一株粘质沙雷氏菌及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610007451.7 (22)申请日 2016.01.07 CCTCC NO ： M 2015732 2015.12.09 C12N 1/20(2006.01) C12N 9/08(2006.01) C12R 1/43(2006.01) (71)申请人 福建省农业科学院土壤肥料研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇埔 党村 (72)发明人 陈济琛 林新坚 贾宪波 蔡海松 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一株粘质沙雷氏菌及其应用 (57) 摘要 本发。

2、明提供一株粘质沙雷氏菌及其应用， 属 于生物工程领域。本发明提供了一株粘质沙雷氏 菌， 保藏编号为 （CCTCC M 2015732） 该菌以蔗糖为 碳源促进产酶， 经液体发酵可得到高产量的过氧 化氢酶， 酶活高达 32752U/mLU/ml。本发明过氧化 氢酶制剂制备简单、 酶活性高， 造价低廉， 该酶制 剂在纺织、 造纸等领域有良好的应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表4页 CN 105441367 A 2016.03.30 CN 105441367 A 1.一株粘质沙雷氏菌。

3、， 其特征在于： 所述菌株为粘质沙雷氏菌 （Serratiamarcescens） KAT-1， 该菌株已于2015年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCNO： M2015732。 2.利用权利要求1所述粘质沙雷氏菌发酵生产过氧化氢酶的方法， 其特征在于： 用所述 粘质沙雷氏菌KAT-1作为出发菌株， 经种子液培养和以蔗糖为碳源发酵生产过氧化氢酶。 3.根据权利要求2所述的粘质沙雷氏菌发酵生产过氧化氢酶的方法， 其特征在于： 具体 工艺为： （1） 种子液培养： 种子液制备： 从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50ml种子液培养基中， 37培养 12h， 转速为180r。

4、/min， 获得种子液； （2） 发酵产酶： 发酵产酶： 取步骤 （1） 种子液以2%接种量接种液体产酶培养基， 发酵温度为3035， 转 速为180220r/min， 发酵时间为3660h。 4.根据权利要求3所述的粘质沙雷氏菌发酵生产过氧化氢酶的方法， 其特征在于： 所述 的种子液培养基： 大豆蛋白胨10g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， pH为7.0； 产酶培养基： 大豆蛋 白胨1040g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， 蔗糖3090g/L， pH为7.0。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441367 A 2 一株粘质沙雷氏菌及其应用 技术领域 0001。

5、 本发明提供一株粘质沙雷氏菌及其应用， 属于生物工程领域。 背景技术 0002 过氧化氢是一种强氧化剂， 广泛应用与工业、 食品和医疗领域的漂白和消毒， 但是 其残留对于严重影响生产工艺和身体健康。 过氧化氢酶可以特异性的分解过氧化氢为无毒 的水和氧气， 是一种高效环保的过氧化氢去除途径。 过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧 微生物中， 最初过氧化氢酶是从猪牛等动物肝脏中提取纯化的， 但该方法受限于原料有限、 成本高和工艺复杂， 相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、 活性高、 酶学性质丰 富、 成本低廉等诸多优点。 目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品， 国内有一些文献 及专利报道过。

6、氧化氢酶产酶菌株， 多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力 单位， 仅江南大学陈坚教授 （文献） 和江南大学专利CN101805709B报道菌株酶产量达到2 万个酶活左右。 本发明人发现一株高产过氧化氢酶的菌株， 且通过液体发酵得到过氧化氢 酶酶液， 该酶液可以高效分解过氧化氢。 基于以上发现提出了本发明。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一株过氧化氢酶高产菌株， 和以大豆蛋白胨为氮源， 蔗糖为 碳源发酵生产过氧化氢酶的工艺。 所产过氧化氢酶制剂活性高， 生产成本低廉， 适于纺织、 造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除。 0004 所述粘质沙雷氏菌 （Serratiamarces。

7、cens） KAT-1， 该菌株已于2015年12月9日保 存在中国典型培养物保藏中心， 地址为武汉大学， 保藏编号为CCTCCNO： M2015732。 0005 本发明的技术方案： 1、 菌株的筛选及鉴定 （1） 筛选： 挑去从土壤中分离纯化的细菌纯培养于液体种子培养基中震荡培养， 取100 微升发酵液加入100微升过氧化氢， 有大量气泡产生的菌株为产酶菌株。 0006 （2） 鉴定： 对该菌株16SrRNA进行PCR扩增与测序， NCBI数据库比对显示该菌为粘 质沙雷氏菌。 0007 （3） 菌株特征： 菌落为圆形突起， 乳白色； 及发酵液为淡黄色， 不产红色灵菌素。 光 镜下菌体为圆形。

8、。 0008 （4） 过氧化氢酶活性测性方法： 发酵液超声破碎直至澄清， 用pH7.0的PBS缓冲液稀 释适当倍数后备用。 过氧化氢酶酶活测定方法： 3.9ml反应液 （02MPBSpH7.0,20mMH2O2) 迅速加入0.1ml酶液中,在240nm波长下测定吸光度的变化， 每隔5s计数一次。 H2O2的摩尔消 光系数为43.6。 过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H2O2所用的酶量为1U。 0009 2、 应用菌株Kat-1发酵生产过氧化氢酶。 工艺如下： （1） 种子液制备： 种子培养基为： 大豆蛋白胨10g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， pH为7.0. 说明书 1/。

