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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511027421.4 (22)申请日 2015.12.31 C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 杭州迪安医学检验中心有限公司 地址 310030 浙江省杭州市西湖区城北商贸 园 33 幢 (72)发明人 任绪义 张峰 俞岳峰 吕江峰 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 (54) 发明名称 一种外周血游离 DNA 靶向富集的方法及试剂 盒 (57) 摘要 本发明提供了一种外周血游离 DNA 靶向富集 的方法， 属于分子检。
2、测技术领域。 该方法主要根据 外周血游离 DNA 中不同来源的 DNA 片段大小的差 异选择性去除大片段 DNA 从而达到靶向富集小片 段 DNA 的目的。通过本发明所得到的靶向富集后 的外周血游离 DNA 可广泛应用于下游诸多分子诊 断， 如基于检测母体血浆中胎儿游离 DNA 的无创 性产前分子诊断 (NITP) 等。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图1页 CN 105441426 A 2016.03.30 CN 105441426 A 1.一种外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 包括。
3、如下步骤: (1)根据目标DNA设计杂交引物， 所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA， 所述的杂交 引物包括上游杂交引物对和下游杂交引物对， 所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分 别分布在靶基因扩增片段外侧两端， 所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5 端均标记 生物素； (2)提取外周血游离DNA； (3)将步骤(1)设计的杂交引物与步骤(2)提取的外周血游离DNA混合， 加入杂交试剂， 使杂交引物与目标DNA结合， 得到混合物； (4)将亲和素标记的磁珠与步骤(3)得到的混合物混合均匀， 离心， 弃沉淀， 上清即为靶 向富集后的外周血游离DNA。 2.根据权利要求1所述的外周血游离DN。
4、A靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 使 富集引物与目标DNA结合的方法为： 先在9095条件下加热510min， 再在1530条 件下静置510min。 3.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所 述的杂交试剂为： Tris-Acetat、 MgAc2。 4.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 杂 交引物与目标DNA结合的体系中， 杂交引物含量分别为0.050.2 mol/L。 5.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 杂 交引物与目标DN。
5、A结合的体系中， Tris-Acetat含量为2040mM， MgAc2含量为24mM。 6.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所 述的上游引物对和下游引物对的分别长度为1539bp， 所述的上游引物对和下游引物对在 50mMNa+条件下Tm均不小于50。 7.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所 述的上游引物对间相距不超过20bp， 所述的下游引物对间相距不超过20bp。 8.外周血游离DNA靶向富集与检测试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包括： 杂交试剂： 200mMTris-Acetat、 。
6、20mMMgAc2； 亲和素标记的磁珠； 杂交引物： 所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA， 所述的杂交引物包括上游杂交引 物对和下游杂交引物对， 所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分别分布在靶基因扩增 片段外侧两端， 所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5 端均标记生物素， 所述的上游 引物对和下游引物对的分别长度为1539bp， 所述的上游引物对和下游引物对在50mMNa+ 条件下Tm均不小于50， 所述的上游引物对间相距不超过20bp， 所述的下游引物对间相距 不超过20bp。 9.根据权利要求8所述的外周血游离DNA靶向富集的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包 括检测靶基因的引物和。
7、检测靶基因的探针。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441426 A 2 一种外周血游离DNA靶向富集的方法及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于DNA分子检测技术领域， 具体涉及一种外周血游离DNA靶向富集的方法 及试剂盒。 背景技术 0002 自从Mander和Metais于1948年发现人体外周血中存在着细胞外游离DNA和RNA后， 游离核酸的检测作为一种有效的微创性诊疗手段广泛应用于临床的各个方面， 如肿瘤的发 生发展、 妊娠相关性疾病、 自身免疫病、 移植排斥反应、 创伤急救医学等， 其检测在疾病的早 期诊断、 分期、 治疗检测、 预后判断以及产前分子诊断等方面有着重要意义。
