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1、(10)申请公布号 CN 103724389 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103724389 A (21)申请号 201310712528.7 (22)申请日 2013.12.23 C07J 9/00(2006.01) C07J 75/00(2006.01) (71)申请人 福建仙芝楼生物科技有限公司 地址 350002 福建省福州市金山大道 618 号 橘园洲工业园 31 栋 (72)发明人 李晔 姚渭溪 朱忠敏 周岩飞 (54) 发明名称 一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝 酸 F 的方法 (57) 摘要 一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵 芝酸 F 。
2、的方法， 包括 ：（1）采用大孔树脂对灵芝 醇提物初步富集纯化， 将灵芝醇提物分成纯度 30%60% 灵芝酸部位 ；（2）将分离得到的灵芝酸 部位经高速逆流色谱再次分离， 得到纯度较高的 灵芝酸。溶剂体系由石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇、 水 组成， 体积比为 5:3-7:1-6:4-9 ； 溶剂上相为固定 相， 下相为流动相， 样品用下相溶液溶解并进样 ； 固定相流速 1020mL/min， 流动相流速 1.53mL/ min， 主机转速 6001000 转 / 分钟， 采用自动部分 收集器收集分离物， 每 410mL 收集为一个馏分 ； （3） 高效液相色谱法分析检测各试管收集液成分， 按不同。
3、成分收集、 浓缩、 干燥， 分离得到纯度高达 95%的灵芝酸C1 和灵芝酸F。 本方法具有高效、 快 速、 分离量大、 回收率高、 节约溶剂等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103724389 A CN 103724389 A 1/1 页 2 1.一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特征在于采用大孔树脂层 析和高速逆流色谱二种技术联用的分离纯化灵芝酸的方法， 它包括 ： 1.1 大孔树脂分离纯化灵芝酸 ：。
4、 选择大孔树脂 HZ-801B、 HZ-806、 HZ-816、 HZ-818、 HZ-835 或 AB-8 中的一种， 装柱， 以 30%60% 乙醇溶解灵芝醇提物并上样， 按水、 30%90% 乙 醇， 依次进行梯度洗脱柱子， 其中乙醇的浓度按 10%20% 递增， 将灵芝酸慢慢洗脱下来， 每 1/15 1/3 柱体积收集为一个馏分， 每个馏分由高效液相色谱仪分析检测其成分， 并合并其 中主要含有灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩得到以灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 为主的混合物 ； 1.2 高速逆流色谱法分离灵芝酸 ： 溶剂体系由石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇、 水组成， 其体积 用量比。
5、为5 : 3-7 : 1-6 : 4-9 ； 按上述溶剂体系配制溶液， 并置于分液漏斗中充分震摇后 静置分层， 取上相为固定相， 下相为流动相， 超声脱气 15-30min， 冷却至室温后备用 ； 先将 固定相以 1020mL/min 流速泵入主机， 待主机充满固定相后， 以 1.53mL/min 泵入流动相， 同时开启主机转速， 主机转速 6001000 转 / 分钟， 待体系平衡后， 再以流动相溶解步骤 1.1 制得的灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 混合物并进样， 流出液由自动部分收集器， 每 410mL 收集为一 个馏分， 每个馏分的成分由高效液相色谱仪分析检测。 2.根据权利要求1所述的一。
