从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法.pdf

本发明公开了一种从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，称取植物性食物蛋白原料，加入有机溶剂提取，过滤，弃去滤液，滤饼除去残留的有机溶剂后，加水制成浆状液，再加入蛋白酶水解，当水解度达到30～60％时终止水解，离心，收集上清液，即得活性多肽；与现有技术相比，本发明方法减少了提取蛋白质的步骤，具有工艺路线短、操作简单、生产成本低、适于规模化生产等优点，所得含有活性多肽的上清液可以直接应用于食品添加剂、保健食品和医药领域，也可以超滤脱盐后使用或浓缩干燥成粉末使用，还可以进一步分离纯化制备高纯度的活性多肽。

1、  从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：称取植物性食物蛋白原料，加入有机溶剂提取，过滤，弃去滤液，滤饼除去残留的有机溶剂后，加水制成浆状液，再加入蛋白酶水解，当水解度达到30～60％时终止水解，离心，收集上清液，即得活性多肽。

2、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述有机溶剂选自甲醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和体积百分比浓度为50～100％的乙醇中的一种或多种。

3、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述提取方法为回流提取0.5～3小时或在温度T为25℃≤T＜有机溶剂沸点的条件下浸泡提取3～24小时。

4、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述滤饼加水制成质量体积百分比浓度为1～10％的浆状液。

5、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述蛋白酶选自胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。

6、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述蛋白酶的用量为滤饼重量的0.2～5％。

7、  根据权利要求1所述的从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，其特征在于：所述终止水解的方法为温度80～100℃加热10～30分钟或调节溶液pH使酶失去活性。

