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1、(10)授权公告号 CN 102731276 B (45)授权公告日 2014.04.09 CN 102731276 B (21)申请号 201210183216.7 (22)申请日 2012.06.06 C07C 47/46(2006.01) C07C 47/445(2006.01) C07C 45/78(2006.01) A61K 31/11(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 南京中医药大学 地址 210029 江苏省南京市汉中路 282 号 (72)发明人 段金廒 陶伟伟 杨念云 唐于平 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32。
2、200 代理人 杨海军 (54) 发明名称 具有抗肿瘤活性的二萜化合物及其制备方法 与应用 (57) 摘要 本发明公开了具有抗肿瘤活性的新西松烷型 二萜化合物。 体外抗肿瘤活性研究表明， 本发明提 供的西松烷型二萜化合物对多种肿瘤细胞， 包括 胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌等均具有很强的抗肿瘤 活性， 且经过毒性实验研究表明， 本发明提供的具 有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物毒性较低， 可望开发成新的抗肿瘤药物。 (51)Int.Cl. 审查员 胡杨 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 (。
3、10)授权公告号 CN 102731276 B CN 102731276 B 1/1 页 2 1. 具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 其特征在于， 其结构式为 ： 或 2. 根据权利要求 1 所述的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 其特征在于， 将西 松烷型二萜化合物和药学上可接受的载体制备成片剂、 胶囊剂、 注射剂、 粉针剂、 颗粒剂、 脂 肪乳剂、 微囊、 滴丸、 软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。 3. 权利要求 1 所述的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： (1) 取干燥的京大戟根， 用浓度为 80 至 100% 乙醇提取 2 至 3。
4、 次， 每次 1 至 3 小时， 合并 提取液， 回收乙醇后， 得到乙醇提取物， 备用 ； (2) 取步骤 (1) 的乙醇提取物加水混悬， 用石油醚萃取， 得到石油醚部位 ； (3) 取步骤 (2) 得到的石油醚部位， 采用硅胶柱层析， 先以石油醚洗脱， 然后用石油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ： 1 的洗脱剂洗脱， 得到石油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ： 1 的洗脱部位， 合并洗脱部位， 浓缩， 浓缩物再经硅胶柱层析， 用石油醚 ： 乙酸乙酯 =95:5 洗脱， 分离得到。 4. 权利要求 1 所述的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物在制备抗结肠癌、 肝癌或 肾癌药物中的应用。 权 利 要 求 书。
5、 CN 102731276 B 2 1/6 页 3 具有抗肿瘤活性的二萜化合物及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及具有抗肿瘤活性的化合物， 具体涉及从中药京大戟中提取的得到的具 有抗肿瘤活性的西松烷型二萜新化合物及其在预防和治疗肿瘤疾病中的用途， 属医药技术 领域。 背景技术 0002 恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的多发病和常见病， 早在 2000 3000 年前 埃及和我国已有关于肿瘤的记载。 包括中国在内的很多国家， 尤其是中等发达国家， 恶性肿 瘤所致死亡在所有死亡原因中占首位或第二位， 且发病率在世界范围内仍呈上升趋势， 在 肿瘤的术疗、 放疗、 化疗、 生物治疗四大。
6、疗法中， 化疗仍是主要的治疗方法， 现有的化疗药物 抗肿瘤活性有限， 且毒副作用较大， 病人耐受能力差， 且价格昂贵。 因此， 通过研究天然植物 中的化学抗癌物质预防癌症的发生和发展， 已成为癌症化学预防研究的一个重要领域， 并 受到世界各国科学界的普遍关注及研究热点。 0003 京 大 戟 （Euphorbiae Pekinensis radix）为 大 戟 科 植 物 大 戟Euphorbia Pekinensis Rupr. 的干燥根。味辛， 性温 ； 有大毒。归肝经。具有泻水逐饮， 消肿散结的功 效。为历版中国药典收载的中药材品种。已有研究报道， 大戟属植物富含强抗肿瘤的二萜， 但对中。
