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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510984118.7 (22)申请日 2015.12.24 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 李童斐 地址 442000 湖北省十堰市茅箭区人民南路 30 号 申请人 湖北医药学院 (72)发明人 李童斐 胡清华 朱莉萍 (54) 发明名称 一种简便快速诱导纤毛分化的气道上皮细胞 培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种简便快速诱导纤毛分化的 气道上皮细胞培养方法， 该方法包括从哺乳动物 体内分离气道组织、 气道组织漂洗、 气道组织纵向 剪切分离成为气道环、 环状气道组织平铺于培养 器皿中、 培养器皿置于 。
2、37 摄氏度培养箱中培养。 本发明采用的技术方法简便快捷， 简化了操作流 程， 缩短了培养周期， 同时保证了培养的细胞均能 够大量分化纤毛， 且一次培养过程可以得到大量 的细胞供研究或其它所需。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 105441379 A 2016.03.30 CN 105441379 A 1/1 页 2 1.一种简便快速诱导纤毛分化的气道上皮细胞培养方法， 包括以下步骤 A、 在无菌常温环境下从哺乳动物体内分离气道组织 ； B、 将气道组织置于含有常温磷酸盐缓冲液的培养皿中漂洗 ； C。
3、、 将漂洗后的气道组织横放并纵向分离成为多个独立的环状气道组织 ； D、 将分离的独立环状气道组织平铺于培养器皿中， 并加入细胞培养基 ； E、 将培养器皿置于 37 摄氏度二氧化碳培养箱中培养 1 至 2 天后取出即得。 2.如权利要求 1 所述的一种简便快速诱导纤毛分化的气道上皮细胞培养方法， 其特 征在于 ： 在将气道组织冲洗并分离成独立环状气道组织的过程中， 气道组织用常温磷酸盐 缓冲液漂洗至气道腔内无粘液及其它杂质， 将气道横向平放在装有磷酸盐缓冲液的培养皿 中， 并使用灭菌后的手术剪将气道纵向剪切分离成为多个独立的环状气道组织， 剪切分离 后的环状气道组织厚度以 1 毫米为宜。 3。
4、.如权利要求 1 所述的一种简便快速诱导纤毛分化的气道上皮细胞培养方法， 其特征 在于 ： 使用尖镊将分离后的环状气道组织小心夹起， 并保证不损伤气道环的内侧， 将环状气 道横向平铺于 6 孔板或其它培养器皿中， 其中每一个分离的独立环状气道组织可种植在一 个培养介质中， 也可将多个环状气道组织共同放置于一个培养介质中加快细胞在一个培养 介质中生长汇集速度， 同时从孔的周边加入 500l 细胞培养基以保证每一个环状气道组 织不至于悬浮起来且又能够被完全浸没在细胞培养基中， 显微镜下放大 400 倍观察可看到 环状组织内侧有大量纤毛节律性摆动， 将培养器皿放置于 37 摄氏度二氧化碳培养箱中培 。
5、养， 24 至 48 小时后取出。 权 利 要 求 书 CN 105441379 A 2 1/3 页 3 一种简便快速诱导纤毛分化的气道上皮细胞培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种气道上皮细胞培养方法， 具体的说是涉及一种采用纵切气道将其 分离成为独立的环状气道组织从而进行简便快速培养， 且能够诱导培养的上皮细胞分化纤 毛的一种气道上皮细胞培养方法。 背景技术 0002 目前， 气道上皮细胞的培养方法主要有两大类， 或者采用特定酶消化法， 或者采用 气道组织剪碎贴块法。 0003 特定酶消化法的主要原理是将哺乳动物气道分离后， 采用型蛋白酶灌注于哺 乳动物气道内， 利用型蛋白酶对气道上。
