技术领域
本发明提供了多羟基化胆汁酸和其衍生物，用来治疗胆疾病或刺激胆 汁流动。更具体地，本发明提供了多羟基化胆汁酸和其衍生物，用来治疗 胆疾病，其导致、或伴随胆汁郁积(胆汁淤积，cholestasis)或门静脉高 压，或用来刺激胆汁流动。
背景技术
胆汁是由肝脏产生的复杂分泌物。它被贮存在胆囊中并被周期性地释 放到小肠以有助于消化。胆汁成分包括胆固醇、磷脂、胆色素、和肝脏通 过胆汁/粪便排除加以消除的各种毒素。胆汁盐被合成并主动分泌穿过胆小 管膜，从而提供驱使胆汁流动的渗透力。对于胆汁形成，这是限速步骤 (rate-limiting step)。对于肝脏解毒、消化、胆固醇代谢、以及脂溶性营 养物和维生素的吸收来说，胆汁流动是必要的。
作为通过胆汁分泌从身体消除胆固醇的载体以及作为用于摄取脂肪 酸和脂溶性维生素的去污剂，胆汁酸是关键性的(23)。胆汁酸还在肝细胞 中调节细胞凋亡/存活(37；38；39；40；41)以及通过类法尼醇X激活受体 来调节基因表达(42；43；44；45；46；47)方面具有重要作用。胆汁酸在 肝细胞中由胆固醇合成，在结合于甘氨酸或牛磺酸以后分泌进入胆汁，在 小肠中被重吸收，以及通过门静脉再循环回到肝细胞。在胆汁酸的肠肝循 环中，胆汁酸从肝脏胆小管分泌进入胆汁是关键过程并且它的功能障碍会 导致不同肝病(23)。如果此过程受到破坏，则胆汁酸的积累经常引起肝损 伤(由于去污效应)。在人类中，胆汁酸库每24小时循环6-10次，从而 导致每日胆汁盐分泌20-40g，在大约400ml的胆汁中(51；49)。
在所选哺乳动物的胆汁中发现的常见胆汁酸包括以下胆汁酸：
胆汁盐输出蛋白(BSEP，ABCB1 1、或P-糖蛋白的姐妹(SPGP))，胆小 管ATP结合盒(ABC)蛋白，已被鉴定为用于胆汁酸的胆汁分泌的主要运送 系统(50；13)。在人类中BSEP突变导致受损的胆汁盐分泌和严重的肝病， II型进行性家族性肝内胆汁郁积(PFIC2)(1，2)。在PFIC2患者中胆汁酸分 泌通常小于正常的1％(2)。
某些引起胆汁郁积的药物，以BSEP为靶标(3-6)。BSEP突变还已涉 及慢性肝内胆汁郁积、II型良性复发性肝内胆汁郁积(BRIC 2)(7，8)和妊 娠的肝内胆汁郁积(9，10)。小鼠Bsep以以下优先次序转运胆汁酸：
牛磺鹅去氧胆酸盐＞牛磺熊去氧胆酸盐＝牛磺胆酸盐＞甘氨胆酸盐＝胆 酸盐(11-16)。大鼠肝质膜小泡呈现类似的优先次序(17)。在人、大鼠和小 鼠之间，胆汁酸优先次序和BSEP的活性是类似的。
bsep敲除(KO)导致小鼠胆汁郁积性疾病，并增加幼仔的死亡率，在 成体中生育率降低，以及胆汁流量仅为正常小鼠的1/4(18)。在bsep KO 小鼠中的残余胆汁流量大于在PFIC2患者中的胆汁流量，并且表型并无严 重病变(less severe)，这是因为bsep KO小鼠可以挺过婴儿(哺乳)期并 具有正常寿命(18)。bsep KO小鼠的肝脏表达较高水平的P-糖蛋白(Mdr1a/1b) 并且它们的胆汁包含新种类的胆汁酸，包括通常并不存在于小鼠或人胆汁 中的四羟基化胆汁酸(THBA)(16，18)。当喂养0.5％胆酸盐的饮食时(即 饲料含0.5％胆酸盐时)，bsep KO小鼠变得严重胆汁郁积的，但同时分泌 大量的胆汁盐进入胆汁。为了解释这种明显矛盾的结果，提出了′雨水桶 (rain barrel)′模型，其提出肝细胞中胆汁盐的含量取决于转运体对胆汁 酸的亲和力(Km)和胆汁酸输出的速率(19)。喂食富含胆酸盐饲料的bsep KO 小鼠呈现严重的胆汁郁积，这是因为它们的高胆汁流速和胆汁酸输出由这 样的转运体介导，其Km并不足够低到将积累的肝内胆汁盐降低到低于毒 性水平。雨水桶模型预测，可替换的胆汁盐转运体具有比BSEP更低的对 胆酸盐的亲和力。
