瓜类细菌性果斑病菌的PADLOCK探针及检测方法.pdf

本发明用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及其检测方法属于农作物防病治病及植物检疫范畴。用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列：P-a.a.c：CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCPIP2CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG。以此探针为基础结合Macroaary技术的检测方法具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为瓜类细菌性果斑病菌的检测提供了快速、灵敏、特异的技术方法。图为padlock探针检测瓜类细菌性果斑病菌的检测结果。

1、  用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列：
P-a.a.c：CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCP_IP₂CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG

2、  权利要求padlock探针检测方法，包括如下步骤：
(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用经地高辛标记的引物对连接产物进行扩增。利用2.5％琼脂糖凝胶电泳。(3)Macroaary多重检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。

瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及检测瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)的padlock探针及其检测方法，属于生物技术领域。适用于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
(二)背景技术
瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的毁灭性细菌病害，自1989年，美国佛罗里达洲、印第安纳洲及特拉华洲发生该病害以来，该病不断扩展蔓延至美国的15个洲。现主要分布在美国、澳大利亚、马利亚纳群岛、印度尼西亚、土耳其等国家(Langston et al，1999)。我国一些省份也有报道瓜类细菌性果斑病的发生和危害，给果农造成巨大损失。为了防止该病害危害和扩散蔓延，我国于2006年将其列入全国农业植物检疫性有害生物。
该病菌主要附着在种子和病株残体上越冬，种子带菌为主要侵染，病菌随风、雨水或灌溉侵入植株气孔或受伤部位。受害果实病菌在其受害部位大量繁殖扩散造成再侵染(Schaad N.W.et al，1978；Rane K.K.et al，1992)。在我国，瓜类细菌性果斑病对哈密瓜生产及相关产业构成极大的威胁。因此该病对我国哈密瓜产业的威胁不容忽视，需要我们尽快拿出综合防治方案，快速、准确地检测病原物是行之有效防治措施的基础和前提。
传统的检测技术包括利用半选择性培养基分离和鉴定病菌、免疫学检测方法、致病性测定及过敏反应测定、生理生化反应测试等。这些方法往往需耗费较长时间并且灵敏度和准确性不高，因此常规的检测方法难以适应检疫的需求。近年来，采用PCR扩增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、质粒DNA和rDNA转录间隔区(ITS)等进行病原菌鉴定、检测及病害诊断为国际上广泛使用。目前已经验证的传统PCR检测方法主要根据Walcott.R R.(2000)的报道，在瓜类细菌性果斑病菌(A.a.c)16SrRNA设计了特异性引物WFB1和WFB2，但是这对引物用于A.a.c的特异性不强，对类产碱假单孢杆菌和嗜酸菌属的几个种扩增结果均呈阳性。根据张祥林(2007)对A.a.c的16SrDNA序列设计的引物对BFB64/65，以此构建的PCR检测体系更灵敏、准确，对A.a.c的检测灵敏度可达50CFU/μL。Walcott.R R.(2000)在A.a.c16S-23S ITS序列设计了特异性引物(SEQID4)和(SEQID5)。Song W Y.(2003)的报道，将配制的系列10倍梯度菌悬液用特异引物对Aacf3/Aacr2和探针Aap2进行实时荧光PCR检测。谢关林等(2006)采用将免疫学和经典PCR结合的免疫捕获PCR(IC-PCR)技术对带菌种子进行检测。
Padlock探针(PLPs)是一种用于病原菌分子检测的新方法。Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针(图4-1)，包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端，这两端能够识别特定目标物的DNA序列(Nilsson et al，1994)，我们通常称之为T1端和T2端。在T1端和T2之间，存在着一段通用序列和一段特异序列，我们称之为P1、P2端和ZipCode。在进行反应时，首先将padlock探针和要检测的目标DNA进行连接，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的T1端和T2端通过和特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’端和3’端连成环状。由于TaqDNA连接酶的特性，只有DNA序列和探针的T1端和T2端完全互补时，探针才能形成环状，否则，探针以线性存在。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端T1端和T2端的引物对切除后的产物进行滚环扩增。然后将扩增后的产物与固定在膜上或者Microarray上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交(Shoemaker et al，1996)。通过膜上的地高辛标记信号或者Microarray上的荧光来判断检测样品中是否有特定的病原物。由于padlock探针可与Macroarray或者Microarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量(Hardenbol et al，2003)。目前，padlock检测探针因其灵敏度高、特异性强的优点多与基因芯片相结合应用于病毒性疾病分子的检测(Baner J etal，2007)和单核苷酸突变检测当中(Baner J et al，2003)。目前尚未有将padlock探针应用于植物病原菌实际检测的实例。
参考文献
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 Hardenbol，P.，Baner，J.，Jain，M.，Nilsson，M.，Namsaraev，E.A.，Karlin-Neumann，G.A.，Fakhrai-Rad，H.，Ronaghi，M.，Willis，T.D.，Landegren，U.，and Davis，R.W.2003.Multiplexedgenotyping with sequence-tagged molecular inversion probes.Nat Biotechnol 21：673-678.Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.，and Williams，P.M.1996.Real time quantitative PCR.Genome Res.6：986-994.