6、种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特 征在于 ： 所述步骤 1.1 中用 35%55% 乙醇溶解提取物样品并上样， 按照水、 30%90% 乙醇， 其 中乙醇的浓度按 15% 或 20% 递增， 依次进行梯度洗脱， 每 1/101/5 柱体积收集为一个馏分， 每个馏分由高效液相色谱仪分析检测其成分， 并合并其中主要含有灵芝酸C1和灵芝酸F的 馏分， 浓缩得到以灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 为主的混合物。 3. 根据权利要求 1 所述的一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的方法， 其 特征在于 ： 步骤 1.2 所述的溶剂体系中石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇、 水的体积。
7、用量比为 5 ： 4-6 ： 2-5 ： 5-8。 4.根据权利要求1所述的一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特 征在于 ： 步骤 1.2 所述的固定相流速为 1520mL/min。 5.根据权利要求1所述的一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特 征在于 ： 步骤 1.2 所述的流动相流速为 23mL/min。 6.根据权利要求1所述的一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特 征在于 ： 步骤 1.2 所述的主机转速为 7001000 转 / 分钟。 7.根据权利要求1所述的一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸C1和灵芝酸F的方法， 其特 征在于 。
8、： 步骤 1.2 所述的流出液收集， 为每 48mL 收集为一个馏分。 权 利 要 求 书 CN 103724389 A 2 1/4 页 3 一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从灵芝的醇提物中分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝 酸 F 的方法， 特别是涉及一种采用大孔树脂层析和高速逆流色谱二种技术联用， 分离制备 高纯度抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的方法。 背景技术 0002 灵芝， 别名瑞草、 万年蕈等， 是一种大型药用真菌， 属于担子菌岗多孔菌科灵芝属 真菌， 包括赤芝 Ganoderma lucidum(Lev。
9、ss. ex Fr.)Karst. 和紫芝 Ganoderma sinense Zhao. Xu et zhang. 的干燥子实体。 具有补中益气、 滋阴强壮、 扶正固本、 延年益寿等功效， 历代医书将其列为上品。 灵芝三萜类化合物是灵芝中重要的活性成分之一。 到目前为止， 已 成功分离出三萜类化合物 150 余种， 其中大部分是灵芝酸， 但是由于它在灵芝中的含量低， 且结构相近， 分离和纯化工艺复杂， 实验室一般采用层析法和色谱法多次分离提纯， 这样所 得到的高纯度灵芝三萜化合物的量很少且成本较高， 难以开展灵芝三萜在药理学、 药效学 和毒理学等方面的研究， 极大影响灵芝三萜的继续开发和利用。
10、。 因此， 研究三萜化合物的大 容量分离纯化的技术具有重要的理论意义和实践意义。现代药理研究表明， 灵芝酸具有抗 肿瘤、 保肝、 降血糖、 抑制血管紧张素、 抗氧化等作用， 其中灵芝酸C1和灵芝酸F对抗肿瘤具 有较好的疗效。 0003 中国专利 CN 102532231A 中， 由灵芝子实体份直接采用超临界二氧化碳提取分离 灵芝酸。 由于超临界二氧化碳是非极性溶剂， 适合提取非极性或极性低的成分， 而灵芝酸这 类极性比较大的成分就难以提取出来， 因此采用超临界二氧化碳提取灵芝酸不仅得率低， 更重要是灵芝内的非极性和极性低的成分被优先提取出来， 大大降低了提取物中灵芝酸的 纯度， 因此该方法所得。
11、灵芝酸纯度一般低于 20%， 由于灵芝 A 只是灵芝内所包含的几十种灵 芝酸中的一种， 因此灵芝酸A在该提取物中低于10%。 由于样品的纯度低， 杂质多， 又没有经 过进一步纯化就直接上高速逆流分离得 95% 高纯度灵芝酸 A， 就大大增加了高速逆流分离 所用甲醇、 氯仿等有毒溶剂的用量， 也带来环境方面问题。 0004 中国专利CN 101671383B中， 采用硅胶柱层析结合结晶的方法制备7-乙氧基灵芝 酸 O 和灵芝酸 T， 虽然能得到纯度较高的灵芝酸单体， 但是其分离纯化方法都存在一定的局 限性。因为硅胶柱层析需要使用甲醇、 氯仿等毒性较大的溶剂， 且硅胶不能重复利用， 用完 一次就丢。
