一种表达双基因的真核表达载体.pdf

本发明公开了一种表达双基因的真核表达载体。该载体，其序列其序列含有植酸酶基因表达盒和人粘病毒抗性基因1表达盒。本发明的表达载体在细胞水平上验证了含双基因的表达载体的表达效率几乎和两单基因组表达效率相当。本发明的含双基因的AMP质粒转染猪PK15细胞及制备转基因小鼠，通过定量PCR检测出AMP的表达双基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率几乎和两单基因组表达效率相当。

1、  表达双基因的真核表达载体，其序列含有植酸酶基因表达盒和人粘病毒抗性基因1表达盒。

2、  根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述植酸酶基因表达盒是由依次串联的CMV启动子、植酸酶基因和BGH终止子组成；所述人粘病毒抗性基因1表达盒由依次串联的CMV启动子、人粘病毒抗性基因1和BGH终止子组成；所述植酸酶基因具有GENBANK号为AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK号为BC032602的自5′端第292-2280位核苷酸序列；所述CMV启动子具有GENBANK号为X03922的自5′端第541-1128位核苷酸序列；所述BGH终止子具有GENBANK号为FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列。

3、  根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述表达双基因的真核表达载体是以pcDNA3.1(+)载体为出发载体构建得到。

4、  根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述表达双基因的真核表达载体的核苷酸序列为序列表中序列1。

一种表达双基因的真核表达载体
技术领域
本发明涉及一种表达双基因的真核表达载体。
背景技术
在通过过表达技术研究基因功能及转基因动物制备过程中，我们往往借助真核表达载体来实现，传统的方法就是通过分子生物学手段将目的基因片段连接到真核启动子下游，整合到细胞基因组中后能指导外源基因表达。该方法在基因表达及功能的研究中有着极其广泛的应用，但该研究手段也有不足的一方面：现在的研究很多情况下可能需要研究多基因之间相互作用关系，如果通过表达单一基因的真核表达载体来研究，则需要分别构建多个载体，在细胞水平上的研究必然要多次转染并分别筛选才能得到同时整合多个基因的细胞。同样，在转基因动物中要制备转不同基因的动物时，首先必须分别制备单基因转基因动物，并分别筛选纯合子，然后纯合子之间交配得到能同时表达多个基因的后代，上述方法不但研究周期长、操作繁琐而且耗费高。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达双基因的真核表达载体。
本发明所提供的表达双基因的真核表达载体，其序列含有植酸酶基因表达盒和人粘病毒抗性基因1表达盒。
所述植酸酶基因表达盒是由依次串联的CMV启动子、植酸酶基因(appA)和BGH终止子组成；所述人粘病毒抗性基因1表达盒由依次串联的CMV启动子、人粘病毒抗性基因1(Mx1)和BGH终止子组成；所述植酸酶基因具有GENBANK号为AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK号为BC032602的自5′端第292-2280位核苷酸序列；所述CMV启动子具有GENBANK号为X03922的自5′端第541-1128位核苷酸序列；所述BGH终止子具有GENBANK号为FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列。
所述表达双基因的真核表达载体是以pcDNA3.1(+)载体为出发载体构建得到。所述表达双基因的真核表达载体的核苷酸序列优选为序列表中序列1。
本发明通过高保真酶扩增出含启动子、目的基因及终止子的完整真核表达调控区域，连接到另外一个真核表达载体上，构建出各自含表达调控基因的多基因真核表达载体。本发明的表达双基因的真核表达载体的可同时高效表达植酸酶基因(appA)、人粘病毒抗性基因1(Mx1)。
本发明的表达载体在细胞水平上验证了含双基因的表达载体的表达效率几乎和两单基因组表达效率相当。本发明的含双基因的AMP质粒转染猪PK15细胞及制备转基因小鼠，通过定量PCR检测出AMP的表达双基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率几乎和两单基因组表达效率相当。本发明的载体显著优势表现在多个基因过表达时于不影响各自表达效率的前提下，实现两个基因功能，为制备转联合基因动物等提供一种便捷的手段。
附图说明
图1：PCR扩增appA产物电泳图；
图2：pcDNA-appA质粒图谱；
图3：PCR扩增Mx1产物电泳图；
图4：pcDNA-Mx1质粒图谱；
图5：pcDNA-appA-Mx(AMP)质粒图谱；
图6：菌液PCR检测AMP重组质粒；
图7：各组细胞中appA表达水平；