8、。 0003 研究表明， 孕妇血浆中存在着游离的胎儿DNA(Cell-freefetalDNA， cffDNA)， 且 从孕妇怀孕第7周即可检测到， 在最初3个月内随着孕龄的增加， 游离胎儿DNA也显著增加， 平均每周增加21， 在随后的3个月内进入平台期， 分娩前又显著增加， 分娩后迅速消失。 的 这一特点为通过分子诊断技术进行早期无创产前诊断提供了可能。 然而， 母体血浆中 cffDNA含量极低， 仅占血浆总游离DNA的419， 强大的母体血浆游离DNA背景大大限制 了利用其检测胎儿遗传性疾病。 0004 研究表明， 母体来源的DNA比胎儿DNA长， 胎儿DNA绝大部分1kb。 因此， 通。
9、过选择性去除母体血浆中母体来源的大片段游离DNA， 从而提高母体 血浆中胎儿游离DNA比例， 降低检测过程中母源cffDNA背景的方法可提高利用cffDNA进行 无创产前诊断的特异性和敏感度， 扩展其适用范围， 促进该诊断技术的发展和在临床上的 推广应用。 现有技术富集孕妇血浆中存在着游离的胎儿DNA的方法通常是采用化学试剂提 取的方法， 如申请号为200610013153.5的中国专利， 但是这种方法富集效率不高， 影响检测 效率。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是， 提供一种外周血游离DNA靶向富集方法， 提高外周血 游离DNA富集的效率。 0006 本发明还要解决的技术问题是。
10、， 提供一种外周血游离DNA靶向富集与检测试剂盒。 0007 一种外周血游离DNA靶向富集的方法， 包括如下步骤: 0008 (1)根据目标DNA设计杂交引物， 所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA， 所述的 杂交引物包括上游杂交引物对和下游杂交引物对， 所述的上游杂交引物对和下游杂交引物 对分别分布在靶基因扩增片段外侧两端， 所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5 端均 标记生物素； 0009 (2)提取外周血游离DNA； 0010 (3)将步骤(1)设计的杂交引物与步骤(2)提取的外周血游离DNA混合， 加入杂交试 剂， 使杂交引物与目标DNA结合， 得到混合物； 0011 (4)将亲和。
11、素标记的磁珠与步骤(3)得到的混合物混合均匀， 离心， 弃沉淀， 上清即 说明书 1/4 页 3 CN 105441426 A 3 为靶向富集后的外周血游离DNA。 0012 如图1所示， 杂交引物与外周血游离DNA中与母体来源的大片段DNA结合， 上游杂交 引物和下游杂交引物不能与游离的胎儿DNA结合， 由于在杂交引物的5 端均标记生物素， 生 物素与亲和素标记的磁珠结合， 从而使与靶DNA相似的母体DNA沉淀， 达到富集目标DNA的目 的。 0013 步骤(3)中， 使富集引物与目标DNA结合的方法为： 先在9095条件下加热5 10min， 再在1530条件下静置510min。 0014。
12、 步骤(3)中， 所述的杂交试剂为： Tris-Acetat、 MgAc2。 0015 步骤(3)中， 杂交引物与目标DNA结合的体系中， 杂交引物含量分别为0.050.2 mol/L。 0016 步骤(3)中， 杂交引物与目标DNA结合的体系中， Tris-Acetat含量为2040mM， MgAc2含量为24mM。 0017 步骤(1)中， 所述的上游引物对和下游引物对的分别长度为1539bp， 所述的上游 引物对和下游引物对在50mMNa+条件下Tm均不小于50。 0018 步骤(1)中， 所述的上游引物对间相距不超过20bp， 所述的下游引物对间相距不超 过20bp。 0019 外周血。
13、游离DNA靶向富集与检测试剂盒， 该试剂盒包括： 0020 杂交试剂： 200mMTris-Acetat、 20mMMgAc2； 0021 亲和素标记的磁珠； 0022 杂交引物： 所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA， 所述的杂交引物包括上游杂 交引物对和下游杂交引物对， 所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分别分布在靶基因 扩增片段外侧两端， 所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5 端均标记生物素， 所述的 上游引物对和下游引物对的分别长度为1539bp， 所述的上游引物对和下游引物对在50mM Na+条件下Tm均不小于50， 所述的上游引物对间相距不超过20bp， 所述的下游引物对间相。
14、 距不超过20bp。 0023 作为优选， 该试剂盒包括检测靶基因的引物和检测靶基因的探针。 所述的靶基因 引物和靶基因探针是用于检测目标DNA的引物和探针。 0024 有益效果： 本发明的试剂及其方法通过靶向去除血浆游离DNA中大片段游离DNA， 从而达到靶向富集小片段目标游离DNA的目的， 可显著提高外周血游离DNA中小片段的比 例。 通过本发明中试剂及方法靶向富集后所得到的ccfDNA可广泛应用于下游基于检测母体 血浆中胎儿游离DNA的无创性产前分子诊断(NITP)检测等。 附图说明 0025 图1本发明引物设计原理示意图。 具体实施方式 0026 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。
