 更为优化的方案为 20% 的 PIP/ DMF(v/v) 溶液 ； Fmoc 保护的氨基酸的量为树脂摩尔量的 1-5 倍， 更为优化的方案为树脂摩 尔量的 2 倍 ； 缩合试剂 （HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种混合物） 的量为树脂摩 尔量的 1-5 倍， 更为优化的方案为 TBTU/HOBT 的量为树脂摩尔量的 2 倍 ； N。
20、MM 或 DIEA 的量 为树脂摩尔量的 2-10 倍， 更为优化的方案为 DIEA 为树脂摩尔量的 4 倍 ； 所说的具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 依次包括 ： Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tbu)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH， Fmoc-Trp(boc)-OH， Fmoc-His(Trt)-OH。 0006 按照本发明， 所述的切肽包括如下步骤 ： 在上述步骤 (2) 所获得的 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu- Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树。
21、脂中加入 1%-5%TFA/DCM(v/v) 切肽试剂， 反应 1-3 小时， 抽滤 滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全 保护的肽链片段 pGluP-9 ； 更为优化的方案为选用 2%TFA/DCM(v/v) 切肽试剂， 反应 2 小时。 0007 按照本发明， 所述的对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化的方法步骤如 下 ： 将全保护的肽链片段 pGluP-9 溶于 DMF 溶液中， 加入乙胺盐酸盐、 DIEA ， 用 PyBOP/ HOBT、 DIC /HOBT、 HBTU/ HOBT 中一种混合物为缩合剂， 搅拌。
22、反应 12-24 小时， 乙胺盐酸盐的 用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的1-5倍， 缩合剂的用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的1-5 倍， DIPEA 的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 3-15 倍， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的全保护片段 ； 更为优化的方案为 ： 乙胺盐酸盐的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， 缩合 试剂选用 PyBOP/HOBT， 用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， DIEA 用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 6 倍， 反应时间 18 小时。 0008 。
23、按照本发明， 所述的对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基的方法步骤如 下 ： 将 阿 拉 瑞 林 的 全 保 护 片 段 中 加 入 去 保 护 试 剂，去 保 护 试 剂 的 说 明 书 CN 102702327 A 5 3/6 页 6 配比是 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v), 或者是 TFA: 苯甲硫醚 : 苯 酚 :EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)。反应时间是 1-3 小时， 反应结束后， 加乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 ； 更为优化的方案是选用 TFA:H2O:Tis=95:2:3。
24、(v/v) 的去保护试剂， 反应 2 小时。 0009 本发明中一些常用缩写具有以下含义 HBTU ： O- 苯并三唑 -N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 HATU ： O-(7- 偶氮苯并三氮唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 TBTU ： O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 PyBOP ： ( 苯并三唑 -1- 氧 )- 三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 DIC ： 二异丙基碳二亚胺 HOBt ： 1- 羟基苯并三唑 HOAt ： 1- 羟基 -7- 偶氮苯并三唑 DIEA ： 二异丙基乙胺 PIP ： 哌啶 NMM ： N- 。
25、甲基吗啉 Fmoc ： 芴甲氧羰基 Pbf ： 2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5 磺酰基 Trt ： 三苯甲基 Tbu ： 叔丁基 Boc ： 叔丁氧羰基 pGLu ： 焦谷氨酸 His ： 组氨酸 Trp ： 色氨酸 Ser ： 丝氨酸 Tyr ： 酪氨酸 D-Ala ： D- 丙氨酸 Leu ： 亮氨酸 Arg ： 精氨酸 Pro ： 脯氨酸 Piperide ： 哌啶 DMF ： N,N- 二甲基甲酰胺 DCM ： 二氯甲烷 TFA ： 三氟乙酸 EDT ： 乙二硫醇 Tis ： 三异丙基硅烷 pGluP-9 ： 序列为 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)。
26、-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf )-Pro-OH 九肽的缩写。 具体实施方式 说 明 书 CN 102702327 A 6 4/6 页 7 0010 以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述， 但本发明不限于这具体实例。 0011 实施例 1 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 称取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 50 克 (Loading 0.6mmol/g, 30mmol)， 用 800ml DCM 浸 泡 30 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:64。
27、8.8， 60mmol) 38.9g， TBTU(MW:321.1， 60mmol) 19.3g， HOBT(MW:135.1， 60mmol) 8.1g， DIEA(MW:129.24， 120mmol)20ml， DMF500ml， 反应 1.5 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0012 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 在步骤 （1） 的。
28、 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具有 Fmoc 保护的氨基酸、 DIEA、 TBTU/HOBT、 ， 反应 1.5 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此 反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后， DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树。
29、脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu) -D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 102g。 0013 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 60mmol)21.2g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 60mmol)18.7g， Fmoc-Tyr(tbu)-OH (MW:459.5， 60mmol)27.6g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 60mmol)23。
30、g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)31.6g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 60mmol)37.2g， pGlu-OH (MW:129.1， 60mmol)7.7g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： TBTU(MW:321.1， 60mmol) 19.3g， HOBT(MW:135.1， 60mmol) 8.1g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： DIEA(MW:129.24， 120mmol)20ml。 0014 3） 制备全保护的肽链片段 pGluP-9 取步骤 （2） 中的 pGLu-His(Trt)-T。
31、rp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf) -Pro-2Cl-Trt-Cl树脂102g， 置于2L的圆底烧瓶中， 加入1000ml切肽试剂,配比为2%TFA/ DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减压蒸馏除 去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 51.2g。 0015 4) 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段 pGluP-9 共 51.2g 溶于 2L DMF 溶液中， 加入 1.5e。
32、q 的 乙胺盐酸盐 3.67g、 1.5eq PyBOP 23.4g、 1.5eq HOBT 6.08g 、 6eq DIEA 30ml， 25 搅拌反应 18 小时， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿 拉瑞林的全保护片段共 53.2g。 0016 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共 53.2g 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 去 保护试剂， 配比为 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v)， 25恒温振荡反应 2 小时， 反应结束后， 加乙 醚沉淀， 离心收集。
