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1、(10)授权公告号 CN 102731277 B (45)授权公告日 2014.11.12 CN 102731277 B (21)申请号 201110091671.X (22)申请日 2011.04.12 C07C 49/21(2006.01) C07C 45/79(2006.01) C07C 13/50(2006.01) C07C 13/48(2006.01) C07C 7/12(2006.01) A61K 31/12(2006.01) A61K 31/015(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/04(2006.01) (73)专利权人 中国科学院上海药物研。
2、究所 地址 201203 上海市浦东新区张江祖冲之路 555 号 (72)发明人 郭跃伟 李佳 李亮 盛丽 周宇波 (74)专利代理机构 北京金信立方知识产权代理 有限公司 11225 代理人 朱梅 鲁云博 CN 102731242 A,2012.10.17, 权利要求 1. Shi-Yie Cheng et al.Antiviral and anti-inflammatory Diterpenoids from the Soft Coral Sinularia gyrosa.Journal of Natural Products .2010, 第 73 卷 ( 第 6 期 ),1184-11。
3、87. Steven E. Poet et al.Three New Diterpenes from a Soft Coral Nephthea Species.Australian Journal of chemistry .1982, 第 35 卷 77-83. (54) 发明名称 二萜类化合物豆荚甲素己素、 其制备方法 及其在制备药物中的用途 (57) 摘要 本发明涉及医药技术领域， 具体而言， 涉 及 一 类 从 Lobophytum 属 软 珊 瑚 Lobophytum cristatum Tixier-Durivault中分离得到的6个 结构新颖的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙。
4、素、 丁素、 戊素和己素， 其制备方法及其在制备治疗 II 型糖尿病药物中的应用。本发明的豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的结构式如下所示。 该类化合物经过生物活性测试可作为蛋白酪氨酸 磷酸酯酶 1B(PTP1B) 抑制剂和胰岛素增敏剂， 它 们可用于制备治疗 II 型糖尿病、 肥胖症及其并发 症的药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高虎 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 (10)授权公告号 CN 102731277 B CN 102731277 B 1/1 页 2 1. 。
5、化学结构式如下的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素， 其中，“ ” 表示该位置手性碳的构型为 R 型或 S 型 ： 2. 权利要求 1 所述的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素的制备方 法， 其特征是， 该方法包括以下步骤 ： 1)- 提取 ： 将软珊瑚 Lobophytum cristatum 用酮溶剂提取， 所得提取液浓缩后得粗浸 膏 ； 将该粗浸膏溶于水中， 混悬均匀后用乙醚萃取， 所得萃取液浓缩后得到乙醚浸膏 ； 2)- 分离 ： 将步骤 1) 中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析， 以石油醚 / 乙醚进行梯度洗 脱 ； 其中， 体积比为 95。
6、 5 的石油醚 / 乙醚的洗脱部分， 经进一步硅胶柱层析， 以体积比 为 98 2 的石油醚 / 乙醚洗脱， 分离出豆荚丙素和丁素 ； 体积比为 90 10 的石油醚 / 乙 醚洗脱部分， 经进一步硅胶柱层析， 以体积比为 95 5 的石油醚 / 乙醚洗脱后采用填料为 ODS-C18反相材料、 流动相为甲醇 / 水的半制备高效液相色谱分离得到豆荚甲素、 乙素、 戊素 和己素。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征是， 在步骤 1) 中， 所述的酮溶剂为丙酮。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征是， 在步骤1)中， 所述的酮溶剂提取是采用 超声提取。 5. 根据权利要求 2 。