15、。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 说明书 2/4 页 4 CN 105441426 A 4 0027 实施例1： 试剂的制备方法。 0028 (1)杂交试剂： 200mMTris-Acetat(Tris-base购于美国Sigma公司， 无水乙酸购于 杭州化学试剂有限公司)， 20mMMgAc2(醋酸镁购于上海试四赫维化工有限公司)； 0029 (2)亲和素标记的磁珠(购于GEhealthcareBioscienceAB)； 0030 (3)21号染色体靶基因扩增引物DP21-1、 DP21-2。
16、， 探针DP21-3， 杂交引物HP21-1、 HP21-2、 HP21-3、 HP21-4， Y染色体靶基因扩增引物SRYF、 SRYR， 探针SRYP由上海英潍捷基生 物技术有限公司合成。 0031 引物的核苷酸序列如下所示： 0032 DP21-1:5 -CCCTGACAAACTGAAGGTCC-3 0033 DP21-2:5 -GTGGTGACGAAAGCAGTTGCCA-3 0034 DP21-3:5 -FAM-CGCGTCAGTACTTATGGCGCDabcyl-3 0035 HP21-1:5 -TCACATATCTGCAAGTTTTTATTGTTTAG-3 0036 HP21-2。
17、:5 -ACTCTATACAACTGGCCTATGAATTG-3 0037 HP21-3:5 -GCCCATTTTAAACGGAAACAATC-3 0038 HP21-4:5 -CCAAGTAATTCTCTCCATTGTAAACA-3 0039 SRYF:5 -ATACAAATTTCCTGAATAGTTGCTC-3 0040 SRYR： 5 -ACAATTCACTAGTTTAAAATGAGCA-3 0041 SRYP:5 -HEX-ACTTAGTGTAGAATGAAGAC-Dabcyl-3 0042 实施例2： 检测方法。 0043 仪器： Bio-RadS1000PCR仪， Vortex-G。
18、ENIE2T漩涡振荡器， BECKMANCOUTER Microfuge18Centifuge离心机， AppliedbiosystemsQuantStudio3D数字PCR系统。 0044 选取2015年10月到2015年12月孕中期产妇10例， 分别取外周血6ml， 采用Qiagen外 周血游离DNA提取试剂盒提取游离DNA， 然后按下列步骤操作： 0045 (1)血浆游离DNA靶向捕获： 将10HB5 L， HP21-1(10 M)0.5 L， HP21-2(10 M)0.5 L， HP21-3(10 M)0.5 L， HP21-4(10 M)0.5 L， ccfDNA43 L混合， 9。
19、55min， 室温静置5min 后备用； 0046 (2)亲和素标记的磁珠(sepharoebeads)洗涤， 取30 Lsepharoebeads溶液， 加 200 LddH2O， 振荡混匀， 14000rpm离心3min， 去上清留沉淀， 再加200 LddH2O， 振荡混匀， 14000rpm离心3min， 去上清留沉淀备用； 0047 (3)通过选择性去除靶向捕获游离DNA富集目标DNA： 将从步骤(1)获取的混合液加 入经步骤(2)处理后的sepharoebeads沉淀中， 悬浮沉淀， Vertex振荡混匀10min， 14000rpm 离心3min， 取上清弃沉淀， 上清即为靶向富。
20、集后的目标游离DNA。 0048 (4)数字PCR， 使用AppliedbiosystemsQuantStudio3D数字PCR系统扩增21号染 色体目标基因以及SRY目标基因片段， 比较富集前以及富集后胎儿DNA在孕妇血浆中的相对 比例。 0049 其中， 以富集前DNA为模板的PCR扩增体系为： 2quantstudio3Dmastermix 7.5 L， DP21-1： 0.135 L(100 M)， DP21-2： 0.135 L(100 M)， DP21-3： 0.6 L(10 M)， SRYF： 0.135 L(100 M)， SRYR： 0.135 L(100 M)， SRYP：。
21、 0.45 L(10 M)， Template5.08 L， 加无菌水 至15 L； 以富集后DNA为模板的PCR扩增体系为： 2quantstudio3Dmastermix7.5 L， 说明书 3/4 页 5 CN 105441426 A 5 DP21-1： 0.135 L(100 M)， DP21-2： 0.135 L(100 M)， DP21-3： 0.6 L(10 M)， SRYF： 0.135 L (100 M)， SRYR： 0.135 L(100 M)， SRYP： 0.45 L(10 M)， Template5.91 L。 PCR扩增条件为： 943min； 9425s， 55。
22、30s， 7220s， 40个循环； 723min。 扩增完成后采用Applied biosystemsQuantStudio3D数字PCR系统读取并分析相关数据(表1)。 0050 表110例孕妇外周血游离DNA富集前与富集后21染色体目标基因与SRY基因数量 0051 0052 10例样本中， 1、 3、 6、 8含SRY基因片段， 其余6例无SRY基因片段， 1、 3、 6、 8采用本发 明试剂及方法进行靶向富集后其SRY基因相对比例分别从10.7、 10.2、 3.7、 7.0提 高到了18、 21.6、 9.9、 15.3。 说明书 4/4 页 6 CN 105441426 A 6 0001 0002 序列表 1/5 页 7 CN 105441426 A 7 0003 序列表 2/5 页 8 CN 105441426 A 8 0004 序列表 3/5 页 9 CN 105441426 A 9 0005 序列表 4/5 页 10 CN 105441426 A 10 序列表 5/5 页 11 CN 105441426 A 11 图1 说明书附图 1/1 页 12 CN 105441426 A 12 。