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(三)发明内容
技术问题
本发明的目的是解决现有技术中瓜类细菌性果斑病菌的padlock检测探针及其检测方法，意在避免常规的PCR检测方法易受检测样品杂质干扰、以及假阳性的现象。对瓜类细菌性果斑病菌进行检测，特异性强、灵敏度高。
技术方案
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提供快速、可靠、灵敏度高、特异性强的检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针以及检测方法。
实现上述目的的技术方案：
用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列：
P-a.a.c：CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCP_IP₂CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG
探针的靶标识别序列(加下划线的序列)取自待测病原菌16S-23S rDNA(ITS)区域特异的核酸序列。探针中间P_IP₂(CTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGT)为引物结合区。
Padlock探针是一种长寡核苷酸探针，其两端的序列可通过核酸间的互补与靶标DNA结合。通过和靶标DNA的杂交，padlock探针的两端在连接酶的作用下连成环状，具有非常高的特异性。Padlock探针可与Macroarray技术结合进行多重检测。
Padlock探针检测方法，包括如下步骤：
(1)探针的连接与外切酶处理。首先将padlock探针和待检测的目标DNA进行杂交，在TaqDNA连接酶的作用下，探针的两端通过与特定的检测靶标物的DNA序列互补而相结合，探针的5’末端和3’末端连成环状。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针。(2)探针的扩增。采用两条探针P-a.a.c经地高辛标记的引物对连接产物进行扩增。利用2.5％的琼脂糖凝胶电泳。(3)Macroaary检测。将扩增后的产物与固定在膜上的与探针上的ZipCode序列互补的探针(cZipcode探针)进行杂交。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。
有益效果采用上述技术方案，突出的技术进步在于：
(1)本发明设计了适用于瓜类细菌性果斑病菌检测的padlock探针。(2)本发明利用padlock探针结合Macroaary技术，实现了对瓜类细菌性果斑病菌的检测，检测方法可靠、灵敏度高、特异性强。(3)采用padlock探针作为分子检测工具，有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象。传统的基于PCR扩增的分子检测通常只能检测单种病原物，荧光定量PCR的出现在一定程度上解决了这一问题，通过在反应的体系中添加不同荧光染料，可以同时检测1种以上的病原物。但是由于荧光染料种类的限制和彼此之间的干扰，采用这种方法对多种病原物进行检测时候效果往往不好。采用padlock探针作为分子检测工具，结合Macroaary技术弥补了实时定量PCR检测因受到引物设计问题、荧光染料的种类和荧光定量PCR仪光源是单一光源等问题而不能同时检测非常多的病原物的不足。
(四)说明书附图
图1.Padlock探针的结构示意图及检测原理。
图2A.瓜类细菌性果斑病菌特异性验证结果。
M为DNA Maker DL2000，1～10为瓜类细菌性果斑病菌，11～21为其他细菌，22为阴性对照。
图2B.瓜类细菌性果斑病菌的灵敏度验证结果。
M为DNA Maker DL2000，1-6为病原菌DNA依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg7为阴性对照。分别以十倍梯度稀释的DNA为模板，利用padlock探针检测，最低可检测到1pg。
图3.Padlock探针结合Macroaary技术检测瓜类细菌性果斑病菌结果。cZipcontrol＝TATGGTCGGCAATTCCCTGC。
