技术领域
本发明涉及一种优势菌群选择性培养基及其制备方法和优势菌的筛选方法。
背景技术
发酵类中药是利用传统的中药炮制学发酵法在自然条件利用环境中的微生物发酵中药 或豆类、面粉等而成，为多菌种混合自然发酵，用以达到提高药效、消除毒副作用、改变 药性的目的。
传统的中药发酵采用天然微生物多菌种混合发酵，菌种不纯，代谢理论、药效成分理 念模糊不清，生产可控性差；加之不同地域、不同生产环境、不同原料、不同生产季节的 微生物有差异，从而导致发酵中药的产品质量波动性大、不稳定。
为了获得固定发酵菌群，以提高和保障发酵类中药的生产质量，目前已选用营养琼脂 培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基分离培养发酵中药中的微生物菌群， 这三种培养基分别适用于细菌、霉菌和酵母菌的培养，只能单独的培养分离不同种类的菌 群；而对于多菌种混合自然发酵的中药不能单独采用一种培养基而获得全部优势菌群，需 多种培养基分离不同菌群，不仅费时费力，优势菌种分离效果也不理想。
发明内容
本发明是为了解决传统的中药发酵产品质量波动性大、不稳定，以及目前分离获得的 发酵中药中的微生物种类、菌种的数量差异性较大；且还需多次分离纯化、费时费力，菌 种筛选效果也不理想的问题，而提供的一种发酵类中药优势菌群选择性培养基及其制备方 法和发酵类中药优势菌的筛选方法。
本发明发酵类中药优势菌群选择性培养基包括中药煎煮浓缩液、葡萄糖和琼脂。
上述发酵类中药优势菌群选择性培养基按以下步骤制备：将葡萄糖和琼脂加入中药煎 煮浓缩液中摇匀，再灭菌，即得到发酵类中药优势菌群选择性培养基。
用上述发酵类中药优势菌群选择性培养基筛选发酵类中药优势菌的方法按以下步骤进 行：
一、将发酵类中药优势菌群选择性培养基铺平板，然后自然冷却凝固；
二、将发酵类中药在无菌条件下用浓度为0.9％的无菌生理盐水研磨，然后再稀释涂于 步骤一发酵类中药优势菌群选择性培养基上，置于20℃～40℃培养2～7天，即得到该发酵 类中药优势菌群。
本发明发酵类中药优势菌群选择性培养基具有针对性强，可完全满足发酵中药中所有 优势菌群的生长繁殖需要，不会造成发酵优势菌群的缺失；而且本发明培养基的选择性好， 优势菌群可在发酵过程中生长旺盛，中药煎煮浓缩液可有效抑制杂菌的生长，从而避免杂 菌的干扰和影响。
采用本发明发酵类中药优势菌群选择性培养基对发酵类中药的优势菌群进行筛选具有 快速、准确的优点，特别适合含有多种未知微生物的发酵中药的优势菌种筛选。
按本发明方法选取的发酵类中药的优势菌群的菌种结构合理、比例适当，可直接用于 产业化生产，具有发酵速度快、周期短、质量稳定等优势。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意 组合。
具体实施方式一：本实施方式发酵类中药优势菌群选择性培养基包括中药煎煮浓缩液、 葡萄糖和琼脂。
六神曲、淡豆豉为传统中药中典型的发酵类中药。本实施方式发酵类中药优势菌群选 择性培养基可适用于不同发酵类中药。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：每升发酵类中药优势菌 群选择性培养基中含葡萄糖10～30g、琼脂15～25g。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：淡豆豉优势菌群选择性 培养基由桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液1000ml、大豆粉30～50g、葡萄糖10～30g和琼脂15～25g 组成；桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液由70～100g的桑叶和70～100g的青蒿煎煮而成。其它步 骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：六神曲优势菌群选择性 培养基由辣蓼、青蒿和苍耳草的水煎煮浓缩液1000ml、苦杏仁粉15～25g、赤小豆粉15～25g、 葡萄糖10～30g和琼脂15～25g组成；辣蓼、青蒿和苍耳草的水煎煮浓缩液由50～100g的辣 蓼、50～100g青蒿和50～100g的苍耳草煎煮而成。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式发酵类中药优势菌群选择性培养基按以下步骤制备：