7、所述的制备方法， 其特征是， 在步骤 2) 中， 所述石油醚 / 乙醚梯度 洗脱是以石油醚/乙醚的体积比为10009559010802050502080 0 100 进行梯度洗脱。 6. 权利要求 1 所述的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素在制备蛋 白酪氨酸磷酸酯酶 1B 抑制剂的药物中的用途。 7. 权利要求 1 所述的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素在制备胰 岛素增敏剂的药物中的用途。 8. 权利要求 1 所述的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素在制备治 疗 II 型糖尿病、 肥胖症或其并发症的药物中的用途。 9.。
8、 一种药物组合物， 其特征是， 含有一种或多种治疗有效量的权利要求 1 所述的二萜 类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素作为有效成分， 并含有常规药用载体。 权 利 要 求 书 CN 102731277 B 2 1/6 页 3 二萜类化合物豆荚甲素己素、 其制备方法及其在制备药 物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体而言， 涉及一类从豆荚软珊瑚属软珊瑚 (Lobophytum cristatum) 中分离得到的 6 个结构新颖的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙 素、 丁素、 戊素或己素 ； 本发明还涉及该类化合物的制备方法 ； 以及该类化合物作为蛋白。
9、酪 氨酸磷酸酯酶 1B(PTP1B) 抑制剂和胰岛素增敏剂， 在制备治疗 II 型糖尿病、 肥胖症及其并 发症的药物中的用途。 背景技术 0002 糖尿病 (diabetes mellitus) 是一组由遗传和环境因素相互作用而引起 的临床综合症。目前， 一般将糖尿病分为两类， I 型糖尿病 ( 胰岛素依赖型糖尿病， insulin-dependent diabetes mellitus， IDDM) 与 II 型糖尿病 ( 非胰岛素依赖型糖尿病， non-insulin-dependent diabetes mellitus， NIDDM)。 糖尿病中90以上是II型糖尿病。 0003 II。
10、 型糖尿病的特点是胰岛素敏感组织如骨骼肌、 肝、 脂肪组织对胰岛素作用的抵 抗。蛋白酪氨酸磷酸酯酶 (PTPases) 在平衡细胞内胰岛素作用通路中相关蛋白酪氨酸磷 酸化水平中的作用越来越受到重视， 成为治疗 II 型糖尿病的新途径。PTPase 包括一大族 跨膜 ( 受体型 ) 和胞内 ( 非受体型 ) 酶， 参与调控一系列重要生命过程。目前， 对 PTPase 在胰岛素通路中受体或受体后环节影响正常胰岛素作用的研究， 主要集中在 LAR-PTPase、 SHPTP-2、 PTP1B。 0004 PTP1B 是最早被纯化和确定生物学特性的 PTPase， 全长大约 50KD。早期研究证 明能。
11、在体外有效地将胰岛素受体去磷酸化 ； 随后发现 PTP1B 在所有胰岛素敏感组织中高 表达 ； 最近有研究表明， PTP1B 直接与激活状态的 IR 相互作用 ； PTP1B 能够负调控胰岛素 信号转导通路并主要作用于胰岛素受体。更重要的实验证据来自 PTP1B 基因敲除小鼠。 Elchebly 等报道， 运用同源重组的方法产生的 PTP1B 基因敲除的小鼠生长正常， 有生殖力， 对胰岛素敏感性显著增强， 而且这一增强作用与肝脏和骨骼肌中胰岛素受体及胰岛素 受 体底物 1 磷酸化水平的增强相关 Elchebly M. 等 .Science， 283， 1544-1548。令人惊奇 的是， PT。
12、P1B 基因敲除的小鼠对食物诱导的体重增加和胰岛素抵抗也有抵抗作用。Klaman 等运用大致相同的方法产生的 PTP1B 基因敲除的小鼠也得到同样的结果， 而且发现 PTP1B 基因敲除的小鼠之所以对食物诱导的体重增加有抵抗作用， 是由于脂肪细胞体积的减少， 而脂肪细胞的数量并不改变。PTP1B 基因敲除的小鼠基本代谢水平和总体能量消耗升高 Klaman L.D.等.Molecular and Cellular Biology， 20(15) ： 5479-5489。 这些实验更加 有力地证明了 PTP1B 在胰岛素敏感性、 能量消耗和脂肪储存方面的重要作用， 从而更加明 确了它是治疗 II 。
13、型糖尿病和肥胖症的一个潜在药物作用靶点。 0005 PTP1B 选择性抑制剂的研究取得了一定的进展， 但大多局限于一些肽类或非肽类 化合物， 例如基于 PTP1B 去磷酸化的底物序列设计的抑制剂 EEDE(F2PMP)M(Ki 7.2nM)、 Glu-F2PMP-F2PMP(IC50 40nM)， 虽然这些肽类抑制剂具有较强的抑制活性及较高的选择 说 明 书 CN 102731277 B 3 2/6 页 4 性， 但它们是肽类磷酸化合物的事实使其很难成为药物候选化合物。最近， 一系列非肽类 非磷酸化合物类 PTP1B 抑制剂被报道， 它们具有一定的选择性， 更重要的是， 其中一些化 合物对降低。