12、掉， 易造成资源浪费和环境污染 ； 而该专利中由于经硅胶初步纯化后的样品纯度 不够， 所以在结晶过程中需要加入高纯度灵芝酸碎晶的进行诱导结晶， 这些高纯度的灵芝 酸碎晶 （纯度高， 相当于对照品） 一般都价格昂贵、 不易制备， 也增加了试验成本。 0005 除上述专利外， 目前暂未见采用大孔树脂层析和高速逆流色谱法联用， 分离制备 高纯度抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的方法。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种处理量大、 分离效率高、 溶剂用量少的从灵芝的醇提物 说 明 书 CN 103724389 A 3 2/4 页 4 中分离制备高纯度抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 。
13、的方法。 0007 本发明的技术方案为一种分离制备抗肿瘤成分灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的方法， 其 技术要点在于采用大孔树脂层析和高速逆流色谱的联用技术分离纯化灵芝酸的方法， 它包 括 ： 1.1 大孔树脂富集纯化灵芝酸 ： 选择大孔树脂 HZ-801B、 HZ-806、 HZ-816、 HZ-818、 HZ-835 或 AB-8 中的一种， 装柱， 以 30%60% 乙醇溶解灵芝醇的提物并上样， 按水、 30%90% 乙醇， 其中乙醇的浓度按 10%20% 递增， 依次进行梯度洗脱柱子， 将灵芝酸慢慢洗脱下来， 每1/15 1/3柱体积收集为一个馏分， 每个馏分由高效液相色谱仪分析检测其成。
14、分， 并合并 其中主要含有灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩得到以灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 为主的混合 物 ； 1.2 高速逆流色谱法分离灵芝酸 ： 溶剂体系由石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇、 水组成， 其体积 用量比为5 : 3-7 : 1-6 : 4-9 ； 按上述溶剂体系配制溶液， 并置于分液漏斗中充分震摇后 静置分层， 取上相为固定相， 下相为流动相， 超声脱气 15-30min， 冷却至室温后备用 ； 先将 固定相以 1020mL/min 流速泵入主机， 待主机充满固定相后， 以 1.53mL/min 泵入流动相， 同时开启主机转速， 主机转速 6001000 转 / 分钟， 。
15、待体系平衡后， 再以流动相溶解步骤 1.1 制得的灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 混合物并进样， 流出液由自动部分收集器， 每 410mL 收集为一 个馏分， 每个馏分的成分由高效液相色谱仪分析检测。 0008 采用大孔树脂层析法代替传统的硅胶柱层析法， 即节约了试验成本， 特别是消除 了有机溶剂带来的环境污染等问题， 同时大孔树脂处理量大且可重复使用， 均有利于工艺 的产业化转变。本发明也可用于收集其它的灵芝酸， 只要将收集的每个馏分由高效液相液 相分析检测， 再根据需要合并各个馏分中的不同的灵芝酸。 0009 高速逆流色谱是近 20 年来迅速发展的一项高新技术。它是利用溶质在两种互不 相溶的溶。
16、剂体系中分配系数的差别， 从而实现分离的色谱法。 它无需固体作固定相， 不存在 固体对样品成分的吸附、 沾污、 变性和失活等现象， 因此有很高的回收率， 且其样品容量大、 分离效率高， 可提高灵芝三萜的分离纯化效率及其半自动化生产。 0010 还可进一步将各个参数具体为 ： 步骤1.1中用35%55%乙醇溶解提取物样品并上样， 按照水、 30%90%乙醇， 其中乙醇的 浓度按 15% 或 20% 递增， 依次进行梯度洗脱， 每 1/101/5 柱体积收集为一个馏分， 每个馏分 由高效液相色谱仪分析检测其成分， 并合并其中主要含有灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓 缩得到以灵芝酸 C1 和。