图8：各组细胞中Mx表达水平；
图9：AMP转基因鼠PCR检测外源基因；
图10：AMP转基因鼠SOUTHERN BLOT检测外源基因；
图11：半定量检测appA及Mx的表达电泳图
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
实施例1、表达双基因的载体的构建
1、单基因表达载体基本构件的获得
(1)真核表达载体pcDNA-appA的制备
以大肠杆菌DH5α(购自北京全式金公司，货号CD201)为模板，以表1中列举的扩增appA的引物扩增植酸酶基因(appA)片段(GENBANK号为AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列)和BGH终止子片段(具有GENBANK号为FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列)。反应体系为反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL2.5mM dNTP、1μL 20μM引物appA-L1、1μL 20μM引物appA-R1(引物序列见表1)、0.5μL5U/μL高保真Tag聚合酶，2μl大肠杆菌DH5α做模板，加超纯水至50μL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序：98℃10s，68℃2min，循环30次。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图1所示)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用HindIII、EcoR I双酶切纯化产物；同时用HindIII、EcoR I双酶切pcDNA3.1(+)载体(购自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5α(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有appA和BGH终止子的载体，提取质粒备用，将该测序表明正确的质粒命名为pcDNA-appA(质粒图谱如图2所示)。
(2)真核表达载体pcDNA-Mx1的制备
以人cDNA(以提取专利人血液提取总RNA，反转录而来)为模板，以表1中列举的扩增Mx1的引物扩增人粘病毒抗性基因1(Mx1)片段(GENBANK号为BC032602的自5′端第292-2280位核苷酸序列)。反应体系为反应体系为50μl，5μL10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物Mx-L1、1μL 20μM引物Mx-R1(序列见表1)、0.5μL5U/μL高保真Tag聚合酶，100ng人cDNA为模板，加超纯水至50μL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序：98℃10s，68℃2min，，循环30次。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用HindIII、EcoR I双酶切纯化产物；同时用HindIII、EcoR I双酶切pcDNA3.1(+)载体(购自invitrogen公司)；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5α(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；选取测序结果表明含有Mx1表达盒的载体，提取质粒备用，将该测序表明正确的质粒命名为pcDNA-Mx1(质粒图谱如图4所示)。
2、双基因表达载体AMP构建
以pcDNA-appA(质粒图谱如图2所示)为模板，以表1所列的引物扩增表1所列的相应构件。5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物CMVappA-L1、1μL20μM引物CMVappA-R1(序列见表1)、0.5μL5U/μL高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA质粒，加超纯水至50μL(高保真酶购自大连宝生物，货号DR010A)。PCR扩增程序：98℃10s，68℃3min，，循环30次。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物部分测序(invitrogen公司)；测序结果表明扩增得到的CMV-appA-BGH pA片段；CMV-appA-BGH pA片段由依次串连的CMV启动子、appA和BGH终止子组成；其中CMV启动子具有GENBANK号X03922的自5′端第541-1128位核苷酸的序列；植酸酶基因具有GENBANK号为AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列(appA基因)。所述BGH终止子具有GENBANK号为FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列。