9、3 页 3 CN 105441367 A 3 种子液制备方法： 挑取一环菌株Kat-1的纯培养于50ml种子培养基中， 180r/min培养 12h即为种子液。 0010 （2） 发酵产酶： 产酶培养基： 大豆蛋白胨1040g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， 蔗糖3090g/L， pH为7.0。 0011 发酵产酶： 以2%接种量接种液体摇瓶培养基。 发酵温度为3035， 转速为180220 r/min， 。 0012 应用该菌株以上述工艺发酵发酵液最高过氧化氢酶酶活达32752U/mL。 0013 蔗糖和麦芽糖为碳源时该菌大量产生过氧化氢酶， 甘油、 乳糖和葡萄糖对该菌产 酶没有。

10、促进作用， 柠檬酸严重抑制菌体生长和产酶。 0014 本发明的有益效果： 本发明首先提供了一株高产过氧化氢酶菌株， 液体摇瓶培养 酶活达32752U/mL。 该菌生长速度快， 发酵时间短； 培养基成分简单， 以蔗糖为碳源的培养基 可以极大促进该菌株产酶， 发酵过程无需过氧化氢或乙醇等诱导， 工艺简单， 成本低廉。 应 用该菌株及配套工艺制备的过氧化氢酶可以应用于食品加工和造纸纺织等工业， 因此本发 明提供的菌种及工艺具有广泛的应用前景和明显的经济效益。 具体实施方式 0015 实施例1： 产酶菌株Kat-1的筛选及鉴定 挑取一环各菌株纯培养分别转接于含有50ml前述液体种子培养基的三角瓶中， 。

11、取每个 菌株的发酵液200微升加入等体积过氧化氢观察产气泡情况。 有气泡产生者为过氧化氢酶 产酶菌株， 选择产气泡最剧烈的菌株Kat-1作为过氧化氢酶生产用菌。 菌株Kat-1菌落圆形， 乳白色， 100倍油镜下观察菌体为圆形。 将菌株Kat-1的发酵液冰浴超声破碎直至澄清， 破碎 条件为300W， 破碎2s停顿3s， 将破碎液用PBS缓冲液稀释20倍测量酶活。 过氧化氢酶活力测 定方法为： 3.9ml反应液 （0.2MPBSpH7.0、 20mMH2O2)迅速加入0.1ml酶液中， 在240nm波长 下测定吸光度的变化， 每隔5s计数一次。 H2O2的摩尔消光系数为43.6。 过氧化氢酶酶活。

12、的定 义为酶分钟消耗1微摩尔H2O2所用的酶量为1U。 测得此时过氧化氢酶活性为2230U/ml。 取3ml 菌液用细菌基因组提取试剂盒提取该菌基因组， 用细菌16SrDNA通用引物 （27F： 5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 和1492R： 5 -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ） PCR扩增该菌的16S rDNA， 扩增程序为94变性1min， 55退火1min， 72延伸2min， 扩增循环数为35个循环。 PCR扩增产物送生物公司测序。 在NCBI进行序列比对后确认该菌为粘质沙雷氏菌。 0016 实施例2： 菌株发酵生产过氧化氢酶 从斜面上挑取一。

13、环Kat-1纯培养于盛有50ml种子液体培养基的250ml三角瓶中， 37摇 床上培养12h， 摇床转速为180r/min。 以2%的接种量转接至产酶培养基， 250ml三角瓶的装液 量为50ml产酶发酵培养基， 培养条件为35， 摇床转速180r/min， 培养24小时。 取出发酵液 冰浴超声破碎直至澄清， 破碎条件为300W， 破碎2s停顿3s。 所获澄清液体即为过氧化氢酶 液， 此时酶液活性达18660U/mL。 0017 所述的种子液培养基： 大豆蛋白胨10g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， pH为7.0； 产酶 培养基： 大豆蛋白胨30g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl。

14、1g/L， 蔗糖60g/L， pH为7.0。 0018 实施例3： 菌株发酵生产过氧化氢酶 从斜面上挑取一环Kat-1纯培养于盛有50ml种子液体培养基的250ml三角瓶中， 37摇 说明书 2/3 页 4 CN 105441367 A 4 床上培养12h， 摇床转速为180r/min。 以2%的接种量转接至液体发酵培养基， 250ml三角瓶的 装液量为50ml产酶发酵培养基， 培养条件为32， 摇床转速180r/min， 培养48小时。 取出发 酵液冰浴超声破碎直至澄清， 破碎条件为300W， 破碎2s停顿3s。 所获澄清液体即为过氧化氢 酶液， 此时酶液活性达32752U/mL。 0019。

15、 所述的种子液培养基： 大豆蛋白胨10g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， pH为7.0； 产酶 培养基： 大豆蛋白胨40g/L， 牛肉膏2g/L， NaCl1g/L， 蔗糖90g/L， pH为7.0。 0020 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰， 皆应属本发明的涵盖范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105441367 A 5 SEQUENCELISTING 福建省农业科学院土壤肥料研究所 一株粘质沙雷氏菌及其应用 2 3 PatentInversion3.3 1 20 DNA 人工序列 1 agagtttgatcctggctcag 。

16、20 2 22 DNA 人工序列 2 tacggctaccttgttacgactt 22 3 1410 DNA 人工序列 序列表 1/4 页 6 CN 105441367 A 6 3 tgcagtcgagcggtagcacaggggagcttgctccctgggtgacgagcggcggacgggtga 60 gtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaatacc 120 gcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgccca 180 gatgggattagcta。

17、gtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtct 240 gagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagca 300 gtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaag 360 gccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgaacttaatacgttcatc 420 aattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcgg。

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19、agcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttg 780 tgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggc 840 cgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtt 900 taattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagaga 960 tgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcat。

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