技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种复合生物活性因子脂质体及 其制备方法。
背景技术
生物活性因子是由多种细胞类型通过旁分泌、自分泌或内分泌的 方式产生，能够调节细胞的生长、分化和免疫等功能，尤其是能够有 效的与皮肤细胞发生作用，参与炎症发生和创伤愈合。例如：生物活 性因子能够促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、自由基 等侵害；生物活性因子还能促使真皮层胶原细胞的增生，加速术后皮 肤的修复。
常见的细胞分泌的生物活性因子有EGF(中文：表皮生长因子，英 文：epidermalgrowthfactor)，BFGF(中文：碱性成纤维细胞生长因 子，英文：basicfibroblastgrowthfactor)，VEGF(中文：血管内皮生 长因子，英文：vascularendothelialgrowthfactor)等。包含多种生活因 子的组合体可以称为复合生物活性因子。复合生物活性因子除了具备各 种生物活性因子自身的功能外，各种生物因子之间还可以相互促进，所 以，复合生物活性因子在医疗和化妆品等行业具有重要作用。
复合生物活性因子的保存方法直接影响其生物活性的高低以及保 存时间的长短，进而影响复合生物活性因子的应用。脂质体是脂类分 子(类脂)的自组装体，是一种由一个或多个脂质双层中间包覆微水相的 结构。在脂质体的形成过程中，亲水的头部形成膜的内外表面层，而 亲油性的尾部处于膜的中间。脂质体的这种结构使其能够携带生物制 品，以改善生物制品的保存条件。
例如，公开号为CN101444619A的专利，提供了一种重组人表皮 生长因子阳性离子脂质体及其制备方法，该方法包括：第一步：将一 定质量比的大豆磷脂和胆固醇的混合物，加入阳离子附加剂十八胺， 用无水乙醇溶解；第二步：将上述混合液加入旋转蒸发仪中，旋转蒸 发，挥尽乙醇，形成均匀的脂质膜；第三步：加入柠檬酸缓冲液并进 行水化处理，得到脂质体粗悬液；第四步：对脂质体粗悬液进行超声 处理，再加以微孔滤膜整粒，得到空白脂质体；第五步：将重组人表 皮生长因子EGF溶液与生长因子保护剂溶液混合物加入空白脂质体溶 液，调节pH至6.0-8.0，在25-45℃条件下温育10-40min，得到重组人 表皮生长因子阳离子脂质体。
但是现有技术公开的脂质体只包含单一的生物活性因子，营养成 分不全面，限制了脂质体的应用，而且，复合生物活性因子包含的因 子性质各不相同，适用的pH值也不同，所以，使用现有技术调节PH 值孵育的方法，会造成复合生物活性因子的活性较低。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种复合生物活性因子脂质体及其 制备方法，提高复合生物活性因子脂质体的生物活性和稳定性，且能 够延长保存时间。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供一种复合生物活性因子脂质体，所述 复合生物活性因子脂质体包括：1-5份的磷脂，0.02-0.2份胆固醇， 0.005-0.01份复合生物活性因子，其中，所述磷脂和胆固醇形成脂质体， 部分所述复合生物活性因子包封在所述脂质体内，形成复合生物活性 因子脂质体，所述复合生物活性因子脂质体的其余部分为纯净水。
优选的，所述复合生物活性因子至少包含：人表皮生长因子hEGF、 血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF、转化生长因子-β1 TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类 胰岛素二号增长因子IGF-2、角质细胞生长因子KGF、血小板衍生生长 因子PDGF。
优选的，所述磷脂由1∶1的饱和磷脂和不饱和磷脂组成。
优选的，所述饱和磷脂为氢化大豆卵磷脂HSPC，所述不饱和磷脂 为大豆卵磷脂。
优选的，所述复合生物活性因子脂质体还包括：0.1-1份的维生素 E或者0.1-1份的维生素C。
优选的，所述复合生物活性因子脂质体的包封率大于等于30％。
另一方面，本发明实施例提供一种复合生物活性因子脂质体的制 备方法，包括：
用有机溶剂溶解1-5份磷脂和0.02-0.2份胆固醇，减压旋转蒸发，挥 尽有机溶剂，形成均匀透明的脂膜；
将含0.005-0.01份复合生物活性因子的溶液与所述均匀透明的脂膜 旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为50-100nm的复合 生物活性因子脂质体。
优选的，所述旋转蒸发的转速为70-100rpm；所述旋转水合脱膜的 转速为40-70rpm，所述旋转水合脱膜的温度为20-25℃。
优选的，所述磷脂由1∶1的饱和磷脂和不饱和磷脂组成，所述饱和 磷脂为氢化大豆卵磷脂HSPC，所述不饱和磷脂为大豆卵磷脂；所述有 机溶剂为无水乙醇或者氯仿。
优选的，在所述用有机溶剂溶解磷脂和胆固醇的过程中，所述有机 溶剂还溶解0.1-1份的维生素E；
或者，在将含0.005-0.01份复合生物活性因子的溶液与所述均匀脂 膜旋转水合脱膜过程中，加入0.1-1份的维生素C。
本发明实施例提供的复合生物活性因子脂质体，含有多种生物活 性因子，且性质稳定，生物活性高，能达到60-70％，可以有效的与皮 肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、