上述PCR产物CMV-appA-BGH pA片段用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)，用Mlu I酶切纯化产物；同时用Mlu I单酶切pcDNA-Mx1质粒；将PCR扩增产物和酶切后的载体连接(连接酶购自promega公司，货号M1804)；按公司要求操作步骤转化DH5α(购自北京全式金公司，货号CD201)感受态大肠杆菌；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37℃培养箱中培养过夜。
挑单菌落接种于液体LB培养基中培养，菌液PCR检测插入片段中CMV-appA-BGHpA片段(扩增体系同上扩增CMV-appA-BGH pA片段部分(引物见表1)，其中模板改为菌液2微升)，结果见图6，可见7号及12号泳道中有对应的CMV-appA-BGH pA片段扩增条带，将上述两样的部分菌液送公司测序(invitrogen北京公司)；结果表明获得含有CMV-appA-BGH pA片段和Mx1表达盒的重组表达载体，将该载体命名为pcDNA-appA-Mx，简称为AMP。测序表明，AMP具有序列表中序列1的核苷酸序列，其序列中含有appA表达盒和Mx1表达盒，其中appA表达盒由依次串联的CMV启动子、植酸酶基因(appA)和BGH终止子组成；Mx1表达盒由依次串联的CMV启动子、人粘病毒抗性基因1(Mx1)和BGH终止子组成；CMV启动子具有GENBANK号X03922的自5′端第541-1128位核苷酸的序列(对应自序列表中序列1的5′端第232-819位核苷酸序列和自序列表中序列1的5′端第2675-3262位核苷酸序列)；植酸酶基因(appA基因)具有GENBANK号为AF537219的自5′端第10-1308位核苷酸序列(对应自序列表中序列1的5′端第917-2221位核苷酸序列)；人粘病毒抗性基因1具有GENBANK号为BC032602的自5′端第292-2280位核苷酸序列(对应自序列表中序列1的5′端第3360-5438位核苷酸序列)。所述BGH终止子具有GENBANK号为FJ495179的自5′端第5596-5881位核苷酸序列(对应自序列表中序列1的5′端第2292-2577位核苷酸序列和自序列表中序列1的5′端第5425-5710位核苷酸序列)。AMP的质粒图谱如图5所示。
表1：本发明中用于扩增载体构件的引物


实施例2、本发明的含双基因真核表达载体的细胞水平表达检验
1、冻存细胞的复苏与培养
pcDNA-appA、pcDNA-Mx1及AMP质粒用ScaI大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。
从液氮中取出装有猪PK15细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在1-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mL完全培养基，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。
2、细胞转染与筛选
将猪PK15细胞系细胞(购自中国科学院细胞库)分为四组(转染空pcDNA质粒组、转染AMP质粒组、转染pcDNA-Mx1组及转染pcDNA-appA组)，每组3个重复。
转染前1天，向每孔含10％胎牛血清(购自GIBCO公司，货号：21640-079)的500μLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)的24孔板中分别接种0.5-2×10⁵个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95％的汇合；用50μL的无血清、无抗生素的培养基分别稀释0.8μg待转染DNA(其中，转染空pcDNA质粒组使用ScaI线性化的pcDNA，转染AMP质粒组使用ScaI线性化AMP质粒，转染pcDNA-Mx1组使用ScaI线性化的pcDNA-Mx1质粒，转染pcDNA-appA组使用ScaI线性化的pcDNA-appA质粒)，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2μLlipefectaminTM-2000加入50μL的无血清、无抗生素的DMEM培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)并轻轻混匀，于室温孵育5min；5min后，分别将50μL的各组DNA稀释液加入50μL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min；将100μL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养，于4-6h后用完全培养基代替转染培养基，在后代培养中，于细胞培养液中加入G418(购自Gibco，货号：11811-023)，筛选两周。
3、转染细胞表达量鉴定