17、灵芝酸 F 为主的混合物。 0011 步骤 1.2 所述的溶剂体系中石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇、 水的体积用量比为 5 ： 4-6 ： 2-5 ： 5-8。 0012 步骤 1.2 所述的固定相流速为 1520mL/min。 0013 步骤 1.2 所述的流动相流速为 23mL/min。 0014 步骤 1.2 所述的主机转速为 7001000 转 / 分钟。 0015 步骤 1.2 所述的流出液收集为每 48mL 为一个馏分。 0016 溶剂体系筛选 ： 根据待分离物质的理化性质， 如溶解度、 极性、 酸碱度等初步选择 溶剂体系， 体系选定之后通过比较不同溶剂体系中目标组分在溶剂上下相间的比。
18、值 （高效 液相色谱法） ， 得出分配系数 K 值， 再根据 K 值大小对溶剂体系进行微调， 直至得到合适的分 说 明 书 CN 103724389 A 4 3/4 页 5 配系数 K 值为止 （K 介于 0.52 之间） ， 至此得到适宜的溶剂体系。本发明所述的溶剂体系 是石油醚、 乙酸乙酯、 甲醇和水， 其体积用量比为 5: 3-7: 1-6 : 4-9。 0017 将上述溶剂体系配置于分液漏斗中充分振摇后静置分层， 取上层溶液为固定相， 下层溶液为流动相， 超声脱气 15-30min ； 待溶液冷却至室温后， 固定相以 1020mL/min 泵入 主机， 待主机充满后， 以 1.5mL3。
19、mL/min 泵流动相， 同时开启主机转速 6001000 转 / 分钟， 体系平衡后进样 ； 含灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的灵芝酸馏分溶解在流动相中， 并通过六通阀进 样 ； 流出液由自动部分收集器收集， 每 410mL 收集一个馏分， 高效液相色谱法测定各馏分 成分， 按不同的成分分别收集、 浓缩、 干燥。 0018 本发明的优点在于 ： 1. 采用大孔树脂层析法代替传统的硅胶柱层析法， 洗脱溶剂 由乙醇 - 水代替原来的甲醇、 乙酸乙酯、 氯仿等有机溶剂， 且乙醇可回收利用， 即节约了试 验成本， 又是消除了有机溶剂等带来的环境污染等问题 ； 同时大孔树脂还具有便宜易得、 处 理量大、。
20、 可重复利用等优点， 这些均有利于灵芝酸纯化工艺向产业化转变。2. 高速逆流色 谱是一种液液分离的过程， 它无需固体作固定相， 不存在固体对样品成分的吸附、 沾污、 变 性和失活等现象， 因此它具有快速、 高效、 操作简便、 分离量大等优点 ； 且相较于液相制备色 谱， 它具有更高的回收率， 几乎可以将待分离样品 100% 回收， 一次逆流色谱分离得到的纯 度较低的样品， 可以回收作为下一次逆流分离的样品。这些均可提高灵芝酸的分离纯化效 率及其半自动化生产。 附图说明 0019 图 1 为实施例 1 的高速逆流分离谱图 图 2 为实施例 2 的高速逆流分离谱图 图 3 为实施例 3 的高速逆流。
21、分离谱图。 具体实施方式 0020 为更好地理解本发明， 下面通过实施例对本发明作进一步说明， 但所举的实施例 不以任何形式限制本发明。 0021 实施例 1 ： 1.1 大孔树脂分离 ： 将灵芝醇提物用 40% 乙醇溶解， 过滤后上大孔树脂 HZ-816 柱分离， 水、 30%、 50%、 70%、 90% 乙醇依次进行梯度洗脱， 每 1/6 柱体积收集为一个馏分， 馏分由液相 分析检测其成分， 合并其中主要含有灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩得到以灵芝酸 C1 和 灵芝酸 F 为主的混合物， 高效液相色谱仪分析检测其纯度为 39.5%。 0022 1.2 高速逆流分离 ： 采用 。
22、TBE-300B 半制备型高速逆流色谱仪。按溶剂体系石油 醚 : 乙酸乙酯 : 甲醇 : 水 =5:5:3.5:6.5 配制成溶液于分液漏斗中， 充分摇匀后静置分层， 分取上、 下层溶液并超声脱气 ； 以上相为固定相， 下相为流动相， 固定相先以 15mL/min 泵入 主机， 待主机充满固定相 （主机管路流出口有固定相流出） 之后， 以 3mL/min 泵入流动相， 同 时开启主机转速 900 转 / 分 ； 待整个体系建立动态平衡 （主机管路流出口开始有流动相流 出） 后， 将 200mg 由步骤 1.1 制得的灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的混合物溶解在 20mL 流动相中， 由进样阀进样。