14、 ob/ob 小鼠血浆中葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这是第一例药理学的直 接证据， 证明 PTP1B 抑制剂具有抗糖尿病活性 Malamas， M.S. 等 .J.Med.Chem.， 2000， 43， 1293-1310。这些无疑为寻找新的小分子非肽类有机化合物作为高效、 高选择性 PTP1B 抑 制剂提供了机遇。 发明内容 0006 文献检索表明， 从豆荚软珊瑚属软珊瑚Lobophytum cristatum中分离得到的豆荚 甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素是结构新颖的二萜类化合物。 经体外抗蛋白酪氨酸磷酸 酯酶 1B(PTP1B) 活性筛选实验表明， 豆荚甲素、 乙素、 丙。
15、素、 丁素、 戊素或己素对 PTP1B 具有 显著的抑制活性。 0007 因此， 本发明的一个目的是提供一类从豆荚软珊瑚属软珊瑚 Lobophytum cristatum 中分离得到的结构新颖二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素。 0008 本发明的另一目的是提供上述豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素的制备方 法。 0009 本发明的又一目的是提供上述豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素在制备药 物中的用途。具体地， 包括其在制备蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B(PTP1B) 抑制剂的药物中的用 途 ； 在制备胰岛素增敏剂的药物中的用途 ； 从而在制备治疗 。
16、II 型糖尿病、 肥胖症及其并发 症的药物中的用途。 0010 本发明提供的豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素具有如下的化学结构式 ： 其 中，“ ” 表示该位置手性碳的构型为 R 型或 S 型。 0011 0012 上述的 6 个化合物为结构新颖的化合物， 分别命名为豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素。 0013 本发明还提供了上述的二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的 制备方法， 具体地， 是从豆荚软珊瑚属软珊瑚 L.cristatum 中提取分离化合物豆荚甲素、 乙 素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的方法， 步骤如下 ： 说 明 书 CN 。
17、102731277 B 4 3/6 页 5 0014 步骤 1)- 提取 ： 0015 将软珊瑚 Lobophytum cristatum 用酮溶剂提取， 所得提取液浓缩后得粗浸膏 ； 将 该粗浸膏溶于水中， 混悬均匀后用乙醚萃取， 所得萃取液浓缩后得到乙醚浸膏 ； 0016 步骤 2)- 分离 ： 0017 将步骤 1) 中得到的乙醚浸膏进行硅胶柱层析， 以石油醚 / 乙醚进行梯度洗脱 ； 其 中， 体积比为955的石油醚/乙醚的洗脱部分， 经进一步硅胶柱层析， 以体积比为982 的石油醚/乙醚洗脱， 分离出豆荚丙素和丁素 ； 体积比为9010的石油醚/乙醚洗脱部分， 经进一步硅胶柱层析， 。
18、以体积比为 95 5 的 石油醚 / 乙醚洗脱后采用填料为 ODS-C18反相 材料、 流动相为甲醇 / 水的半制备高效液相色谱分离得到豆荚甲素、 乙素、 戊素和己素 ； 0018 在步骤 1) 中， 所述酮溶剂为丙酮， 所述的提取是采用超声提取。 0019 在所述步骤 2) 中， 所述石油醚 / 乙醚梯度洗脱是以石油醚 / 乙醚的体积比为 100 0 95 5 90 10 80 20 50 50 20 80 0 100 进行梯度洗脱。 0020 本发明对所得豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素进行了蛋白酪氨酸磷酸酯 酶 1B 抑制活性实验， 表明其对 PTP1B 有明显的抑制活性，。
19、 因而其为 PTP1B 抑制剂和胰岛素 增敏剂。因此， 本发明还提供了豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素在制备治疗 II 型糖 尿病、 肥胖症及其并发症的药物中的用途。 0021 本发明还提供一种药物组合物， 其含有一种或多种治疗有效量的所述的二萜类化 合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素作为有效成分， 并含有常规药用载体。 具体实施方式 0022 下面结合实施例对本发明作进一步阐述， 但本发明不限于此。 0023 用 Varian Mercury 400 型核磁共振仪测定 1H 和13C-NMR ； 用 Finnigan-MAT-95 型 质谱仪测定MS(EIMS及。