1)细胞总RNA提取及cDNA的制备
按照试剂盒(购自北京天跟公司，货号：DP430)操作说明，提取上述转染空pcDNA质粒组、转染AMP质粒组、转染pcDNA-Mx1组及转染pcDNA-appA组细胞总RNA；按照TOYOBO反转录试剂盒(购自TOYOBO公司，货号：FSK-100)，将提取的总RNA反转录成cDNA。
2)荧光定量PCR检测
以1)中制备的cDNA为模板，梯度稀释模板验证选定最佳模板浓度，以猪GAPDH基因为内参(引物为mGAPDH-L1和mGAPDH-R1)，进行荧光定量PCR测定appA(appA引物为表1所示的appA-RTL1和appA-RTR1)、Mx1(Mx1引物为表1所示的hMx1-RTL1和hMx1-RTR1)表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20μl，10μL 2×Mixturer(TAKARA，货号DRR041A)、1μL 20μM上游引物、1μL20μM下游引物、1微升cDNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环40次，最后72℃延伸5min。
荧光定量检测结果如图7、图8所示，在进行MX1表达水平检测时，以转pcDNA质粒对照组为基准，转pcDNA-MX1组及AMP组的表达水平平均为对照组的37.27倍和39.37倍；进行appA表达水平检测时，以转pcDNA质粒对照组为基准，转pcDNA-appA组合，AMP组的表达水平分别是对照组的32.27倍和39.07倍，转染AMP基因组能有效高表达appA及Mx1基因，且单基因载体和双基因载体表达效率不能从细胞水平鉴定出差异(P＜0.05)。(图中纵坐标是定量PCR仪显示的格式，以log₁₀值为单位，各组的值为每组目的基因的表达水平和内参的表达水平的比值。以对照组细胞相应基因表达为参照基数0，其余各组表达水平值为对照组相应基因表达的倍数)
实施例3、含双基因真核表达载体制备的转基因动物的检验
(1)AMP转基因小鼠的制备
将线性化AMP载体利用体内精原干细胞介导的的转基因动物制备的方法(采用李碧春、孙国波等，体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡，中国科学C辑：生命科学，2008，38，626-634)，制备出含AMP的转联合基因小鼠。
(2)转基因小鼠的整合检测
分别利用appA、Mx1定量检测引物(见表1，同细胞表达检测时appA、Mx1定量检测引物)检测转基因小鼠基因组DNA中相应基因的整合检测步骤1)获得的转联合基因小鼠后代小鼠中外源基因的整合情况。
PCR反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM引物PL、1μL20μM引物PR、0.5μL5U/μL高保真Tag聚合酶，100ng pcDNA-appA质粒，加超纯水至50μL。PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环30次，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1.6％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出分别能扩增出appA及Mx1基因的鼠为基因真核鼠(图9)(图中，+：阳性对照，AMP质粒DNA为模板；-：阴性对照，正常鼠DNA为模板；1-16：为转基因后代鼠扩增条带，上图可见1-16号鼠能扩增出355bp左右的条带，和预期扩增的appA条带一致；下图可见1-16号鼠能扩增出355bp左右的条带，和预期扩增Mx1条带325bp一致；扩增产物送公司测序分别和appA及Mx1序列一致)。
以表1中检测appA及Mx1的引物为引物，按照试剂盒操作说明书体系加样；PCR运行程序如下：95℃5min，94℃45S，56℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min(探针标记试剂盒购自innogen-cn公司，货号：DDLK-010)。
以PCR产物为探针进行southen杂交检测，杂交前在95℃变性5分钟后立即冰水中放置10分钟备用；大量抽提小鼠尾组织DNA，用HindIII及Not I双酶切基因组，浓缩基因组酶切产物之300ng/μl；于1％琼脂糖凝胶电泳分离各酶切片段，每孔上样50微升；然后使DNA原位变性后转移到带正电荷尼龙膜上。按照试剂盒操作说明进行预杂交、杂交及X-光片曝光检测杂交信号(购自innogen-cn公司，货号：DIGD-210)。检测结果(图10)表明，PCR检测阳性鼠样，southern杂交检测相应鼠能检测出相应调带，说明1-16号样品所代表的转基因鼠为双基因整合鼠。图10中k为正常饲养鼠(非转基因鼠)。
(3)小鼠血液总RNA提取及cDNA的制备
从2)中筛出的阳性转基因小鼠尾部采集100微升血液，按照天根血液总RNA提取试剂盒(货号：DP433)操作说明，提取各组细胞总RNA；按照TOYOBO反转录试剂盒(货号：FSK-100)，将提取的总RNA反转录成cDNA.