当检查仓鼠B30细胞系并包含高水平的P-糖蛋白(Mdr1，Abcb1a)的质 膜小泡时，观测到依赖ATP的牛磺胆酸盐转运(20)，其具有69μM的Km， 约7倍高于Bsep，这表明在相对较低亲和力下P-糖蛋白转运牛磺胆酸盐。 在bsep KO小鼠中胆的胆汁盐组成的分析表明，在人和小鼠中，相对于更 加疏水性的初级胆汁酸，P-糖蛋白有利于(更适应)较小疏水性的鼠胆酸 盐和THBA(18，21)。这可以解释在bsep KO小鼠中胆汁郁积表型的不同 的严重性以及人类PFIC2胆汁郁积表型不同的严重性。在bsep KO小鼠中， 鼠P-糖蛋白转运肝内鼠胆酸盐和THBA，穿过胆小管膜，以维持接近正常 的胆汁流量，从而导致轻度表型(较轻症状)。因为人类通常不合成鼠胆 酸盐或THBA，无法利用MDR1，因此人类PFIC2导致严重胆汁郁积，胆 汁流量减至正常量的1％(2)。
在bsep敲除小鼠中上调的Mdr1a/1b表达(16，20)，和ABCB/P-糖蛋白 家族的已知的功能丰余性，提示Mdr1在介导胆汁流量中的作用。然而， 虽然bsep敲除小鼠在整个生命中呈现非常轻度的胆汁郁积，但 mdr1a-/-/mdr1b-/-双敲除小鼠是健康的，没有明显的表型，虽然在输注药物的 胆汁排泄方面它们确实具有特定的缺陷，其中上述输注药物已知是Mdr1 底物(22)。
一些胆汁郁积病症，如原发性胆汁性肝硬化，是通过补充在人胆汁中 并不存在的低毒性胆汁酸，熊去氧胆酸盐，来加以治疗。膳食补充熊去氧 胆酸盐在bsep KO小鼠中并不导致更大的胆汁流量并且甚至可以具有毒 性，这表明，BSEP负责大部分的天然熊去氧胆酸盐的转运，因而熊去氧 胆酸盐可能无助于PFIC2患者或遭受BSEP不足的任何人，不管是遗传的、 与妊娠有关、或产生自不利的药物或膳食暴露。
发明内容
本发明部分地提供了多羟基化胆汁酸，用于治疗胆疾病，例如，产生 于胆汁郁积或门静脉高压的胆疾病，或用于在例如正常对象或未诊断患有 胆疾病的对象中刺激胆汁流动。
在一个方面，本发明提供了在有需要的对象中治疗胆汁疾病或在对象 中刺激胆汁流动的方法，该方法包括给予有效量的根据化学式I的化合物：
或其衍生物，其中R1至R9的任何一种可以是-H或-OH，只要R1至 R9的至少四种是-OH；以及R10可以是-COOH或-CH2OH。
在一个可替换方面，本发明提供了药物或营养组合物，该组合物包含 根据化学式I的化合物：
或其衍生物，以及药学上或生理上或营养上可接受的载体，其中R1至R9的任何一个可以是-H或-OH，只要R1至R9的至少四个是-OH；以及 R10可以是-COOH或-CH2OH。
在一个可替换方面，本发明提供了根据本发明的药物或营养组合物的 应用，用于制备药剂，该药剂用于治疗胆疾病或刺激胆汁流动。
在一个可替换方面，本发明提供了一种制品，该制品包括根据化学式 I的化合物：
或其衍生物，以及用于治疗胆疾病或刺激胆汁流动的使用说明，其中 R1至R9的任何一个可以是-H或-OH，只要R1至R9的至少四个是-OH；以 及R10可以是-COOH或-CH2OH。
在可替换的实施方式中，化合物的亲水性大于胆酸盐(酯)(cholate) 的亲水性。
在可替换的实施方式中，化合物选自(任何组合的)四羟基化胆汁酸、 五羟基化胆汁酸、或其衍生物。
四羟基化胆汁酸可以是3，6，7，12-四羟基胆烷酸、3，4，7，12-四羟基胆烷 酸、1，3，7，12-四羟基胆烷酸、2，3，7，12-四羟基胆烷酸、3，7，16，24-四羟基胆 烷酸、或3，7，15，24-四羟基胆烷酸、或它们的衍生物。