20、HREIMS) ； 用Perkin-Elmer241MC型偏光计测定旋光值 ； 所使用的硅 胶为青岛海洋化工厂生产 ； 各种溶剂均由国药集团试剂有限公司生产， 均为分析纯。 0024 如无特殊说明， 以下实施例中涉及到的液 / 液之间比值均为体积比。 0025 实施例 1 ： 二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的制备 0026 (1) 提取 ： 将干重为 210.0g 的中国南海豆荚软珊瑚属软珊瑚 Lobophytum cristatum用丙酮(3000ml)超声提取3次， 提取液合并后减压浓缩得到粗浸膏， 将所得粗浸 膏混悬于 500ml 水中。以乙醚 (1000ml。
21、) 萃取该混悬液 3 次， 所得萃取液合并后减压浓缩得 到乙醚浸膏 5.4g。 0027 (2)分离 ： 乙醚浸膏5.4g经200-300目硅胶柱层析， 用石油醚/乙醚(100095 590108020505020800100)进行梯度洗脱， 每个梯度的洗脱液用量 为1000ml。 其中， 石油醚/乙醚(9010)洗脱液浓缩物得625.3mg， 该部分经硅胶柱层析， 用石油醚 / 乙醚 95 5 洗脱， 继而经半制备高效液 相色谱分离， 填料为 ODS-C18反相材料， 用甲醇 / 水 98 2 洗脱， 分别得到豆荚甲素 11.7mg， 豆荚乙素 10.6mg， 豆荚戊素 7.7mg 和 豆荚。
22、己素 8.5mg ； 石油醚 / 乙醚 (95 5) 洗脱液浓缩物得 274.1mg， 该部分经硅胶柱层析， 用石油醚 / 乙醚 (98 2) 洗脱， 得到豆荚丙素 9.0mg 和豆荚丁素 8.8mg。 0028 豆荚甲素 (Lobophytumi nA) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25+116(c1.10， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)6.02(1H， s， H-14)， 5.78(1H， d， J 15.9Hz， H-5)， 说 明 书 CN 102731277 B 5 4/6 页 6 5.18(1H， dd， J 15.9， 9.9Hz， H。
23、-6)， 5.10(1H， m， H-1)， 4.76(1H， brs， H-16b)， 4.74(1H， brs， H-16a)， 2.51(1H， dd， J 15.4， 3.9Hz， H-12b)， 2.36(1H， m， H-8b)， 2.26(1H， m， H-9b)， 2.20(1H， m， H-9a)， 2.11(3H， s， H3-20)， 2.07(3H， m， H-3a， H-3b， H-11)， 2.05(1H， m， H-12a)， 2.04(1H， m， H-7)， 1.97(1H， m， H-8a)， 1.85(3H， s， H3-19)， 1.55(1H， m， 。
24、H-2b)， 1.49(3H， s， H3-17)， 1.38(1H， m， H-2a)， 0.87(3H， d， J 6.7， H3-18) ； 13CNMR( 见表 1) ； HREIMS m/z 286.2281. 0029 豆荚乙素 (Lobophytumin B) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25+46.6(c 1.10， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)5.78(1H， d， J 16.0Hz， H-5)， 5.16(1H， dd， J 15.9， 9.8Hz， H-6)， 5.10(1H， m， H-1)， 4.76(1H， brs， H-。
25、16b)， 4.74(1H， brs， H-16a)， 2.51(1H， m， H-12b)， 2.36(1H， m， H-8b)， 2.26(1H， m， H-9b)， 2.26(2H， d， J 6.6Hz， H2-14)， 2.20(1H， m， H-9a)， 2.11(3H， s， H3-20)， 2.07(3H， m， H-3a， H-3b， H-11)， 2.05(1H， m， H-12a)， 2.04(1H， m， H-7)， 1.97(1H， m， H-8a)， 1.55(1H， m， H-2b)， 1.49(3H， s， H3-17)， 1.38(1H， m， H-2a)， 。