7、药京大戟的化学成分和生物活性研究报道甚少， 本发明对京大戟化学成分进行系统 深入研究， 分离得到具有抗肿瘤活性的新西松烷型二萜化合物。 发明内容 0004 发明目的 ： 本发明的目的是为了克服现有技术的不足， 提供一种具有强抗肿瘤活 性的新的西松烷型二萜化合物及其在预防和治疗肿瘤疾病中的用途。 0005 技术方案 ： 为了实现以上目的， 本发明采取的技术方案为 ： 0006 具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 其结构式如下 ： 0007 0008 该新化合物命名为 pekinenins C ； 说 明 书 CN 102731276 B 3 2/6 页 4 0009 或者其结构式为 ： 001。
8、0 该新化合物命名为 pekinenins F。 0011 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物的提取分离方法包括以下 步骤 ： 0012 (1) 取干燥的京大戟根， 用浓度为 80 至 100% 乙醇提取 2 至 3 次， 每次 1 至 3 小时， 合并提取液， 回收乙醇后， 得到乙醇提取物， 备用 ； 0013 (2) 取步骤 (1) 的乙醇提取物加水混悬， 用石油醚萃取， 得到石油醚部位 ； 0014 (3) 取步骤 (2) 得到的石油醚部位， 采用硅胶柱层析， 先以石油醚洗脱， 然后用石 油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ： 1 的洗脱剂洗脱， 得到石油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ：。
9、 1 的洗脱部位， 合并洗脱 部位， 浓缩， 浓缩物再经硅胶柱层析， 用石油醚 ： 乙酸乙酯 =95: 5， 分离得到新的西松烷型 二萜化合物， pekinenins C 和 pekinenins F。 0015 以上制备方法中， 步骤 1 提取方法可以是冷浸、 渗漉、 微波提取、 超声提取、 回流提 取等。 0016 以本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 将西松烷型二萜化合物 （pekinenins C和pekinenins F） 和药学上可接受的载体制备成片剂、 胶囊剂、 注射剂、 粉针 剂、 颗粒剂、 脂肪乳剂、 微囊、 滴丸、 软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。 0017 将本。
10、发明提供的西松烷型二萜化合物制成片剂时， 把西松烷型二萜化合物和乳糖 或玉米淀粉， 需要时加入润滑剂硬脂酸镁， 混合均匀， 整粒， 然后压片制成片剂。 0018 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成胶囊剂时把西松烷型二萜化合物和载体 乳糖或玉米淀粉混合均匀， 整粒， 然后装胶囊制成胶囊剂。 0019 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成颗粒剂时， 把西松烷型二萜化合物和稀释 剂乳糖或玉米淀粉、 混合均匀， 整粒， 干燥， 制成颗粒剂。 0020 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成粉针剂、 注射液时加入载体按药学常规方 法制备得到。 0021 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成脂肪乳剂、 软膏剂或透。
11、皮控释贴剂等剂型 时加入载体按药学常规方法制备得到。 0022 本发明提供的的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物 （pekinenins C 和 pekinenins F） 在制备抗肿瘤药物中的应用。 0023 作为优选方案， 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物在制备抗肿 瘤药物中的应用， 所述的肿瘤为胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌。 0024 有益效果 ： 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物和现有技术相比 具有以下优点 ： 0025 本发明通过对京大戟化学成分进行系统深入研究， 经过波谱和质谱数据分析表明 说 明 书 CN 102731276 B 4 3/6 页 5 从。
12、京大戟根中分离得到二个西松烷型二萜化合物 （pekinenins C 和 pekinenins F） ， 为新 化合物。且经过体外抗肿瘤活性研究表明， 本发明提供的西松烷型二萜化合物对多种肿瘤 细胞， 包括胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌等均具有很强的抗肿瘤活性， 且经过毒性实验研究表 明， 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物毒性较低， 是一种优良的抗肿瘤 新化合物， 可开发成新的抗肿瘤药物。 附图说明 0026 图 1 为 pekinenins C 的结构示意图 ； 0027 图 2 为 pekinenins F 的结构示意图 ； 0028 图 3 为 pekinenins C 的 。
