技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种Stat1重组表达质粒及其制备方法。
背景技术
Stat1(signaltransducersandactivatorsoftranscription1，信号转导及 转录活化因子1)是细胞因子/生长因子信号转导中中药的胞质转录因子。Stat1有两个亚型 (Stat1α和Stat1β)，Stat1α有两个磷酸化位点(Tyr701和Ser727)，它的剪辑变体Stat1β 有一个磷酸化位点(Ser727)。Stat1与受体结合从而被磷酸化，激活的Stat1转移到核内激 活靶基因的转录，从而在多种肿瘤中发挥作用。
中国专利201310612966.6公开了一种重组载体及其制备方法和应用，其采用酵母 分泌表达载体pPICZaA构建，含有人源CTLA4胞外区基因，可用于表达人源CTLA4融合蛋白； 该重组载体还含有Kex2蛋白酶酶切位点、His标签和c-myc标签，可使得表达的CTLA4融合蛋 白以分泌蛋白的形式释放到胞外，并对蛋白进行纯化，为CTLA4蛋白的工业化生产提供了一 种简便的方法。中国专利2013105616301公开了一种带Myc标签的LAMP1真核表达载体及其 应用，其通过将LAMP1基因与Myc标签蛋白基因构成融合基因，利用载体上的启动子和信号 序列来控制融合基因的表达，然后采用免疫沉淀的方式分离溶酶体，操作简便，富集效率 高，结果易于检测，成本低，可应用于高效的分离溶酶体。中国专利201310750733.2公开了 一种通用型重组表达载体，该表达载体携带有多功能标签的编码基因，所述多种功能标签 为His，c-myc，flag，HA，GST和GFP标签中的至少一种；其还提供了一种通用型重组表达载体 的构建方法和应用，所述构建方法，简单，制备成本低，可用于外源蛋白的生产，便于目的蛋 白的表达、检测、示踪和纯化。但是关于本发明的pStat1α/β-myc/GFP重组质粒，目前还未见 报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供重组质粒pStat1α-myc和pStat1β- myc。
本发明的再一的目的是，如上所述重组质粒的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供重组质粒pStat1α-GFP和pStat1β-GFP。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
重组质粒pStat1α-myc和pStat1β-myc，所述重组质粒pStat1α-myc和pStat1β-myc 是通过将PCR扩增的基因片段Stat1α和Stat1β插入到载体pcDNA4/TO/myc-His酶切位点Kpn I和SacII中制备得到的。
所述基因片段Stat1α是采用如下引物扩增得到的：
所述基因片段Stat1β是采用如下引物扩增得到的：
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述重组质粒pStat1α-myc和pStat1β-myc的制备方法，包含如下步骤：
1)PCR扩增获得Stat1基因；
2)将含有myc-His6片段的载体与步骤1)获得的含Stat1α和Stat1β基因的PCR产物 酶切，酶切回收的产物采用T4DNA连接酶连接；
3)将步骤2)获得的连接产物转化感受态细菌；
4)鉴定阳性克隆，将测序正确的克隆利用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的大 量制备。
所述步骤1)中的PCR扩增使用的PCR引物如下：
所述步骤2)中含有myc-His6片段的载体为质粒pcDNA4/TO/myc-His。
所述步骤2)中采用KpnI和SacII对PCR产物和载体进行双酶切，具体酶切反应体 系如下：10xBuffer6μl，KpnI和SacII各8μl，模板(PCR产物或质粒)8μg，再用去离子水 补足至60μl。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