26、0.89(3H， d， J 7.0， H3-19)， 0.88(3H， d， J 7.0， H3-20)， 0.87(3H， d， J 6.7， H3-18) ； 13C NMR( 见表 1) ； HREIMS m/z288.2447. 0030 豆荚丙素 (Lobophytumin C) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25-36.6(c 0.45， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)5.13(1H， m， H-14)， 4.80(1H， brs， H-18b)， 4.74(1H， brs， H-18a)， 4.71(1H， brs， H-16b)， 4.4。
27、4(1H， brs， H-16a)， 2.31(1H， m， H-3b)， 2.13(2H， m， H2-13)， 2.08(2H， m， H2-12)， 2.01(1H， m， H-3a)， 1.95(1H， m， H-7)， 1.81(1H， m， H-5)， 1.69(3H， s， H3-19)， 1.62(3H， s， H3-20)， 1.61(2H， m， H2-8)， 1.59(1H， m， H-6b)， 1.58(2H， m， H2-2)， 1.53(1H， m， H-9b)， 1.51(1H， m， H-9a)， 1.45(1H， m， H-1b)， 1.27(1H， m， H。
28、-6a)， 1.26(1H， m， H-1a)， 0.76(3H， s， H3-17) ； 13C NMR( 见 表 1) ； HREIMS m/z 272.2488. 0031 豆荚 T 素 (Lobophytumin D) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25+7.2(c0.48， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)5.32(1H， brs， H-3)， 5.13(1H， m， H-14)， 4.80(1H， brs， H-18b)， 4.74(1H， brs， H-18a)， 2.13(2H， m， H2-13)， 2.09(1H， m， H-2b)， 。
29、2.07(2H， m， H2-12)， 1.96(1H， m， H-2a)， 1.95(1H， m， H-7)， 1.91(1H， m， H-5)， 1.78(1H， m， H-6b)， 1.70(3H， s， H3-19)， 1.62(3H， s， H3-20)， 1.61(3H， s， H3-16)， 1.56(2H， m， H2-8)， 1.35(2H， m， H2-9)， 1.45(1H， m， H-1b)， 1.19(1H， m， H-1a)， 1.15(1H， m， H-6a)， 0.90(3H， s， H3-17) ； 13C NMR( 见表 1) ； HREIMS m/z 27。
30、2.2488. 0032 豆荚戊素 (Lobophytumin E) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25+61.5(c 0.53， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)6.03(1H， s， H-14)， 4.72(1H， brs， H-16b)， 4.69(1H， brs， H-16a)， 2.52(1H， m， H-3b)， 2.44(1H， dd， J 15.2， 2.6Hz， H-12b)， 2.41(1H， m， H-5)， 2.32(1H， m， H-1)， 2.26(1H， m， H-3a)， 2.13(3H， s， H3-20)， 2.09(1。
31、H， m， H-12a)， 1.91(1H， m， H-2b)， 1.86(3H， s， H3-19)， 1.85(1H， m， H-8b)， 1.72(1H， m， H-11)， 1.63(1H， m， H-7)， 1.60(1H， m， H-8a)， 1.59(1H， m， H-2a)， 1.52(1H， m， H-6)， 1.00(3H， s， H3-17)， 0.85(3H， d， J 6.2， H3-18) ； 13C NMR( 见表 1) ； HREIMS m/z 286.2296. 0033 豆荚己素 (Lobophytumin F) 的理化性状如下 ： 无色油状物 ； D25+。
32、52.2(c 0.43， CHCl3) ； 1H NMR(CDCl 3， 300MHz)4.73(1H， brs， H-16b)， 4.69(1H， brs， H-16a)， 说 明 书 CN 102731277 B 6 5/6 页 7 2.53(1H， m， H-3b)， 2.44(1H， m， H-5)， 2.43(1H， dd， J 15.3， 2.7Hz， H-12b)， 2.32(1H， m， H-1)， 2.27(1H， m， H-3a)， 2.24(2H， d， J 6.6Hz， H-14)， 2.13(1H， m， H-12)， 2.12(1H， m， H-12a)， 1.92。