从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽制备方法，特别涉及从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法。
背景技术
植物性食物蛋白原料包括各种饼粕(如大豆粕、菜籽粕、花生粕、葵花籽粕、棉籽饼粕、亚麻籽粕，芝麻饼粕、玉米胚芽粕、小麦胚芽粕、米糠粕等)和各种蔬菜、水果、谷物加工过程中产生的富含蛋白质的副产品。目前多制成蛋白质饲料或肥料，尚未得到较好的综合利用。
食物蛋白来源的多肽是食物蛋白质经过降解后产生的由数个至数十个氨基酸组成的多肽的混合物。其不仅具有良好的加工特性，而且具有比氨基酸和蛋白质更佳的营养吸收特性，可作为营养吸收或过敏障碍的患者或婴幼儿的主要氮源。近年来，诸多具有生理活性的多肽的揭示更是为食物蛋白来源的多肽的开发应用提供了更加广阔的前景。至今，已从不同来源的食物蛋白中分离鉴定出具有促进矿物质吸收、免疫调节、类吗啡或抗吗啡、降血压、抗氧化以及促进细胞增殖等生理活性的多肽。因此，从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽，是综合利用植物性食物蛋白原料的一条有效途径。
目前，从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法主要采用酶解法。因多数植物性食物蛋白原料中含有营养不利因子或毒性物质，如棉籽粕中的棉酚、菜籽粕中的硫葡萄糖苷等，故现有方法多采用先脱毒，再提取蛋白质，最后酶解蛋白质的三步法工艺，存在工艺路线长、操作复杂、生产成本高、难于规模化生产等缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，工艺路线短，操作简单，生产成本低，适于规模化生产。
为达到此目的，本发明提供了一种从植物性食物蛋白原料中提取活性多肽的方法，包括以下步骤：称取植物性食物蛋白原料，加入有机溶剂提取，过滤，弃去滤液，滤饼除去残留的有机溶剂后，加水制成浆状液，再加入蛋白酶水解，当水解度达到30～60％时终止水解，离心，收集上清液，即得活性多肽。
进一步，所述有机溶剂选自甲醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和体积百分比浓度为50～100％的乙醇中的一种或多种；
进一步，所述提取方法为回流提取0.5～3小时或在温度T为25℃≤T＜有机溶剂沸点的条件下浸泡提取3～24小时；
进一步，所述滤饼加水制成质量体积百分比浓度为1～10％的浆状液；
进一步，所述蛋白酶选自胃蛋白酶和/或胰蛋白酶；
进一步，所述蛋白酶的用量为滤饼重量的0.2～5％；
进一步，所述终止水解的方法为温度80～100℃加热10～30分钟或调节溶液pH使酶失去活性。
本发明的有益效果在于：本发明方法是先用有机溶剂提取植物性食物蛋白原料中含有的营养不利因子或毒性物质，弃去提取液，再直接用酶水解蛋白质；与现有技术相比，本发明减少了提取蛋白质的步骤，具有工艺路线短、操作简单、生产成本低、适于规模化生产等优点，所得含有活性多肽的上清液可以直接应用于食品添加剂、保健食品和医药领域，也可以超滤脱盐后使用或浓缩干燥成粉末使用，还可以进一步分离纯化制备高纯度的活性多肽。
具体实施方式
植物性食物蛋白原料中含有的营养不利因子或毒性物质可以用有机溶剂提取除去。有机溶剂及提取方法可以根据所用植物性食物蛋白原料中含有的营养不利因子或毒性物质的具体性质进行选择。在本发明中，有机溶剂优选甲醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和体积百分比浓度为50～100％的乙醇中的一种或多种，最优选体积百分比浓度为50～100％的乙醇；提取方法优选回流提取0.5～3小时或在温度T为25℃≤T＜有机溶剂沸点的条件下浸泡提取3～24小时，温度升高则浸泡时间缩短。从提取液中回收的有机溶剂可以重复使用。
许多蛋白酶都可用于植物性食物蛋白原料的水解。对一种蛋白酶或蛋白酶混合物的选择，主要从蛋白酶的相对特异程度、所需水解程度以及活性多肽的用途等几方面进行考虑。在本发明中，优选胃蛋白酶、胰蛋白酶或二者的混合物。
酶解反应主要有四个重要参数：底物浓度、酶与底物的比例、温度以及pH。底物浓度以及酶与底物的比例的选择，可以从技术以及经济角度两方面考虑。较高浓度的底物通常产生相对较粘的浆液，从而限制酶的扩散，且在分散过程中易产生大量气泡，从而对后续处理造成干扰；而较低浓度的底物不能确保底物饱和度，会导致产率过低。温度以及pH通常选择所使用的蛋白酶活性的最适温度和pH。在本发明中，底物的质量体积百分比浓度优选为1～10％，酶的用量优选为底物重量的0.2～5％。
在水解过程中要监控水解度。在酶解的最初阶段，水解反应相当迅速，接着逐渐下降，整个酶解过程通常以曲线形状进行。在水解过程中，可采用三硝基苯磺酸法(Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)、水合茚三酮(ninhydrin)法等测定水解度。
当达到一定的水解度时，水解反应要迅速终止。在本发明中，优选温度80～100℃加热10～30分钟或调节溶液pH使酶失去活性，从而终止水解。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1、从油菜籽粕中提取活性多肽