6、皮细胞的特异性消化作用， 37 摄氏度消化 2 小 时或 4 摄氏度过夜消化 24 小时， 将位于气道内表面的上皮细胞消化下来， 再将消化下来的 上皮细胞重悬浮于培养基中待其贴壁后进行培养。 使用这种技术时， 主要有两大缺点， 型蛋白酶对气道上皮细胞的功能会有一定的影响， 最主要的是导致消化下来的上皮细胞不 具有分化纤毛的能力， 这样培养出来的细胞分化功能不好， 不适合进行纤毛运动功能的研 究， 另一缺点是酶消化往往要采用 4过夜的方式， 且细胞重悬浮后培养时间也较长， 有时 上皮细胞贴壁少或不能贴壁， 导致操作时间长， 且细胞培养周期长， 不利于研究。 0004 而气道组织剪碎贴块法是将哺乳。
7、动物气道分离后， 使用手术镊及手术刀在显微镜 操作下将上皮层从气道内侧表面剥离下来， 再用手术剪剪碎， 将剪碎的组织贴于培养器皿 的壁上， 加入培养基， 等待细胞从组织边缘爬出。 该技术在使用手术镊及手术刀显微操作从 哺乳动物尤其是小的哺乳动物气道上剥离上皮层时非常难， 且整个操作流程耗费了大量时 间， 不仅如此， 被剪碎的上皮层组织也往往失去了活性， 以至于细胞需要 3 至 5 天爬出或细 胞不易爬出或爬出细胞少或爬出的细胞不具备纤毛分化功能。 发明内容 0005 针对上述方法中出现的不足， 本发明的目的是在于克服上述技术方法中存在的不 足而提出解决的办法， 以消除气道上皮细胞培养周期长， 。
8、操作过程复杂， 采用工具多， 一次 培养过程产出的细胞量少， 尤其是消除培养的上皮细胞分化功能不佳导致气道上皮细胞纤 毛摆动少或无纤毛摆动的问题， 提供一种简便快速能够诱导纤毛分化的气道上皮细胞培养 的方法。 为解决上述技术问题， 本发明是通过以下技术方案实现的 ： A、 将哺乳动物气道组织于无菌环境常温条件下从哺乳动物体内分离。 0006 B、 将分离出的气道组织置于含有常温磷酸盐缓冲液的培养皿中漂洗， 漂洗至气道 腔内无分泌的粘液以及其它杂质。 0007 C、 漂洗后将气道横向平放， 使用手术剪或手术刀将气道纵向剪切成为多个独立的 气道环状组织， 剪切分离后的环状气道组织厚度以 1 毫米为。
9、宜。 0008 D、 使用尖镊将环状气道组织小心横向平铺于 6 孔板或其它培养器皿中， 其中每一 说 明 书 CN 105441379 A 3 2/3 页 4 个分离的独立环状气道组织可种植在一个培养介质中， 也可将多个环状气道组织共同放 置于一个培养介质中加快细胞在一个培养介质中的生长汇集速度。同时从孔的周边加入 500l细胞培养基以保证其不至于悬浮起来且又能够被浸没在细胞培养基中。 在显微镜下 可观察到环状组织内侧大量纤毛的节律性摆动证明组织的活性较好。 0009 E、 将培养器皿放置于 37 摄氏度二氧化碳培养箱中培养， 2 天后取出即得， 在倒置 显微镜下放 400 倍可观察到大量多角。
10、形的气道上皮细胞从环状组织周围爬出， 且可以观察 到细胞表面有大量纤毛有节律的摆动。 0010 本发明整个过程均在常温无菌环境下操作， 所有工具及耗材均无菌或经过了灭菌 处理。 0011 与现有技术相比， 本发明的有益效果及优点在于 ： 技术过程简便快速， 分离气道组织过程需要的工具少， 同时保证了高质量的细胞培养。 0012 本方法操作过程短， 整个操作过程10到20分钟， 而以往的特定酶消化培养法需要 几个小时至 1 天不等， 以往的组织剪碎贴块法需要 1 至 3 小时。本方法培养气道上皮细胞 爬出的周期为 1 至 2 天， 而以往的方法气道上皮细胞爬出的时间至少需要 3 至 5 天。且本。
