一种免增菌的李斯特菌培养基.pdf

本发明公开了一种免增菌的李斯特菌培养基，属于检验微生物培养领域，每1L培养基原料中含有蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠、多粘菌素、杆菌肽、葡萄糖酸锌、γ-羟基精氨酸、无菌抗凝羊血、灭菌去离子水。本发明与现有技术相比较，具有早期阳性分离率高的特点。

1.一种免增菌的李斯特菌培养基，其特征在于，每1L培养基原料中含有蛋白胨6～10g；牛肉膏3～6g；酵母浸膏2～5g；玉米淀粉2~3g，琼脂10～12g；氯化钠5～5.5g；磷酸二氢钠1～3g；多粘菌素0.001～0.005g；杆菌肽0.001～0.003g；；葡萄糖酸锌0.01~0.02g；γ-羟基精氨酸0.05~0.1g；无菌抗凝羊血20～30g；余量为灭菌去离子水。

技术领域

本发明涉及检验微生物培养领域，具体涉及一种免增菌的单增李斯特菌培养基。

背景技术

李斯特菌（也称李氏杆菌）为革兰氏阳性短杆菌，目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株，其中单增李斯特菌（L.monocytohenes，LM）是唯一能引起人类疾病的。LM是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。LM为兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜。LM培养最适培养温度为35--37℃，在pH弱碱性（pH9.6）、氧分压低、二氧化碳张力高的条件下该菌生长良好。

虽然LM的营养要求不高，但由于LM的兼性厌氧和苛养性质，如样本中混有杂菌，且pH中性、常规空气条件下培养时，则会发生因需氧杂菌生长过快而很快覆盖了培养基，单增李斯特菌无法生长，结果延误诊疗时间。除此之外，LM在pH中性、常规空气状态下培养时，其生长速度较慢，一般要48~72h才会有阳性菌落生长，脓液或者粪便样品则往往还要样品先转种于增菌培养液（EB）中培养24h，然后取增菌液划线接种培养48h，方能有阳性菌落生长。由于上述苛养性质，导致临床对于疑似LM要求保留样本7d，以防止漏诊。但上述时间（72h）限制了LM培养结果在临床诊断上的应用价值。

发明内容

本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种配制简单、检出率高、免增菌的单增李斯特菌培养基。

本发明解决其技术问题的技术方案是：一种免增菌的李斯特菌培养基，其特征为，每1L培养基原料中含有蛋白胨6～10g；牛肉膏3～6g；酵母浸膏2～5g；玉米淀粉2~3g，琼脂10～12g；氯化钠5～5.5g；磷酸二氢钠1～3g；多粘菌素0.001～0.005g；杆菌肽0.001～0.003g；葡萄糖酸锌0.01~0.02g；γ-羟基精氨酸0.05~0.1g；无菌抗凝羊血20～30g；余量为灭菌去离子水。

上述培养基的制备方法为：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠，混匀后去离子水溶解，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌多粘菌素；灭菌杆菌肽；灭菌葡萄糖酸锌；灭菌γ-羟基精氨酸；无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L后分装。

本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、单增李斯特菌分离率高的特点。配方特点如下：

1、基础培养基：所述的牛肉膏、蛋白胨、玉米淀粉提供碳源、氮源，酵母浸膏富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、维生素、生长因子、微量元素等营养成分，为单增李斯特菌的繁殖和生长提供均衡的营养元素；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂为培养基的凝固剂；磷酸二氢钠为缓冲剂；无菌抗凝羊血提供能量环境；

2、抑菌剂：多粘菌素抑制革兰氏阴性菌的生长；杆菌肽（Bacitracin），实验室研究表明杆菌肽可以抑制革兰阳性和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌等杂菌的生长，但该浓度下由于对李斯特菌属无抗菌抑菌作用，因此提高了LM的分离率；

3、生长因子：通过实验将同一LM菌株接种到2个MMA培养基上，其中一个MMA培养基添加0.01%灭菌光谷甘肽，于37℃、PH7.0、空气气氛下培养，48小时后观察菌株，发现添加光谷甘肽的MMA培养基有小的疑似菌落，鉴定后为LM，没有添加光谷甘肽的MMA培养基未发现LM疑似菌落，其原因可能在于光谷甘肽可以降低氧化还原电势，有利于细胞生长、分化；