自由基等侵害，还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后 可以加速修复，并具有抚平细纹，延缓皮肤老化等功能。
本发明实施例提供的一种复合生物活性因子脂质体的制备方法， 在形成均匀脂膜后，通过将复合生物活性因子的溶液与该均匀脂膜水 合脱膜，可以在保证复合生物活性因子较高活性的前提下，提高复合 生物活性因子的包封率，并通过整粒，得到粒径为50-100nm且性质稳 定的复合生物活性因子脂质体，该方法工艺简单，成本合理，且所得 复合生物活性因子脂质体所含的生物活性因子的活性可以保持 60-70％，并且可冷藏保存6个月，极大地改善了保存条件的要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下 面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人 员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其 它的附图。
图1为本发明实施例提供的复合生物活性因子脂质体的制备方法 流程图；
图2为本发明实施例中利用基因表达方式检测复合生物活性因子 脂质体和原料的生物活性的检测结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述 于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域 技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而 不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明 或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。 因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获 取。
一方面，本发明实施例提供一种复合生物活性因子脂质体，该复 合生物活性因子脂质体包括：1-5份的磷脂，0.02-0.2份胆固醇， 0.005-0.01份复合生物活性因子，其中，所述磷脂和胆固醇形成脂质体， 部分所述复合生物活性因子包封在所述脂质体内，形成复合生物活性 因子脂质体，所述复合生物活性因子脂质体的其余部分为纯净水。
优选的，本实施例中复合生物活性因子至少包含如表1所示的生 物活性因子。
表1
其中，hEGF(中文：人表皮生长因子，英文：humanepidermalgrowth factor)，是由53个氨基组成的生物活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长 因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，对受伤、受 损之表皮肌肤拥有较佳疗效；能够促进细胞的增殖分化，从而以新生 的细胞代替衰老和死亡的细胞。并且，hEGF还能止血，并具有加速皮 肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。
VEGF(中文：血管内皮生长因子，英文：vascularendothelialgrowth factor)，具有促进血管内皮细胞分裂与增殖，增加微静脉、小静脉的 通透性，诱导丝氨酸蛋白酶和间质胶原酶的表达，使细胞质钙聚集， 诱导血管生成，在创伤愈合、胚胎发育、肿瘤生长和转移过程中起着 重要的作用。
FGF(中文：成纤维细胞生长因子，英文：fibroblastgrowthfactor) 是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化， 对神经系统有重要作用。在美容护肤方面具有抗皱，预防衰老；美白， 祛斑；防晒和晒后修复；防粉刺以及去疤痕等作用。
TGF-β(中文：转化生长因子-β，英文：transforminggrowthfactors- β)是一多功能蛋白质，作用于中胚层，在机体的免疫调节、细胞生长 和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤和瘢痕修复等方 面都发挥着重要的作用。
IGF-l(中文：类胰岛素一号增长因子，英文：insulin-likegrowth factors-1)，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质。IGF-1 在婴儿的生长和在成人体内持续进行合成代谢作用上具有重要意义。 具有降血糖、降血脂、舒张血管、促进骨的合成代谢保持其正常结构 功能、促生长、促细胞分化、创伤修复等多种功能。
IGF-2(中文：类胰岛素二号增长因子，英文：insulin-likegrowth factors-2)，IGF-2的表达状况与肿瘤，以及潜在肿瘤的发生发展关系 密切，在肿瘤治疗方面起重要作用。
KGF(中文：角质细胞生长因子，英文：keratinocytegrowthfactor)， 作用于新生或老化的上皮细胞，通过其特异性受体在刺激上皮细胞生 长的同时，能启动上皮细胞对皮下间质组织的协调信号反馈，促进新 组织的形成，安全性好，无潜在的副作用，以此达到皮肤除疤痕和抗 辐射损伤的功能。