重组质粒pStat1β-GFP和pStat1β-GFP，所述重组质粒pStat1α-GFP和pStat1β-GFP 是通过如下方法制备得到的：将如上所述的重组质粒pStat1α-myc和pStat1β-myc通过酶 切，再将获得Stat1α和Stat1β酶切片段插入pEGFP-N1的酶切位点BglII和SacII中制备获 得。
所述插入pEGFP-N1中的含有Stat1α和Stat1β的的基因片段是使用限制性内切酶 BglII和SacII对质粒pStat1α-myc和pStat1β-myc进行双酶切制备得到的。
本发明优点在于：
本发明建立Stat1两个亚型α和β的真核表达质粒，其中一组是带有myc和his蛋白 标签的重组质粒，可以用于研究细胞内和Stat1α/Stat1β直接相互作用的蛋白或者核酸分 子的功能；另一组是带有荧光蛋白GFP的重组质粒，可以研究Stat1α/Stat1β蛋白在细胞内 的定位；本发明的重组质粒可用于研究Stat1的两个不同亚型α和β在正常细胞和肿瘤细胞 的增殖、迁移和侵袭的作用，也可用于研究蛋白和蛋白之间的相互作用，具有潜在的临床应 用价值。
附图说明
附图1为Stat1四个重组质粒的质粒图谱，其中a、b、c、d依次为pStat1α-myc、 pStat1β-myc、pStat1α-GFP和pStat1β-GFP。
附图2为琼脂糖凝胶电泳结果，其中a为连接前质粒载体和PCR产物双酶切结果，b 为单克隆扩大培养后提取质粒双酶切鉴定结果。
附图3为293T细胞的质粒转染，蛋白印迹法结果。
附图4为pEGFP、pStat1α-GFP和pStat1β-GFP质粒在293T中的表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所 限定的范围。
实施例1
1试验材料
卵巢癌细胞系(ATCC号：HTB-161)、总RNA提取试剂盒(AxygenAP-MN-MS-RNA-50)、 反转录试剂盒(Roche04897030001)、高保真酶PrimeSTARMaxDNAPolymerase(Takara R045A)、限制性内切酶KpnI(Invitrogen15232-010)、SacII(Invitrogen15240-901)、 BglII(Invitrogen15213-010)、PCR产物回收试剂盒(AxygenAP-PCR-50)、DNA凝胶回收 试剂盒(AxygenAP-GX-50G)、T4DNA连接酶(Invitrogen15224-017)、感受态细胞DH5α (TiangenCB101)、无内毒素质粒大提试剂盒(TiangenDP117)、pcDNA4/TO/myc-His(B) (InvitrogenV1030-20)和pEGFP-N1(Clontech)。
2pStat1α-myc和pStat1β-myc质粒的构建
2.1引物设计
从Genbank数据库中下载人的Stat1的mRNA序列，其中alpha(α)亚型为NM_ 007315.3，beta(β)亚型为NM_139266.2。再结合真核表达质粒pcDNA4/TO/myc-His(B)和 pEGFP-N1的多克隆酶切位点的序列，自行设计合成了扩增Stat1两个亚型CDS区的引物。扩 增引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列见表1。
表1扩增Stat1α和Stat1β全长CDS的引物序列
2.2细胞培养、总RNA提取
将人的卵巢癌细胞系OVCAR-3(ATCC号：HTB-161)按照10^6个细胞接种于T25细胞 培养瓶。待细胞生长融合至80％-90％时，弃掉培养基上清，使用无菌的PBS清洗两次，然后 尽量去除PBS，采用Axygen总RNA提取试剂盒(AxygenAP-MN-MS-RNA-50)裂解细胞提取获得 细胞总RNA。具体步骤如下：
1)将600μl的裂解液bufferR-Ⅰ加入细胞表面并用枪头吹打8～10次，转移裂解的 细胞于无RNA酶的离心管中；
2)使用21-25号针头的注射器抽吸8～10次，充分裂解细胞，加入220μlbufferR- Ⅱ，震荡混匀30s；4℃离心12000g离心10min；
3)吸取上清液于新的无RNA酶的离心管，加入400μl异丙醇充分混匀；
4)用柱子吸附RNA，6000g离心1min；
5)加入bufferW1A溶液500μl，12000g离心1min，清洗一次；
6)加入AW2溶液700μl，12000g离心1min，清洗2次；