23、， 自动部分馏分收集器收集分离液， 每 8mL 收集为一个馏分， HPLC 分析检测分 离情况， 分别收集合并灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩并干燥得纯度 90.6% 的灵芝酸 C1 说 明 书 CN 103724389 A 5 4/4 页 6 和纯度 91.4% 灵芝酸 F。高速逆流分离谱图见附图 1， 灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 出峰时间分别 为 108min 和 137min， 分离效果较好。 0023 实施例 2 2.1 大孔树脂分离 ： 将灵芝醇提物用 45% 乙醇溶解， 过滤后上大孔树脂 HZ-818 柱分离， 水、 30%、 45%、 60%、 75%、 90% 乙醇依。
24、次进行梯度洗脱， 每 1/5 柱体积收集为一个馏分， 馏分由 HPLC分析检测其成分， 合并其中含有灵芝酸C1和灵芝酸F的馏分， 浓缩得到灵芝酸C1和灵 芝酸 F 部位， 纯度为 42.8%。 0024 2.2 高速逆流分离 ： 采用 TBE-300B 半制备型高速逆流色谱仪。按溶剂体系石油 醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水 =5:5:3:7 配制溶液于分液漏斗中， 充分摇匀后静置分层， 分取上、 下层溶液并超声脱气 ； 以上相为固定相， 下相为流动相， 固定相先以 20mL/min 泵入主机， 待 主机充满固定相之后， 以 3mL/min 泵入流动相， 同时开启主机转速 950 转 / 分。
25、 ； 待整个体系 建立动态平衡后， 将 160mg 由步骤 1.1 制得的灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的混合物溶解在 20mL 下相中， 由进样阀进样， 自动部分馏分收集器收集分离液， 每 6mL 收集为一个馏分， HPLC 分 析检测分离情况， 分别收集合并灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩并干燥得纯度 92.3% 的 灵芝酸 C1 和纯度 93.7% 灵芝酸 F。高速逆流分离谱图见附图 2， 灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 出峰 时间分别为 150min 和 197min， 分离效果较好。 0025 实施例 3 3.1 大孔树脂分离 ： 将灵芝醇提物用 50% 乙醇溶解， 过滤后上大孔。
26、树脂 HZ-816 柱分离， 水、 30%、 45%、 60%、 75%、 90% 乙醇依次进行梯度洗脱， 每 1/8 柱体积收集为一个馏分， 馏分由 液相分析检测其成分， 合并其中含有灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩得到灵芝酸 C1 和灵 芝酸 F 混合物， 纯度 47.7%。 0026 3.2 高速逆流分离 ： 采用 TBE-300B 半制备型高速逆流色谱仪。按溶剂体系石油 醚 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水 =5:5:2.5:7.5 配制溶液于分液漏斗中， 充分摇匀后静置分层， 分 取上、 下层溶液并超声脱气 ； 以上相为固定相， 下相为流动相， 固定相先以 20mL/min 。
27、泵入主 机， 待主机充满固定相之后， 以 3mL/min 泵入流动相， 同时开启主机转速 950 转 / 分 ； 待整 个体系建立动态平衡后， 将 120mg 由步骤 3.1 制得的灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的混合物溶解 在 20mL 下相中， 由进样阀进样， 自动部分馏分收集器收集分离液， 每 4mL 收集为一个馏分， HPLC 分析检测分离情况， 分别收集合并灵芝酸 C1 和灵芝酸 F 的馏分， 浓缩并干燥得纯度 95.1% 的灵芝酸 C1 和纯度 95.5% 灵芝酸 F。高速逆流分离谱图见附图 3， 灵芝酸 C1 和灵芝 酸 F 出峰时间分别为 188min 和 251min， 分离效果好。 说 明 书 CN 103724389 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103724389 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103724389 A 8 。