PDGF(中文：血小板衍生生长因子或血小板衍生因子英文：platelet derivedgrowthfactor)，是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定 细胞群分裂增殖的能力，促进纤维母细胞生成和胶原蛋白(尤其是I型 及III型胶原)产生，增加皮肤弹性抚平皱纹。
优选的，所述磷脂由1∶1的饱和磷脂和不饱和磷脂组成。
优选的，所述饱和磷脂为HSPC，所述不饱和磷脂为大豆卵磷脂。
优选的，所述复合生物活性因子脂质体还包括：0.1-1份的维生素 E或者0.1-1份的维生素C。
优选的，所述复合生物活性因子脂质体的包封率大于等于30％。
本发明实施例提供的复合生物活性因子脂质体，含有多种生物活 性因子，且性质稳定，生物活性高，能达到60-70％，可以有效的与皮 肤细胞发生作用，促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、 自由基等侵害，还可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后 可以加速修复，并具有抚平细纹，延缓皮肤老化等功能。
一方面，本发明实施例提供了一种复合生物活性因子脂质体的制 备方法，参见图1，包括步骤：
步骤1、用有机溶剂溶解1-5份磷脂和0.02-0.2份胆固醇，减压旋 转蒸发，挥尽有机溶剂，形成均匀透明的脂膜；
步骤2、将含0.005-0.01份复合生物活性因子的溶液与所述均匀脂 膜旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗脂质体；
步骤3、将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为50-100nm 的复合生物活性因子脂质体。
优选的，本发明实施例中含复合生物活性因子的溶液中(以下简 称复合活性因子溶液)至少包含如表1所示的生物活性因子，复合活 性因子溶液可以通过公知渠道获得各种生物活性因子，再进行配比而 获得，当然也可通过对组织工程皮肤条件培养液进行提纯浓缩处理后 而得到。本发明实施例对比不进行限制。
优选的，所述有机溶剂为无水乙醇或者氯仿或者氯仿和甲醇的混 合液。其中，需要说明的是，如果选择氯仿作为溶剂，则可在室温下 溶解磷脂和胆固醇，并且形成的脂质体比较均匀，可以直接在室温下 挥发；如果选择乙醇作为溶剂，则可在加热至45℃-55℃时溶解磷脂和 胆固醇。
优选的，所述磷脂由1∶1的饱和磷脂和不饱和磷脂组成。通过将饱 和磷脂和不饱和磷脂混合使用，可以获得适合的相转变温度，从而可 以选择合适的旋转水合脱膜温度。
优选的，所述饱和磷脂为HSPC，所述不饱和磷脂为大豆卵磷脂。
优选的，在步骤1中，还可以添加0.1-1份的维生素E，或者在步 骤2中还可以添加0.1-1份的维生素C。因为不饱和磷脂易氧化，添加 维生素E或者维生素C可以起到抗氧化作用，从而稳定不饱和磷脂， 优选的，维生素E或者维生素C的添加量为0.1-1份。
优选的，在所述旋转蒸发的转速为70-100rpm，利于溶剂蒸发，并 形成均匀脂膜。
优选的，所述旋转水合脱膜的转速为40-70rpm，利于形成均匀稳 定的复合生物活性因子脂质体，并利于均匀脂膜均匀脱落。
优选的，所述旋转水合脱膜的温度为20-25℃，可以制备比较稳定 的复合生物活性因子脂质体，提高复合活性因子的活性。
本发明实施例提供的复合生物活性因子脂质体的制备方法，在形 成均均匀脂膜后，通过将复合生物活性因子的溶液与该均匀脂膜旋转 水合脱膜，可以在保证复合生物活性因子较高活性的前提下，提高复 合生物活性因子的包封率，并通过整粒，得到粒径为50-100nm且性质 稳定的复合生物活性因子脂质体，该方法工艺简单，成本合理，且所 得复合生物活性因子脂质体所含的生物活性因子的活性可以保持 60-70％，并且可冷藏保存6个月，极大地改善了保存条件的要求。所 得复合生物活性因子脂质体可作为添加剂，应用于细胞培养、化妆品、 药品等方面；且与单一生物活性因子相比，含有细胞自分泌和旁分泌 的多种生物活性因子，营养更丰富，可以有效的与皮肤细胞发生作用， 促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害，还 可以促使真皮层胶原细胞的增生。因此对皮肤术后可以加速修复，并 具有抚平细纹，延缓皮肤老化等功能。
我们通过对几种基因的表达的方式检测复合生物活性因子的生物 活性，即根据复合生物活性因子的抗氧化指标CAT、GSH、Cu-SOD、 Mn-SOD检测复合生物活性因子的生物活性。检测结果如图2所示，根 据图2的检测结果可知，所得复合生物活性因子脂质体的生物活性和 复合生物活性因子溶液相比，保持了60％-70％的生物活性。
实施例
下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。以 下实施例仅以原料为质量分数为1％的复合生物活性因子溶液为例进行 说明，实际使用时，复合生物活性因子溶液的浓度并不对本发明目的 的实现构成影响。
实施例1
用氯仿溶解0.5份HSPC、0.5份大豆卵磷脂和0.02份胆固醇，并 加纯净水至100份，在70rpm转速下减压旋转蒸发，挥尽有机溶剂， 形成均匀脂膜；