7)弃收集管废液后，12000g离心2min去除残留乙醇；
8)用100μlbufferTE(预热至65℃)洗脱获得总RNA。
2.3反转录获得cDNA
采用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesiskit(Roche04897030001)进 行反转录。首先，在500ng的总RNA中加入50mMolig(dT)180.5μl和600mMRandomPrimer1 μl，并用DEPC水补足体积至6.5μl。将该混合液至65℃加热10min，然后立刻至于冰上2min。 再在反应体系中加入5xTranscriptorReactionbuffer2μl，1mMdNTP1μl以及Rnase inhibitor10U，ReverseTranscriptase5U进行反转录。转录条件为25℃10min，55℃ 40min，85℃5min。最后获得cDNA于-20℃冻存备用。
2.4PCR扩增和产物纯化
对Stat1α和Stat1β的全长CDS扩增，采用高保真酶PrimeSTARMaxDNA Polymerase(TakaraR045A)进行扩增。反应体系中包含2×PrimeSTARMaxPremix12.5μl， 上下游引物各10pmol以及模板50ng/μl的cDNA0.5μl，其余使用去离子水补足至25μl。PCR 反应条件：94℃预变性2min；95℃30s，60℃30s，72℃3min运行45个循环，最后在72℃继续延 伸10min获得目的扩增产物。
PCR产物纯化采用AxyPrepPCRclean-upkit(AxygenAP-PCR-50)进行回收。根 据试剂盒的实验手册进行操作，具体实验步骤如下：
1)在PCR反应液中，加3倍体积的BufferPCR-A；混匀后，转移到制备管中，12000g 离心1min，弃收集管滤液；
2)加700μlBufferW2洗涤第一次，12000g离心1min，弃收集管滤液；
3)加500μlBufferW2洗涤第二次，12000g离心1min，弃收集管滤液；
4)12000g离心1min，去除残留的洗涤液；
5)制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备管膜中央加30μl去离子水(预热至65 ℃)，室温静置1min；
6)12000g离心1min洗脱获得纯化产物；
7)使用narodrop2000测定纯化产物的浓度。
2.5PCR纯化产物和质粒载体双酶切，割胶纯化
采用KpnI(Invitrogen15232-010)和SacII(Invitrogen15240-901)对PCR产 物和载体进行双酶切。反应体系为10xBuffer6μl，KpnI和SacII各8μl，模板(PCR产物或 质粒)8μg，再用去离子水补足至60μl。然后置37℃酶切过夜。
酶切后的产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AxygenAP-GX-50G)进行割胶纯 化。具体步骤如下：
1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，并称取凝胶重量，并将该重量换算 作为一个凝胶体积(如1mg＝1μl体积)；
2)加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于50℃加热10min，间断混合(每 2-3min)，直至凝胶块完全熔化；
3)加0.5倍BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；
4)将步骤c中的混合液加入到DNA制备管中，12000g离心1min，弃滤液；
5)加500μlBufferW1，12000g离心30s，弃滤液；
6)加700μlBufferW2，12000g离心30s，弃滤液；
7)以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次12000g离心1min，弃废液；
8)12000g离心1min，去除残留的乙醇；
9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水(预热至65 ℃)，室温静置1min；