(4)AMP转基因小鼠半定量PCR检测
以(3)中制备的cDNA为模板，分别以appA、Mx1及小鼠beta-actin基因为内参(扩增方法如实施例1的步骤1(引物见表1))，进行半定量PCR测定，PCR反应体系为50μl，5μL 10×Buffer、8μL 2.5mM dNTP、1μL 20μM上游引物、1μL 20μM下游引物(扩增appA、Mx1及小鼠beta-actin的引物分别是表1中appA-RTL1、appA-RTR1，hMx1-RTL1、hMx1-RTR1及actin-RTL1、actin-RTR1)、0.5μL5U/μL高保真Tag聚合酶，100ng pcDNA-appA质粒，加超纯水至50μL。
PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，，最后72℃延伸5min，内参beta-actin扩增时23个循环，其他模板扩增32个循环。
PCR扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测(图11)。半定量结果表明，2、5、7、10、15泳道扩增出阳性条带，而且在appA和Mx1阳性结果相一致，说明对应的AMP整合阳性鼠能同时表达appA和Mx1基因。
序列表
<160>1
<210>1
<211>9825
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg    60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc    900
gtttaaactt aagcttatga aagcgatctt aatcccattt ttatctcttc tgattccgtt    960
aaccccgcaa tctgcattcg ctcagagtga gccggagctg aagctggaaa gtgtggtgat    1020
tgtcagtcgt catggtgtgc gtgctccaac caaggccacg caactgatgc aggatgtcac    1080
cccagacgca tggccaacct ggccggtaaa actgggttgg ctgacaccgc gcggtggtga    1140
gctaatcgcc tatctcggac attaccaacg ccagcgtctg gtagccgacg gattgctggc    1200
gaaaaagggc tgcccgcagt ctggtcaggt cgcgattatt gctgatgtcg acgagcgtac    1260
ccgtaaaaca ggcgaagcct tcgccgccgg gctggcacct gactgtgcaa taaccgtaca    1320
tacccaggca gatacgtcca gtcccgatcc gttatttaat cctctaaaaa ctggcgtttg    1380
ccaactggat aacgcgaacg tgactgacgc gatcctcagc agggcaggag ggtcaattgc    1440
tgactttacc gggcatcggc aaacggcgtt tcgcgaactg gaacgggtgc ttaattttcc    1500
gcaatcaaac ttgtgcctta aacgtgagaa acaggacgaa agctgttcat taacgcaggc    1560
attaccatcg gaactcaagg tgagcgccga caatgtctca ttaaccggtg cggtaagcct    1620
cgcatcaatg ctgacgaaga tatttctcct gcaacaagca cagggaatgc cggagccggg    1680
gtggggaagg atcaccgatt cacaccagtg gaacaccttg ctaagtttgc ataacgcgca    1740
attttatttg ttacaacgca cgccagaggt tgcccgcagc cgcgccaccc cgttattaga    1800
tttgatcaag acagcgttga cgccccatcc accgcaaaaa caggcgtatg gtgtgacatt    1860
acccacttca gtgctgttta tcgccggaca cgatactaat ctggcaaatc tcggcggcgc    1920
actggagctc aactggacgc ttcccggtca gccggataac acgccgccag gtggtgaact    1980
ggtgtttgaa cgctggcgtc ggctaagcga taacagccag tggattcagg tttcgctggt    2040
cttccagact ttacagcaga tgcgtgataa aacgccgctg tcattaaata cgccgcccgg    2100
agaggtgaaa ctgaccctgg caggatgtga agagcgaaat gcgcagggca tgtgttcgtt    2160
ggcaggtttt acgcaaatcg tgaatgaagc acgcataccg gcgtgcagtt tgtaagaatt    2220
ctgcagatat ccagcacagt ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg    2280
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc    2340
ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc    2400
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa    2460
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc    2520
tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc    2580
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct    2640
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc acgcgttgac attgattatt gactagttat    2700
taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca    2760
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca    2820
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg    2880
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg    2940
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc    3000
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg    3060
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca    3120
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt    3180
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg    3240
gaggtctata taagcagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc    3300
gaaattaata cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cttaagctta    3360
tggttgtttc cgaagtggac atcgcaaaag ctgatccagc tgctgcatcc caccctctat    3420
tactgaatgg agatgctact gtggcccaga aaaatccagg ctcggtggct gagaacaacc    3480
tgtgcagcca gtatgaggag aaggtgcgcc cctgcatcga cctcattgac tccctgcggg    3540
ctctaggtgt ggagcaggac ctggccctgc cagccatcgc cgtcatcggg gaccagagct    3600
cgggcaagag ctccgtgttg gaggcactgt caggagttgc ccttcccaga ggcagcggga    3660
tcgtgaccag atgcccgctg gtgctgaaac tgaagaaact tgtgaacgaa gataagtgga    3720
gaggcaaggt cagttaccag gactacgaga ttgagatttc ggatgcttca gaggtagaaa    3780
aggaaattaa taaagcccag aatgccatcg ccggggaagg aatgggaatc agtcatgagc    3840
taatcaccct ggagatcagc tcccgagatg tcccggatct gactctaata gaccttcctg    3900
gcataaccag agtggctgtg ggcaatcagc ctgctgacat tgggtataag atcaagacac    3960
tcatcaagaa gtacatccag aggcaggaga caatcagcct ggtggtggtc cccagtaatg    4020
tggacattgc caccacagag gctctcagca tggcccagga ggtggacccc gagggagaca    4080
ggaccatcgg aatcttgacg aagcctgatc tggtggacaa aggaactgaa gacaaggttg    4140
tggacgtggt gcggaacctc gtgttccacc tgaagaaggg ttacatgatt gtcaagtgcc    4200
ggggccagca ggagatccag gaccagctga gcctgtccga agccctgcag agagagaaga    4260
tcttctttga gaaccaccca tatttcaggg atctgctgga ggaaggaaag gccacggttc    4320
cctgcctggc agaaaaactt accagcgagc tcatcacaca tatctgtaaa tctctgcccc    4380
tgttagaaaa tcaaatcaag gagactcacc agagaataac agaggagcta caaaagtatg    4440
gtgtcgacat accggaagac gaaaatgaaa aaatgttctt cctgatagat aaaattaatg    4500
cctttaatca ggacatcact gctctcatgc aaggagagga aactgtaggg gaggaagaca    4560
ttcggctgtt taccagactc cgacacgagt tccacaaatg gagtacaata attgaaaaca    4620
attttcaaga aggccataaa attttgagta gaaaaatcca gaaatttgaa aatcagtatc    4680
gtggtagaga gctgccaggc tttgtgaatt acaggacatt tgagacaatc gtgaaacagc    4740
aaatcaaggc actggaagag ccggctgtgg atatgctaca caccgtgacg gatatggtcc    4800