称取40目的油菜籽粕干粉100g，加入体积百分比浓度为95％的乙醇1000mL，回流提取40分钟，过滤，滤液回收乙醇，滤饼于温度65℃烘干；将滤饼加水制成质量体积百分比浓度为10％的浆状液，温度90℃搅拌20分钟使蛋白变性，降温至37℃，用浓度为2mol/L的HCl调节pH至1.5，按滤饼重量的1％加入胃蛋白酶，在温度37℃、搅拌条件下水解，水解过程中用标准碱液(浓度为0.998mol/L的NaOH)维持pH恒定，当水解度达到55％时，沸水浴加热10分钟终止水解，冷却，调节pH至6～7，在温度4℃、转速10000r/min的条件下离心20分钟，收集上清液，用截留分子量为5KD的超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的多肽混合物。
实施例2、从油菜饼粕中提取活性多肽
称取40目的油菜籽粕干粉100g，加入体积百分比浓度为65％的乙醇1000mL，室温(即温度25℃)浸泡8小时，过滤，滤液回收乙醇，滤饼于温度75℃烘干；将滤饼加水制成质量体积百分比浓度为5％的浆状液，温度90℃搅拌20分钟使蛋白变性，降温至37℃，用浓度为2mol/L的HCl调节pH至1.5，按滤饼重量的3％加入胃蛋白酶，在温度37℃、搅拌条件下水解，水解过程中用标准碱液(浓度为0.998mol/L的NaOH)维持pH恒定，当水解度达到45％时，沸水浴加热10分钟终止水解，冷却，调节pH至6～7，在温度4℃、转速10000r/min的条件下离心20分钟，收集上清液，用截留分子量为5KD的超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例3、从油菜籽粕中提取活性多肽
称取40目的油菜籽粕干粉100g，加入甲醇1000mL，室温浸泡8小时，过滤，滤液回收甲醇，滤饼用水蒸气蒸去残留的甲醇；将滤饼加水制成质量体积百分比浓度为10％的浆状液，温度100℃搅拌10分钟使蛋白变性，降温至37℃，用浓度为2mol/L的HCl调节pH至1.5，按滤饼重量的1％加入胃蛋白酶，在温度37℃、搅拌条件下水解，水解过程中用标准碱液(浓度为0.998mol/L的NaOH)维持pH恒定，当水解度达到55％时，沸水浴加热20分钟终止水解，降温至50℃，调节pH至8，按滤饼重量的0.2％加入胰蛋白酶，在温度50℃、搅拌条件下水解，水解过程中维持pH恒定，当水解度达到50％时，沸水浴加热30分钟终止水解，冷却，调节pH至6～7，在温度4℃、转速10000r/min条件下离心20分钟，收集上清液，喷雾干燥，即得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例4、从油菜饼粕中提取活性多肽
称取40目的油菜籽粕干粉100g，加入乙酸乙酯1000mL，室温浸泡12小时，过滤，滤液回收乙酸乙酯，滤饼于温度75℃烘干；将滤饼按照实施例1所述方法进行酶水解，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例5、从油菜饼粕中提取活性多肽
称取40目的油菜籽粕干粉100g，加入体积比为1∶1的甲醇-乙醇混合溶剂1000mL，室温浸泡24小时，过滤，滤液回收溶剂，滤饼于温度75℃烘干；将滤饼按照实施例1所述方法进行酶水解，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例6、从米糠粕中提取活性多肽
称取米糠粕干粉100g，加入体积百分比浓度为95％的乙醇1000mL，室温浸泡8小时，过滤，滤液回收乙醇，滤饼于温度65℃烘干；将滤饼按照实施例1所述方法进行酶水解，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例7、从米糠粕中提取活性多肽
称取米糠粕干粉100g，加入甲醇1000mL，回流提取30分钟，过滤，滤液回收甲醇，滤饼用水蒸气蒸去残留的甲醇；将滤饼按照实施例3所述方法进行酶水解，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例8、从小麦胚芽粕中提取活性多肽
称取小麦胚芽粕干粉100g，加入丙酮1000mL，室温浸泡8小时，过滤，滤液回收丙酮，滤饼于温度65℃烘干；将滤饼加水制成质量体积百分比浓度为6％的浆状液，按照实施例1所述方法进行酶水解，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例9、从小麦胚芽粕中提取活性多肽
称取小麦胚芽粕干粉100g，加入乙酸乙酯1000mL，回流提取30分钟，过滤，滤液回收乙酸乙酯，滤饼用水蒸气蒸去残留的乙酸乙酯；将滤饼加水制成质量体积百分比浓度为6％的浆状液，按照实施例3所述方法进行酶水解，其中胰蛋白酶的水解度为45％，同样可制得具有ACE抑制活性的多肽混合物。
实施例1～9所得的多肽混合物经进一步的分离纯化，可以得到具有ACE抑制活性的如下三肽：LRL、VRY、AQW、FRW、FEW、IRL、IIF、SRF、VVF、SRL、IAP和ERP。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。