13、1H NMR 图 ； 0029 图 4 为 pekinenins C 的 13C NMR 图 ； 0030 图 5 为 pekinenins F 的 1H NMR 图 ； 0031 图 6 为 pekinenins F 的 13C NMR 图。 具体实施方式 0032 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。 0033 实施例 1 西松烷型二萜化合物的制备 0034 取京大戟根 20 公斤， 粉碎后以 8 倍量浓度为 95% 乙醇提取两次。
14、， 每次 2 小时， 合并 提取液， 回收乙醇后， 低温干燥， 得乙醇提取物。 乙醇提取物以水混悬后， 以1 ： 1量的石油醚 萃取3次， 回收石油醚， 得到石油醚部位。 石油醚部位采用硅胶柱层析， 先以石油醚洗脱5个 柱体积， 然后以石油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ： 1 洗脱， 薄层色谱跟踪， 合并石油醚 ： 乙酸乙酯 =10 ： 1 洗脱部位， 进行反复柱层析， 得到化合物 pekinenins C（收率 ： 58. 0mg） ， 结构式如图 1 所 示， 和化合物 pekineninss F（收率 ： 42.0 mg） ， 结构式如图 2 所示。 0035 pekinenins C 的结。
15、构解析 ： 白色粉末， 高分辨质谱给出 m/z 303.2318 M+H+， 分 子式 ： C20H30O2。如图 3 所示， 1H NMR 谱显示该化合物存在 4 个甲基 1.17 (s, H3-16), 1.16 (s, H3-17), 1.53 (s, H3-19), 1.57 (s, H3-20); 3 个稀键质子 信号 （4.86, t） 、（4.97, t） 和 （5.97, d） ， 1 个醛基质子信号 （ 10.11, s） 。 如图 4 所示， 13C NMR 谱结合 DEPT 光谱表明该化合物具有 4 个甲基， 5 个亚甲基， 7 个次亚甲基以 及 4 个季碳， 确定 pe。
16、kinenins C 的母核为西松烷型二萜。综合 HMBC、 NOE 确定取代基的 链接位置以及构型， 最终确定 pekinenins C 的结构式， 化学名称为 ： 5-hydroxy-1H, 2H-casba-3Z, 7E, 11E-trien-18-al（5- 羟基 -1H， 2H- 西松烷 -3Z， 7E， 11E- 三 烯 -18- 醛基） 。 0036 pekinenins F 的结构解析 ： 无色针晶， 高分辨质谱给出 m/z 287.2375 M+H+， 分 子式 ： C20H30O。如图 5 所示， 1H NMR 谱显示该化合物存在 4 个甲基 1.12 (s, H3-16)。
17、, 1.06 (s, H3-17), 1.44 (s, H3-19), 1.60 (s, H3-20) ； 3 个稀键质子信 号 （5.02, t） 、（4.97, t） 和 （6.06, d） ， 。如图 6 所示， 13C NMR 谱结合 DEPT 光谱表明 该化合物具有 4 个甲基， 6 个亚甲基， 6 个次亚甲基以及 4 个季碳， 确定 pekinenins F 的母 说 明 书 CN 102731276 B 5 4/6 页 6 核为西松烷型二萜。分析比较 pekinenins C 与 pekinenins F 的 1H NMR 及13C NMR 发现， pekinenins E 的 。
18、1H NMR（如图 5、 6 所示） 中未出现羟基信号。综合 HMBC、 NOE 确定取代基 的链接位置以及构型， 最终确定 pekinenins F 的结构式为 ： 1H, 2H-casba-3E, 7E, 11E-trien-18-al（1H， 2H- 西松烷 -3E, 7E, 11E - 三烯 -18- 羧基） 0037 实施例 2 体外抗肿瘤试验 0038 1、 抗人胃癌细胞 MGC-803 实验 0039 人胃癌细胞株 MGC-803 用含 10% 小牛血清、 100U/mL 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基在 37 C、 5%CO2 培养箱中常规培养。
19、。用 0.25% 胰酶加 0.02%EDTA 消化、 传代。取对数生长期细胞， 经胰酶消化后用含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液制备细胞 悬浮液， 细胞浓度约为1105个/ml， 接种于96孔培养板内， 每孔180L ； 取本发明实施例1 制备得到的新化合物 pekineninss C （结构如图 1、 下同） 和 pekineninss F （结构如图 2、 下 同） 分别设1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6个浓度， 每孔再分别加入 20L 二甲亚砜， 每组设 4 个复孔， 置 37 C、 5%CO2 培养箱中培养 72。
20、h 后， 每孔加入 10LWST -8 溶液， 继续培养 4h 后， 使用 EL-x800 酶标仪在 =450nm 下测荧光值。以加入不含细胞的 培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照值。按照公式计算药物抑制 （%） =（对照组 荧光值试验组荧光值） /（对照组荧光值空白组荧光值） 100%。 0040 实验结果 ： 化合物 pekineninss C 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6 个浓度对人胃癌细胞 MGC-803 的抑制率分别为 7.34%， 20.74%， 41.62%， 51.34%， 74.80%， 98.31%。