图4.利用padlock探针对市售哈密瓜种子的检测结果。
结果表明从市售6份的哈密瓜种子样品中共检测出4份带有瓜类细菌性果斑病菌。
(五)具体实施方式
实施例1：一种利用padlock探针的分子检测方法，用于检测瓜类细菌性果斑病菌。
用于检测瓜类细菌性果斑病菌的padlock探针序列：
P-a.a.c：CGGCACGGTGCAGTTTCCTGCTTTCCGCP_IP₂CCTTACGCTAGGTCGAGAGTATTTTTGTCACCGG
(1)连接反应液包括：20mM Tris-HCL，pH 9.0，25mM KCH₃COO，10mMMg(CH₃COO)₂，10mM DTT，1mM NAD，0.1％Triton X-100，2.4 U Taq DNA连接酶，1μl待测模板，100pm探针P-a.a.c。连接的反应程序为：95℃预变性5分钟；然后进入循环，95℃变性30秒，65℃连接5分钟，反应共进行20个循环；然后95℃灭活15分钟。采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶I和2个单位的核酸外切酶III，37℃反应2个小时，然后将反应后的产物95℃灭活3小时。
(2)采用引物P1-F(5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’)P2-R(5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’)对连接产物进行PCR扩增，反应液包括：0.5μMP 1-F和P2-R，4种dNTP各50μM，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，2.5μl 1％BSA，1.25单位Taq酶(TaKaRa)，3μl经核酸外切酶处理后的连接产物。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸7min。利用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行分析检测结果。
(3)Macroaary检测。将1μL cZipcode探针点于尼龙膜上，每条cZipcode探针重复4次，经紫外交联30s固定。将固定好的膜放入杂交管中，加入预杂交液(0.02％SDS、5×SSC、50％去离子甲酰胺、0.1％N-laurysarosine、50mmol·L^-1磷酸钠、pH 7.02％封闭剂)于杂交炉中42℃预杂交1h，弃预杂交液，将经地高辛标记的扩增产物沸水浴中变性10min，迅速移至冰上，5分钟后加入预杂交液中，42℃杂交过夜后，用大量2×SSC、0.1％SDS室温洗膜2次，每次5min，再用0.5×SSC、0.1％SDS于68℃洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加入洗涤液(0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1NaCl，pH 7.5、0.3％吐温)中洗膜2min，弃去，用封闭液(1％封闭剂、0.1mol·L^-1马来酸、0.15mol·L^-1NaCl，pH 7.5)封闭30min后，加入用封闭液稀释了5000倍的Anti-DIG-AP，轻摇30min。最后，将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜2次，每次15min，加入检测液(0.1mol·L^-1Tris-HCl、0.1mol·L^-1NaCl、pH 9.5)平衡3min，再加入NBT/BCIP溶液，黑暗中静止显色2h，待观察到理想的显色后，用无菌水浸泡10min终止反应，进行拍照。通过膜上的地高辛标记信号来判断检测样品中是否含有病原物。
实例1从市售的哈密瓜种子中检测瓜类细菌性果斑病菌
上述瓜类细菌性果斑病菌的padlock检测探针及检测方法检测市售的哈密瓜种子，包括：
1)参照Walcott(2000)的方法将市售的哈密瓜种子的悬浮液作为模板。
2)参照上述技术方案利用padlock检测探针P-a.a.c结合Macroaary检测样品。检测结果见图4。结果表明从市售6份的哈密瓜种子样品中共检测出4份带有瓜类细菌性果斑病菌。证明了上述技术方案能够应用于瓜类细菌性果斑病菌的实际检测。