将含0.005份复合生物活性因子的溶液，与所述均匀脂膜混合后， 在20℃以及40rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗 脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为50nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为32％，保持复合 生物活性因子溶液中64％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为30％，复合生物活性因子保持60％ 以上的活性。
实施例2
用乙醇溶解1份HSPC、1份大豆卵磷脂和0.1份胆固醇，并加纯 净水至100份，在100rpm转速下减压旋转蒸发，挥尽有机溶剂，形成 均匀脂膜；
将含0.01份复合生物活性因子的溶液，与所述均匀脂膜混合后， 在25℃以及70rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗 脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为100nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为46％，保持复合 生物活性因子溶液中70％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为40％，复合生物活性因子保持66％ 以上的活性。
实施例3
用氯仿溶解2.5份HSPC、2.5份大豆卵磷脂和0.2份胆固醇，并加 纯净水至100份，在80rpm转速下减压旋转蒸发，挥尽有机溶剂，形 成均匀脂膜；
将含0.008份复合生物活性因子的溶液，与所述均匀脂膜混合后， 在23℃以及70rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗 脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为80nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为44％，保持复合 生物活性因子溶液中68％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为40％，复合生物活性因子保持65％ 以上的活性。
实施例4
用氯仿和甲醇的混合溶剂溶解2份HSPC、2份大豆卵磷脂、0.1 份胆固醇和0.1份维生素E，并加纯净水至100份，在60rpm转速下减 压旋转蒸发，挥尽有机溶剂，形成均匀脂膜；
将含0.007份复合生物活性因子的溶液，与所述均匀脂膜混合后， 在22℃以及40rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复合生物活性因子粗 脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为60nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为49％，保持复合 生物活性因子溶液中70％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为45％，复合生物活性因子保持67％ 以上的活性。
实施例5
用氯仿溶解1.5份HSPC、1.5份大豆卵磷脂、0.15份胆固醇，并 加纯净水至100份，在80rpm转速下减压旋转蒸发，挥尽有机溶剂， 形成均匀脂膜；
将含0.008份复合生物活性因子的溶液和0.5份维生素C，与所述 均匀脂膜混合后，在25℃以及60rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复 合生物活性因子粗脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为100nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为47％，保持复合 生物活性因子溶液中68％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为42％，复合生物活性因子保持62％ 以上的活性。
实施例6
用乙醇溶解1.8份HSPC、1.8份大豆卵磷脂、0.18份胆固醇，并 加纯净水至100份，在80rpm转速下减压旋转蒸发，挥尽有机溶剂， 形成均匀脂膜；
将含0.007份复合生物活性因子的溶液和1份维生素C，与所述均 匀脂膜混合后，在25℃以及65rpm的转速下旋转水合脱膜，形成复合 生物活性因子粗脂质体；
将所得复合生物活性因子粗脂质体整粒成粒径为90nm的复合生 物活性因子脂质体。
结论，所得复合生物活性因子脂质体的包封率为48％，保持复合 生物活性因子溶液中68％以上的生物活性因子的活性，主要为EGF、 BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在 2-8℃下保存6个月以后，包封率为43％，复合生物活性因子保持64％ 以上的活性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范 围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。