将葡萄糖和琼脂加入中药煎煮浓缩液中摇匀，再灭菌，即得到发酵类中药优势菌群选 择性培养基。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：六神曲优势菌群选择性 培养基制备方法：
将苦杏仁粉15～25g、赤小豆粉15～25g、葡萄糖10～30g和琼脂15～25g加入由辣蓼、 青蒿和苍耳草的水煎煮浓缩液1000ml中摇匀，再121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，即得 到发酵类中药优势菌群选择性培养基；辣蓼、青蒿和苍耳草的水煎煮浓缩液由50～100g的 辣蓼、50～100g青蒿和50～100g的苍耳草煎煮而成。其它步骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：淡豆豉优势菌群选择性 培养基制备方法：
将大豆粉30～50g、葡萄糖10～30g和琼脂15～25g加入由桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液 1000ml中摇匀，再121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，即得到发酵类中药优势菌群选择性培 养基；桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液由70～100g的桑叶和70～100g的青蒿煎煮而成。其它步 骤及参数与实施方式五相同。
具体实施方式八：本实施方式按以下步骤选取发酵类中药优势菌群：
一、将发酵类中药优势菌群选择性培养基铺平板，然后自然冷却凝固；
二、将发酵类中药在无菌条件下用浓度为0.9％的无菌生理盐水研磨，然后再稀释涂于 步骤一发酵类中药优势菌群选择性培养基上，置于20℃～40℃培养2～7天，即得到该发酵 类中药优势菌群。
本实施方式中步骤一中每个培养皿中倒入发酵类中药优势菌群选择性培养基 15～20ml。步骤二发酵类中药优势菌群选择性培养基上涂覆发酵类中药研磨稀释液 50～200μl。
实施例1
淡豆豉优势菌群选择性培养基制备方法：将大豆粉30g、葡萄糖20g和琼脂20g加入 由桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液1000ml中摇匀，再121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，即得 到发酵类中药优势菌群选择性培养基；桑叶和青蒿的水煎煮浓缩液由70g的桑叶和100g 的青蒿煎煮而成。
筛选发酵类中药优势菌群：
一、将淡豆豉优势菌群选择性培养基铺平板，然后自然冷却凝固；
二、将淡豆豉在无菌条件下用浓度为0.9％的无菌生理盐水研磨，然后再稀释涂于步骤 一淡豆豉优势菌群选择性培养基上，置于25℃～30℃培养5天，即得到淡豆豉优势菌群；
步骤一中每个培养皿中倒入淡豆豉优势菌群选择性培养基15～20ml。
步骤二淡豆豉优势菌群选择性培养基上涂覆淡豆豉研磨稀释液100μl。
实施例2
六神曲优势菌群选择性培养基制备方法：将苦杏仁粉15g、赤小豆粉15g、葡萄糖30g 和琼脂25g加入由辣蓼、青蒿和苍耳草的水煎煮浓缩液1000ml中摇匀，再121℃、高压蒸 汽灭菌15～20min，即得到发酵类中药优势菌群选择性培养基；辣蓼、青蒿和苍耳草的水煎 煮浓缩液由60g的辣蓼、60g青蒿和60g的苍耳草煎煮而成。
筛选发酵类中药优势菌群：
一、将六神曲优势菌群选择性培养基倒平板，然后自然冷却凝固；
二、将六神曲在无菌条件下用浓度为0.9％的无菌生理盐水研磨，然后再稀释涂于步骤 一六神曲优势菌群选择性培养基上，置于25℃～32℃培养6天，即得到六神曲优势菌群；
步骤一中每个培养皿中倒入六神曲优势菌群选择性培养基15～20ml。
步骤二六神曲优势菌群选择性培养基上涂覆六神曲研磨稀释液150μl。
实施例3
用营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基分别分离培养淡豆 豉中的发酵微生物菌群；然后经多次分离纯化得到的淡豆豉优势菌群。