ggcttgcttt cacagatgtt tcgataaaaa attttgaaga gttttttaac ctccacagaa    4860
ccgccaagtc caaaattgaa gacattagag cagaacaaga gagagaaggt gagaagctga    4920
tccgcctcca cttccagatg gaacagattg tctactgcca ggaccaggta tacaggggtg    4980
cattgcagaa ggtcagagag aaggagctgg aagaagaaaa gaagaagaaa tcctgggatt    5040
ttggggcttt ccaatccagc tcggcaacag actcttccat ggaggagatc tttcagcacc    5100
tgatggccta tcaccaggag gccagcaagc gcatctccag ccacatccct ttgatcatcc    5160
agttcttcat gctccagacg tacggccagc agcttcagaa ggccatgctg cagctcctgc    5220
aggacaagga cacctacagc tggctcctga aggagcggag cgacaccagc gacaagcgga    5280
agttcctgaa ggagcggctt gcacggctga cgcaggctcg gcgccggctt gcccagttcc    5340
ccggttagga attctgcaga tatccagcac agtggcggcc gctcgagtct agagggcccg    5400
tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc    5460
cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa    5520
atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg    5580
ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg    5640
gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc    5700
cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac    5760
ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg    5820
ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt    5880
tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc    5940
cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct    6000
tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga    6060
ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga    6120
attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg    6180
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg    6240
ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc    6300
gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca    6360
tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt    6420
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc    6480
ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga    6540
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga    6600
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg    6660
gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga    6720
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt    6780
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct    6840
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct    6900
gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg    6960
agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca    7020
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga    7080
tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt    7140
ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt    7200
ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct    7260
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt    7320
cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca    7380
cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg    7440
gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc    7500
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca    7560
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct    7620
tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg    7680
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata    7740
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca    7800
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc    7860
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg    7920
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta    7980
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc    8040
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag    8100
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac    8160
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc    8220
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt    8280
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc    8340
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga    8400
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta    8460
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta    8520
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga    8580
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc    8640
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg    8700
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag    8760
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg    8820
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt    8880
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca    8940
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca    9000
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc    9060
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt    9120
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg    9180
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc    9240
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg    9300
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga    9360
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga    9420
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta    9480
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg    9540
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact    9600
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata    9660
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt    9720
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa    9780
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc                    9825