10)12000g离心1min洗脱获得纯化的DNA；
11)使用Narodrop2000测定纯化产物的浓度。
2.6双酶切后的PCR和质粒纯化产物连接
酶切回收的PCR产物与载体大片段采用T4DNA连接酶(Invitrogen15224-017)连 接，连接总体积20μl，具体操作步骤如下：
1)按照插入片段与载体大片段的摩尔比3：1，计算插入片段质量：
插入片段(ng)＝插入片段的碱基数×载体大片段的质量(0.1μg)×3/载体大片段 的碱基
其中插入片段Stat1α碱基数为2263bp,Stat1β碱基数为2149bp；
pcDNA4/TO/myc-His(B)酶切大片段为5071bp。
2)连接体系的配置(共20μl)
3)混匀离心，室温放置2h。
2.7连接产物的转化
采用感受态细胞DH5α(TiangenCB101)进行转化实验，具体步骤如下：
1)将感受态细胞DH5α从-80度取出至冰上解冻10min；
2)吸取2.6中连接产物2μl加入100μl感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min；
3)将冰浴后的感受态细胞离心管置42℃水浴加热90s，期间不要摇动管；
4)快速将离心管转移到冰上，使细胞冷却2min；
5)每管加入800μlLB液体培养基(培养基事先加温至37℃)，混匀后37℃，220rpm 振荡培养45min；
6)将适当体积(200ul/90mm平皿)已转化的感受态细胞平铺到含有氨苄青霉素或 者卡那霉素的LB的琼脂平板上，平板放置室温下直至表面液体被吸收。
其中pcDNA4/TO/myc-His(B)质粒转化的细菌接种LB-氨苄青霉素平板，pEGFP-N质 粒转化的细菌接种LB-卡那霉素平板；
7)倒置平皿，于37℃培养箱中培养12～16h。
2.8质粒的鉴定
1)随机挑取5个克隆，根据质粒抗性基因接种于5mlLB-氨苄青霉素或者LB-卡那 霉素液体培养基中，37℃，220rpm振荡过夜培养；
2)采用小量质粒提取试剂盒(TiangenDP103-02)提取重组质粒，步骤简述如下：
a)将5ml菌液收集至离心管底部，尽量去除上清；
b)依次加入溶液P1、P2和P3，离心取上清；
c)将上清液加入收集管中央，吸附后离心；
d)用去蛋白液PD洗涤收集管1次，漂洗液PW洗涤2次；
e)高速离心2～3min，去除残留的漂洗液；
f)使用50μl去离子水(预热至65℃)洗脱质粒DNA。
3)重组质粒KpnI/SacII酶切，使用20μl体系包括10xBuffer2μl，KpnI和Sac II各2U，模板(PCR产物或质粒)2μg，再用去离子水补足至20μl。水浴37℃，过夜。
4)将酶切产物点样于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外照相；
5)酶切鉴定的条带数目及大小与预期相符的质粒送上海英骏生物技术有限公司 进行一代sanger测序。测序引物详见表1；
6)测序序列拼接使用VectorNTIAdvance软件，版本号11.5；
7)使用Genbank数据库中blast工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)，对插入片段CDS区序列和Stat1α(NM_007315.3)或者Stat1β(NM_139266.2)序 列进行alignment，观察是否存在碱基突变。
2.9质粒的大量提取
对于测序正确的克隆利用无内毒素质粒大提试剂盒(TiangenDP117)进行质粒的 大量制备，具体步骤说明如下：
1)将一个单菌落自平板挑出，培养在5ml的含氨苄或卡那霉素的LB培养液，37℃， 300rpm振荡培养8小时；
2)将起始培养液用150ml的含氨苄或卡那霉素的LB培养液1000倍稀释，37℃， 220rpm振荡培养12～16小时；
3)8000g，4℃离心3min，将菌液收集于50ml离心管底并完全弃去上清液；
4)加入8ml含RNaseA的溶液P1，在涡旋器上充分重悬菌液；
5)向重悬液中加入8ml裂解液P2，轻轻颠倒混匀6～8次，室温孵育5min；
6)将3ml平衡缓冲液BL加入纯化柱的中央，8000g2min，弃废液；
7)向重悬液中加入8ml中和液P4，立即轻轻来回颠倒混匀6～8次；