21、。计算 pekineninss C 抑制 MGC-803 肿瘤细胞株的 IC50 为 5.9g/ml。 0041 化 合 物 pekineninss F 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6 个浓度对人胃癌细胞 MGC-803 的抑制率分别为 3.61%， 8.52%， 21.31%， 42.34%， 51.49%， 90.06%。计算 pekineninss F 抑制 MGC-803 肿瘤细胞株的 IC50 为 12.1g/ml。 0042 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninss C和pekineninss F对人。
22、 胃癌细胞具有很好的抑制作用。 0043 2、 抗人结肠癌细胞 SW620 实验 0044 人结肠癌细胞 SW620 用含 10% 小牛血清、 100U/mL 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基在 37 C、 5%CO2 培养箱中常规培养。用 0.25% 胰酶加 0.02%EDTA 消化、 传代。取对数生长期细胞， 经胰酶消化后用含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液制备细胞 悬浮液， 细胞浓度约为 1105 个 /ml， 接种于 96 孔培养板内， 每孔 180L ； 本发明提供的新 化合物 pekineninss C 和 pekineninss F。
23、 分别设 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ ml， 40g/ml 6 个浓度， 每孔再分别加入 20L 二甲亚砜， 每组设 4 个复孔， 置 37 C、 5%CO2 培养箱中培养 72h 后， 每孔加入 10LWST -8 溶液， 继续培养 4h 后， 使用 EL-x800 酶标仪在 =450nm 下测荧光值。以加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照 值。按照公式计算药物抑制 （%） =（对照组荧光值试验组荧光值） /（对照组荧光值空 白组荧光值） 100%。 0045 实 验 结 果 ： 化 合 物 pekineninss C 的 1g/。
24、ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ ml， 40g/ml 6 个浓度对人结肠癌细胞的抑制率分别为 4.36%， 12.91%， 30.62%， 50.86%， 89.81%， 91.35%。计算 pekineninss C 抑制 SW620 肿瘤细胞株的 IC50 为 7.5g/ml。 0046 化合物 pekineninss F 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6 说 明 书 CN 102731276 B 6 5/6 页 7 个浓度对人结肠癌细胞的抑制率分别为7.38%， 11.38%， 17.73%， 2。
25、6.72%， 54.72%， 83.19%。 计 算 pekineninss F 抑制 SW620 肿瘤细胞株的 IC50 为 15.2g/ml。 0047 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninss C和pekineninss F对人 结肠癌细胞具有很好的抑制作用。 0048 3、 抗人肝癌细胞 SMMC-7721 实验 0049 人肝癌细胞 SMMC-7721 用含 10% 小牛血清、 100U/mL 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基在 37 C、 5%CO2 培养箱中常规培养。用 0.25% 胰酶加 0.02%EDTA 消化、 传代。取对数。
26、生长期细胞， 经胰酶消化后用含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液制备细胞 悬浮液， 细胞浓度约为 1105 个 /ml， 接种于 96 孔培养板内， 每孔 180L ； 本发明提供的新 化合物 pekineninss C 和 pekineninss F 分别设 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ ml， 40g/ml 6 个浓度， 每孔再分别加入 20L 二甲亚砜， 每组设 4 个复孔， 置 37 C、 5%CO2 培养箱中培养 72h 后， 每孔加入 10LWST -8 溶液， 继续培养 4h 后， 使用 EL-x800 酶标仪在 =450nm 。
27、下测荧光值。以加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照 值。按照公式计算药物抑制 （%） =（对照组荧光值试验组荧光值） /（对照组荧光值空 白组荧光值） 100%。 0050 实 验 结 果 ： 化 合 物 pekineninss C 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ ml， 40g/ml 6 个浓度对人肝癌细胞 SMMC-7721 的抑制率分别为 6.82%， 19.46%， 37.52%， 53.46%， 75.01%， 96.11%。计算化合物 pekineninss C 抑制 SMMC-7721 肿瘤细胞株的 IC50 为 6.。