33、(1H， m， H-2b)， 1.82(1H， m， H-8b)， 1.74(1H， m， H-11)， 1.63(1H， m， H-7)， 1.60(1H， m， H-8a)， 1.55(1H， m， H-2a)， 1.46(1H， m， H-6)， 0.99(3H， s， H3-17)， 0.90(3H， d， J 6.5， H3-20)， 0.89(3H， d， J 6.5， H3-19)， 0.84(3H， d， J 6.4， H3-18) ； 13C NMR( 见表 1) ； HREIMS m/z 288.2459. 0034 表 1 豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的。
34、 13C NMR 数据 0035 0036 实施例 2 ： 二萜类化合物豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的 PTP1B 抑制活 性实验 0037 测试原理 ： 对硝基苯磷酸 (p-Nitrophenyl phosphate， pNPP) 是碱性磷酸酶的可 溶性底物， 在人源蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(hPTP1B) 的催化下， 它脱去一个磷酸根， 生成黄色 说 明 书 CN 102731277 B 7 6/6 页 8 可溶产物对硝基苯酚 (p-Nitrophenol)， 该产物在 410nM 处有光吸收， 通过检测 410nM 处光 吸收的增加可以检测碱性磷酸酶(在本文中特指人源蛋白。
35、酪氨酸磷酸酶1B(hPTP1B)的活 性。 0038 0039 对硝基苯磷酸 对硝基苯酚 0040 标准的测活体系 ： 10mM Tris.Cl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride， 即三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)(pH 7.6)、 10mM pNPP、 2DMSO(dimethyl sulphoxide， 即二甲基亚砜 ) 和 100nM hPTP1B。 0041 测试方法 ： 用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶 PTP1B 是从大肠杆菌中表达并纯化的 GST(glutathione S-transferases， 即谷胱甘肽 S- 转移酶 。
36、) 融合蛋白。采用紫外适用底物 pNPP， 观察不同化合物对重组的 PTP1B 活性的抑制作用， 以初步评价化合物的药用效果。临 用前将样品溶于 DMSO 配成适当浓度， 如 3 倍稀释或 7 倍稀释度的样品溶液， 设置三复孔， 取 2L 样品溶液加入 96 孔板， 然后加入 88L 测试混合物 (assay mix)( 测试缓冲液 (assay buffer)78L、 10pNPP(2685M)10L)， 再加入 10L PTP1B。将 96 孔板置于 VERSAmax 上动态检测波长为 410nm 处的 Vmax值， 时间为 3 分钟， 其动力学曲线一级反应的斜率作为酶 的活性指标。通过下。
37、面的公式计算样品的抑制率 ( ) ： 0042 抑制率 ( ) 1-Vmax( 待测样品 )/Vmax( 空白对照 )100 0043 实验结果的评判与解释 ： 根据化合物浓度为 10g/ml 时对酶活性的抑制率 ( ) 来评价其对PTP1B的抑制活性。 抑制率()高于50时， 按常规筛选(将抑制率高于50 的被检测化合物稀释成不同的浓度， 依上述测试方法进行反应， 所有试验均设置复孔 ) 得 出 IC50， 阳性对照正钒酸钠的 IC50为 2M。实验结果如表 2 所示。 0044 表 2 豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素的 PTP1B 抑制活性 0045 化合物 豆荚甲素 豆荚乙素 豆荚丙素 豆荚丁素 豆荚戊素 豆荚己素 IC50(g/ml) 3.450.03 4.441.22 1.690.11 2.110.23 3.020.75 6.880.30 0046 结论 ： 豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素和己素均对 PTP1B 显示不同程度的抑制活 性。因此， 豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素可作为 PTP1B 抑制剂和胰岛素增敏剂， 从 而可将豆荚甲素、 乙素、 丙素、 丁素、 戊素或己素用于制备治疗 II 型糖尿病、 肥胖症及其并 发症的药物中。 说 明 书 CN 102731277 B 8 。