8)将中和后液体通过内毒素过滤器CS1中，收集滤液于50ml管底；
9)在过滤的收集管中加入0.3倍体积的异丙醇，混合均匀；
10)分2～3次将以上液体加入步骤f中平衡的CP6柱子上，8000g离心1min；
11)在吸附柱CP6中央加入10ml的漂洗液PW，洗涤2次，弃废液；
12)在吸附柱CP6中央加入3ml的无水乙醇，洗涤1次，弃废液；
13)8000g离心3min，去除残留的乙醇；
14)使用1ml去离子水(预热至65℃)洗脱质粒DNA；
15)利用Narodrop2000分光光度发测定质粒的浓度和纯度。分装保存于0-20℃备 用。
3pStat1α-GFP和pStat1β-GFP质粒构建
3.1质粒载体双酶切，割胶纯化
采用BglII(Invitrogen15213-010)和SacII(Invitrogen15240-901)对 pStat1α-myc/pStat1β-myc和pEGFP-N1进行双酶切。反应体系为10xBuffer6μl，BglII和 SacII各8μl，质粒8μg，再用去离子水补足至60μl。然后置37℃酶切过夜。
酶切后的产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AxygenAP-GX-50G)进行割胶纯 化。具体步骤同2.5。
3.2纯化产物连接
主要步骤同2.6，而pEGFP-N1空质粒经BglII和SacII双酶切大片段为4689bp。插 入片段Stat1α的大小为2415bp，Stat1β的大小为2301bp。
3.3后续转化，质粒鉴定和大量提取同2.7-2.8
4结果
4.1pStat1α-myc、pStat1β-myc、pStat1α-GFP、pStat1β-GFP质粒图谱
采用VectorNTI软件(11.5版本)构建了重组质粒图谱，具体信息见图1。
4.2琼脂糖凝胶电泳结果
1)Stat1α和Stat1β的PCR产物和质粒载体经KpnI/SacII双酶切电泳结果
Stat1α和Stat1β的PCR产物大小在1500-2000bp，同时Stat1α的PCR产物大小比 Stat1β大，符合实验预期。pcDNA4/TO/myc-His(B)和pEGFP-N1经双酶切后电泳显示目的条 带在4500-5000左右，同时pcDNA4载体酶切片段比pEGFP-N1大，也符合实验的预期(图2a)， 说明可以进行下一步连接实验。
2)重组质粒的酶切鉴定
pStat1α-myc双酶切位置预期为两条带5071bp和2263bp；pStat1β-myc双酶切位置 预期为两条带5071bp和2149bp；pStat1α-GFP双酶切位置预期为两条带4841bp和2263bp； pStat1β-GFP酶切位置预期为两条带4841bp和2149bp。对阳性克隆进行摇菌扩大培养，小量 提取质粒，进行酶切鉴定结果显示：克隆酶切片段均符合预期大小(图2b)，可以用于下一步 测序鉴定试验。
4.3测序结果
选择4个重组质粒的CDS区序列，在genbank数据库中进行序列比对，结果显示， pStat1α-myc和pStat1α-GFP重组质粒的CDS编码区核酸序列和Stat1α(NM_007315.3)完全 一致，同样pStat1β-myc和pStat1β-GFP重组质粒和Stat1β(NM_139266.2)序列一致。(表2)。
表2重组质粒的插入的CDS序列和genbank数据库中stat1α/β的mRNA比对结果
4.4细胞过表达结果
图3为293T细胞的质粒转染。
pStat1α-myc、pStat1β-myc、pStat1α-GFP、pStat1β-GFP及其空载体pcDND4和 pEGFP转染48小时，蛋白印迹法检测Stat1过表达。
图4为pEGFP、pStatα-GFP和pStat1β-GFP质粒在293T中的表达。图示质粒转染后24 小时，绿色为GFP阳性结果，X100，标尺＝200μm。
本发明的pStat1α/β-myc、pStat1α/β-GFP重组质粒可用于研究Stat1的两个不同 亚型α和β在正常细胞和肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的作用，也可用于研究蛋白和蛋白之 间的相互作用。Stat1具有潜在的临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。