33、沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 31.2g。粗品收 率 89.1%， 粗品纯度 75.8%。 说 明 书 CN 102702327 A 7 5/6 页 8 0017 实施例 2 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 称 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 67 克 (Loading 0.45mmol/g, 30mmol)，用 800ml DCM 浸泡 30 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8， 90mmol) 58.4g， HBTU(MW:379.2， 9。
34、0mmol) 34.1g， HOBT(MW:135.1， 90mmol) 12.2g， NMM(MW:102.1， 180mmol)20ml， DMF500ml， 反应 1 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽 干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0018 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 。
35、800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具有 Fmoc 保护的氨基酸、 NMM、 HBTU/HOBT， 反应 1 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此反 复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后， DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最 后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser。
36、(tbu)-Tyr(tbu)-D -Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 115g。 0019 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 90mmol)31.8g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 90mmol)28.0g， Fmoc-Tyr(tbu)-OH (MW:459.5， 90mmol)41.4g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 90mmol)34.5g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)47.。
37、4g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 90mmol)55.8g， pGlu-OH (MW:129.1， 90mmol)11.6g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： HBTU(MW:379.2， 90mmol) 34.1g， HOBT(MW:135.1， 90mmol) 12.2g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： NMM(MW:102.1， 180mmol)20ml。 0020 3） 制备全保护的肽链片段 pGluP-9 取步骤 （2） 中的 pGLu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(。
38、pbf) -Pro-2Cl-Trt-Cl树脂115g， 置于2L的圆底烧瓶中， 加入1000ml切肽试剂,配比为2%TFA/ DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减压蒸馏除 去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 47.2g。 0021 4) 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段 pGluP-9 共 49.6g 溶于 2L DMF 溶液中， 加入 1.5eq 的 乙胺盐酸盐 3.67g、 1.5eq PyBOP 23.4g、 1.5e。
39、q HOBT 6.08g 、 6eq DIEA 30ml， 25 搅拌反应 18 小时， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿 拉瑞林的全保护片段共 48.5g。 0022 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共 48g 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 去保 护试剂， 配比为 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v)， 25恒温振荡反应 2 小时， 反应结束后， 加乙醚 沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 28.6g。粗品收。
40、率 81.7%， 粗品纯度 65.2%。 0023 实施例 3 说 明 书 CN 102702327 A 8 6/6 页 9 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 称 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 42 克 (Loading 0.72mmol/g, 30mmol)，用 800ml DCM 浸泡 30 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8， 60mmol) 38.9g， HATU(MW:380.23， 60mmol) 22.8g， HOAT(MW:136.1， 60mmol) 8.2g，。
41、 NMM(MW:102.1， 120mmol)14ml， DMF500ml， 反应 0.5 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0024 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30。
42、 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具有 Fmoc 保护的氨基酸、 NMM、 HATU/HOAT， 反应 0.5 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此 反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后， DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu) -D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2C。
43、l-Trt-Cl 树脂 92g。 0025 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 60mmol)21.2g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 60mmol)18.7g， Fmoc-Tyr(tbu)-OH (MW:459.5， 60mmol)27.6g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 60mmol)23g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)31.6g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 60mmol)37.2g。
44、， pGlu-OH (MW:129.1， 60mmol)7.7g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： HATU(MW:380.23， 60mmol) 22.8g， HOAT(MW:136.1， 60mmol) 8.2g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： NMM(MW:102.1， 120mmol)14ml。 0026 3） 制备全保护的肽链片段 pGluP-9 取步骤 （2） 中的 pGLu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf) -Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 92g， 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入。
45、 1000ml 切肽试剂 , 配比为 2%TFA/ DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减压蒸馏除 去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 49.3g。 0027 4) 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段 pGluP-9 共 49.3g 溶于 2L DMF 溶液中， 加入 3eq 的乙 胺盐酸盐 7.34g、 3eq DIC 11.4g、 3eq HOBT 12.2 g 、 12eq DIEA 60ml， 25搅拌反应 18 小 时。
46、， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的全保 护片段共 51.2g。 0028 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共 51.2g 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 去 保护试剂， 配比为 TFA: 苯甲硫醚 : 苯酚 :EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)， 25恒温振 荡反应2.5小时， 反应结束后， 加乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤3-6次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 29.8g。粗品收率 85.1%， 粗品纯度 72.3%。 说 明 书 CN 102702327 A 9 。