实施例4
用营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基分别分离培养六神 曲中的发酵微生物菌群；然后经多次分离纯化得到的六神曲优势菌群。
对比试验：
一、用实施例1的方法对安徽产地、黑龙江产地、昆明产地的符合《中华人民共和国 药典》2010年版一部淡豆豉质量标准的饮片进行发酵菌种的筛选。安徽、黑龙江、昆明三 地采用实施例1方法筛选出的发酵优势菌，再分别接种到淡豆豉发酵基质(70～100g的桑 叶和70～100g的青蒿加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出， 稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖)中，然后闷，使之发酵至黄衣上遍时， 取出，除去药渣，洗净，再置容器内闷至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即 得淡豆豉；发酵过程均在无菌环境中进行，每个实验重复操作5次，发酵淡豆豉通过理化 鉴别和薄层鉴别都达到质量标准要求，大豆苷元含量均达到150μg/g，每个批次产品质量 稳定。
而安徽、黑龙江、昆明三地分别采用自然发酵方法各制备的淡豆豉6个批次，虽然理 化鉴别和薄层鉴别都能达到质量标准要求，但大豆苷元含量其中一共只有3个批次的淡豆 豉的达到150μg/g，产品的稳定性较差、质量难以得到保证。
用实施例3的方法对安徽产地、黑龙江产地、昆明产地的符合中国药典2010年版一部 淡豆豉质量标准的饮片进行发酵菌种的筛选。营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、 麦芽汁琼脂培养基中都分别培养出细菌4～6种、霉菌5～7种、酵母菌2～3种。然后分别进 行分离、纯化，再相互组合进行发酵实验用以找出淡豆豉发酵优势菌种。该方法实验组别 多、耗时长，原料浪费量大；且找到的最佳菌种组合的发酵效果是淡豆豉中大豆苷元含量 在135μg/g左右，仍然低于用实施例1。
证明本发明方法省时省力、发酵中药产品质量稳定，更适于产业化生产。
二、用实施例2的方法对河北产地、黑龙江产地、昆明产地的符合《中华人民共和国 卫生部药品标准》中WS3-B-35的六神曲进行发酵菌种的筛选。河北产地、黑龙江产地、 昆明产地三地采用实施例2方法筛选出的发酵优势菌，再分别接种到六神曲发酵基质(辣 蓼500g，青蒿500g，苍耳草500g，赤小豆100g，苦杏仁100g，麦麸5000g，面粉2500g。 以上七味，苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉，与面粉、麦麸混匀，另取辣蓼、青蒿、苍耳草加 水煎煮1小时，滤过，滤液浓缩成清膏，趁热与上述药粉拌匀)中，保持适当温度和湿度， 发酵至表面遍生黄白色或灰白色霉衣，取出，粉碎，干燥，即得六神曲；发酵过程均在无 菌环境中进行，每个实验重复操作5次。原质量标准中没有明确的定性及定量考察指标， 查阅文献，选取蛋白酶和淀粉酶作为定量指标，经检测每个批次六神曲产品的蛋白酶活力 均大于200U/g，淀粉酶活力均大于80U/g，质量稳定。
而河北、黑龙江、昆明三地分别采用自然发酵方法各制备的六神曲6个批次，其中一 共只有2个批次的六神曲的蛋白酶活力达到200U/g且淀粉酶活力大于80U/g，产品的稳 定性较差、质量难以得到保证。
用实施例3的方法对河北产地、黑龙江产地、昆明产地的符合《中华人民共和国卫生 部药品标准》中WS3-B-35的六神曲进行发酵菌种的筛选。营养琼脂培养基、马铃薯葡萄 糖琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基中都分别培养出细菌4～6种、霉菌5～8种、酵母菌1～3 种。然后分别进行分离、纯化，再相互组合进行发酵实验用以找出六神曲发酵优势菌种。 该方法实验组别多、耗时长，原料浪费量大，且找到的最佳菌种组合的发酵效果是六神曲 中蛋白酶活力为150～180U/g和淀粉酶活力为60～65U/g，均低于用实施例2。
证明本发明方法省时省力、发酵中药产品质量稳定，更适于产业化生产。