4、特殊营养剂：葡萄糖酸锌为营养剂，发明人发现，在培养基中加入一定浓度的锌离子，目标菌LM的生长状态好于对照组，因此推论锌离子有助于该菌的生长；而γ-羟基精氨酸为激活剂，可以促进单增李斯特菌对矿物质的摄取。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1，每1L培养基原料中含有：蛋白胨6g；牛肉膏6g；酵母浸膏2g；玉米淀粉3g，琼脂10g；氯化钠5g；磷酸二氢钠3g；多粘菌素0.001g；杆菌肽0.003g；光谷甘肽0.5g；无菌抗凝羊血20g；余量为灭菌去离子水。上述培养基的制备方法为：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠，混匀后去离子水溶解，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌多粘菌素；灭菌杆菌肽；灭菌光谷甘肽；无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L后分装。

实施例2，每1L培养基原料中含有：蛋白胨8g；牛肉膏4g；酵母浸膏3g；玉米淀粉2g，琼脂11g；氯化钠5.5g；磷酸二氢钠1g；多粘菌素0.003g；杆菌肽0.002g；葡萄糖酸锌0.02g；γ-羟基精氨酸0.1g；无菌抗凝羊血25g；余量为灭菌去离子水。上述培养基的制备方法为：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠，混匀后去离子水溶解，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌多粘菌素；灭菌杆菌肽；灭菌葡萄糖酸锌；灭菌γ-羟基精氨酸；无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L后分装。

实施例3，每1L培养基原料中含有：蛋白胨10g；牛肉膏3g；酵母浸膏5g；玉米淀粉2g，琼脂12g；氯化钠5g；磷酸二氢钠2g；多粘菌素0.005g；杆菌肽0.001g；光谷甘肽0.1g；葡萄糖酸锌0.01g；γ-羟基精氨酸0.05g；无菌抗凝羊血30g；余量为灭菌去离子水。上述培养基的制备方法为：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、琼脂、氯化钠、磷酸二氢钠，混匀后去离子水溶解，210℃灭菌15min，冷却到45℃，加入灭菌多粘菌素；灭菌杆菌肽；灭菌光谷甘肽；灭菌葡萄糖酸锌；灭菌γ-羟基精氨酸；无菌抗凝羊血混匀，灭菌去离子水定容到1L后分装。

本发明所得单增李斯特菌培养基具有检出可靠、单增李斯特菌分离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。

1对象与方法。

1.1培养基制备：实验组共设I、II、III三个实验组，分别使用实施例1、实施例2、实施例3所得培养基，对照组为李氏菌选择性培养基（MMA），其成分（g/L）：胰蛋白胨5.0；多价胨5.0；牛肉浸粉3.0；葡萄糖1.0；氯化钠5.0；磷酸氢二钠1.0；甘氨酸10.0；氯化锂0.5；苯乙醇2.5；琼脂15.0；蒸馏水定容为1L，分装倾入无菌平皿备用。

1.2菌株来源及菌悬液的制备：LM标准菌株由市疾控中心菌种保藏室提供，常规复苏增菌分纯后制成100CFU/ml的LM菌悬液。

1.3粪便样本处理：取20份粪便样本悬浮液2ml，分别加入LM菌悬液2ml，混匀。

1.4接种及培养：分别取LM菌悬液和处理后的粪便样本，各自用接种环分区划线接种于实验I组、实验II组、实验III组和对照组培养基。35℃下，大气环境保温培养，观察菌落生长特征，分别于48h和96h，挑取细小菌落进行涂片，革兰氏染色，显微镜镜检及氧化氢酶实验，行菌属鉴定及荧光定量PCR检测。其中菌属鉴定阳性判断标准依从《临床微生物学诊断与图解》。

2结果：

2.1LM菌悬液培养结果比较：培养48h及96h阳性检出情况见下表，

分组 总数（例） 48h阳性检出（例） 96h阳性检出（例） 实验I组 20 18 20 实验II组 20 17 20 实验III组 20 19 20 对照组 20 11 18

上述结果可以看出，培养48h后，各实验组与对照组阳性检出率比较均具有明显差异（P<0.05），而96h时，各组间阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2LM菌悬液处理后的粪便样本培养结果比较：培养48h及96h阳性检出情况见下表，

分组 总数（例） 48h阳性检出（例） 96h阳性检出（例） 实验I组 20 16 16 实验II组 20 16 18 实验III组 20 18 19 对照组 20 7 12

上述结果可以看出，混有杂菌的LM样本，培养48h后，各实验组与对照组阳性检出率比较均具有极其显著的差异（P<0.01），96h时，各实验组阳性检出率高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。

3.结论：本发明的培养基无需额外增菌，也能够在48h的时间点得到高效的阳性检出率，提高大气培养环境下早期阳性分离率，从而缩短确诊时间。尤其是对于粪便等含有杂菌的样本，可以缓解杂菌对于单增李斯特菌阳性生长的不良影响，增加分离率。