11、 方法可以将多个环状气道组织同时至于一个培养介质中， 加快气道上皮细胞的生长汇集速 度。 0013 另外本发明培养的上皮细胞具有很强的活性， 能够分化出大量的纤毛， 可短时间 内培养大量具有高度纤毛分化功能的细胞群。本培养方法分离一次哺乳动物气道， 可以分 离至少 6 个环状气道组织， 若将分离的环状气道组织至于不同的培养介质中， 一次可以培 养至少 6 个器皿的细胞以供对气道上皮纤毛功能的独立实验研究及其它所需。 附图说明 0014 图 1 是本发明的技术方法流程示意图。 0015 图 2 是本发明中分离的气道组织被纵切成多个独立环状气道组织的示意图放大 图。 0016 图 3 是本发明中纵。
12、切的环状气道组织放置于 6 孔板培养器皿中的示意图放大图。 具体实施方式 0017 下面结合附图与具体实施例对发明作进一步详细描述， 本发明并不局限于以下实 施例。 0018 实施例 1 ： A、 在无菌常温环境下， 将生长至 2 周年龄的 SPF 级 SD 大鼠进行吸入麻醉， 并使用手术 剪剪开 SD 大鼠的颈部皮肤， 并用手术镊撕开皮肤下的筋膜暴露出气道， 分离出一段气道组 织。 0019 B、 将分离的气道组织置于含有常温磷酸盐缓冲液的培养皿中漂洗至气道内不含 有粘液及其它杂质。 0020 C、 漂洗后的气道组织横放， 将其纵向切成 6 个独立的环状气道组织， 每个独立的 环状气道组织厚。
13、度约 1 毫米。 D、 用尖镊将分别将独立的环状组织小心夹起， 并注意不要损伤气道环的内侧， 将环状 说 明 书 CN 105441379 A 4 3/3 页 5 组织分别平铺于6孔板的6个孔中， 在此之前将6孔板中的1个孔铺好玻片， 气道环放好后， 在个孔内用移液器缓慢加入 500l 培养基进行培养。在倒置显微镜下放大 400 倍可观察 到环状组织内侧大量纤毛的节律性摆动。 0021 E、 将培养板放置在 37 摄氏度二氧化碳培养箱中， 48 小时后取出， 放置于倒置显微 镜下放大 400 倍进行观察， 每个孔内的环状组织内侧均可看到大量纤毛摆动， 且从环状组 织周围爬出多角形的气道上皮细胞。
14、， 细胞表面可观察到纤毛的摆动， 将步骤 D 中铺有玻片 的孔中的细胞固定后脱水处理并镀金， 置于扫描电子显微镜下可看到明显分化的细长状纤 毛及微绒毛。 0022 实施例 2 ： A、 在无菌常温环境下， 将生长至 2-5 周年龄的 SPF 级 C57 小鼠断头处死， 在无菌工作台 内使用手术剪打开 C57 小鼠胸腔， 并将气管、 主支气管及肺组织一并取出。 0023 B、 将取出的气管及主支气管与肺组织分离， 将气管及主支气管置于含有青霉素链 霉素的 37 摄氏度水浴后的磷酸盐缓冲液中漂洗干净。 0024 C、 使用手术剪将漂洗后的气道组织剪成 3 段独立的柱状气管， 并将 3 段柱状气管 。
15、横向放置， 使用手术刀将柱状气管组织纵向切成 15 个厚度为 1 毫米的气管环。 0025 D、 使用尖镊将15个环状气道组织共同横向放置于6孔板的同一个培养孔中， 15个 环状气道组织之间相互间隔2至5毫米， 或将其共同放置于同一培养瓶中， 用移液器缓慢多 次加入 2000l 细胞培养基， 保证所有的环状气道组织均浸没在培养基中且不悬浮起来。 0026 E、 将培养板放置于 37 摄氏度二氧化碳培养箱中， 1 天后取出， 放置于倒置显微镜 下于 200 倍放大观察， 视野内环状气道组织周围均爬出大量气道上皮细胞， 且多个环状气 道组织间的细胞生长至相互融合汇集在一起， 长满整个培养器皿， 长成一片由大量多角形 细胞组成的区域， 且可看到大量细胞表面均有纤毛节律性摆动。 说 明 书 CN 105441379 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 105441379 A 6 。