28、6g/ml。 0051 化合物 pekineninss F 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6 个浓度对人肝癌细胞 SMMC-7721 的抑制率分别为 3.29%， 11.42%， 20.61%， 31.39%， 51.09%， 78.32%。计算 pekineninss F 抑制 SMMC-7721 肿瘤细胞株的 IC50 为 16.1g/ml。 0052 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninss C和pekineninss F对人 肝癌细胞具有很好的抑制作用。 0053 4、 抗人肾癌细胞 Ketr-3 实验 0。
29、054 人肾癌细胞 Ketr-3 用含 10% 小牛血清、 100U/mL 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基在 37 C、 5%CO2 培养箱中常规培养。用 0.25% 胰酶加 0.02%EDTA 消化、 传代。取对数生长期细胞， 经胰酶消化后用含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液制备细胞 悬浮液， 细胞浓度约为 1105 个 /ml， 接种于 96 孔培养板内， 每孔 180L ； 本发明提供的新 化合物 pekineninss C 和 pekineninss F 分别设 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ ml，。
30、 40g/ml 6 个浓度， 每孔再分别加入 20L 二甲亚砜， 每组设 4 个复孔， 置 37 C、 5%CO2 培养箱中培养 72h 后， 每孔加入 10LWST -8 溶液， 继续培养 4h 后， 使用 EL-x800 酶标仪在 =450nm 下测荧光值。以加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照 值。按照公式计算药物抑制 （%） =（对照组荧光值试验组荧光值） /（对照组荧光值空 白组荧光值） 100%。 0055 实验结果 ： 化合物 pekineninss C 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml 6 个浓度对。
31、人肾癌细胞 Ketr-3 的抑制率分别为 5.73%， 18.53%， 31.26%， 59.62%， 78.05%， 92.64%。 计算pekineninss C抑制人肾癌细胞Ketr-3肿瘤细胞株的IC50为7.3g/ ml。 说 明 书 CN 102731276 B 7 6/6 页 8 0056 化合物 pekineninss F 的 1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ ml 6 个浓度对人肾癌细胞 Ketr-3 的抑制率分别 4.62%， 10.11%， 27.51%， 37.01%， 47.15%， 79.47%。计算 pekinen。
32、inss F 抑制 Ketr-3 肿瘤细胞株的 IC50 为 15.1g/ml。 0057 以上实验结果表明本发明分离得到的新化合物 pekineninss C 和 pekineninss F 对人肾癌细胞具有很好的抑制作用。 0058 实施例 3 pekineninss C 和 pekineninss F 的急性毒性实验 0059 按 Bliss 法计算小鼠半数致死量 LD50值， pekineninss C 和 pekineninss FD LD50 值为0.89mg/kgHE 0.94mg/kg， 实验结果表明本发明提供的pekineninss C和pekineninss F 化合物的急。
33、性毒性较低。 0060 实施例 4 片剂的制备 0061 取上述实施例 1 制备得到的 pekineninss C 和 pekineninss F 加药用辅料淀粉、 硬脂酸镁等适量， 充分混匀后， 压片， 制成片剂口服使用。 0062 实施例 5 胶囊剂的制备 0063 取上述实施例 1 制备得到的 pekineninss C 和 pekineninss F 加药用辅料淀粉适 量， 充分混匀后， 装入胶囊， 制成胶囊剂口服使用。 0064 以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的 人了解本发明内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 凡根据本发明精神实 质所做的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 102731276 B 8 1/3 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102731276 B 9 2/3 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102731276 B 10 3/3 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 102731276 B 11 。