3，6，7，12-四羟基胆烷酸可以是3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3α，6α，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3α，6β，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3α，6α，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3α，6β，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸、或3α，6β，7β，12β-四羟基-5β-胆烷-24- 酸、或它们的衍生物。
3，6，7，12-四羟基胆烷酸可以是3β，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3β，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3β，6α，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3β，6β，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3β，6α，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3β，6β，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸、或3β，6β，7β，12β-四羟基-5β-胆烷-24- 酸、或它们的衍生物。
2，3，7，12-四羟基胆烷酸可以是2α，3α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸、或其 衍生物。
3，4，7，12-四羟基胆烷酸可以是3α，4α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸、或其 衍生物。
在可替换的实施方式中，当和BSEP相比时，化合物具有对MDR1 的优先亲和性，例如，化合物具有对MDR1的高亲和性。
在可替换的实施方式中，化合物可以是结合化合物(缀合化合物)， 例如，牛磺酸或甘氨酸结合物(缀合物)，例如，3α，6β，7α，12β-四羟基-5β- 胆烷-24-酸的牛磺酰或甘氨酰结合物(缀合物)、3α，6β，7β，12β-四羟基-5β- 胆烷-24-酸的牛磺酰或甘氨酰结合物(缀合物)、3α，6β，7α，12α-四羟基-5β- 胆烷-24-酸的牛磺酰结合物(缀合物)、或3α，6β，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24- 酸的牛磺酰结合物(缀合物)。
在可替换的实施方式中，上述方法可以包括给予至少一种其它治疗或 预防剂，例如，对BSEP具有优先亲和性的制剂，或至少一种其它营养补 充剂。治疗或预防剂或营养补充剂可以是熊去氧胆酸盐或其变体或衍生 物。
在可替换的实施方式中，胆疾病可以是良性胆管狭窄、良性胰腺囊肿、 憩室炎、肝纤维化、肝损伤、胆总管结石、胰腺炎、胰腺癌或假囊肿、壶 腹周围癌、胆管癌，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎、外源性导管 压迫(例如，起因于物体或肿瘤对附近器官的压迫)、病毒性肝炎、脓毒症、 细菌性脓肿、药物使用例如药物诱发性特异反应性肝细胞毒性、淋巴瘤、 结核病、转移性癌、结节病、淀粉样变、静脉喂养、原发性胆汁性肝硬化、 原发性硬化性胆管炎、具有或没有肝硬化的酒精性肝炎、非酒精性脂肪性 肝炎、非酒精性脂肪肝病、具有或没有肝硬化的慢性肝炎、妊娠肝内胆汁 郁积、胆结石病、胆道运动障碍、舍格伦综合征(干燥综合症，Sjogren syndrome)、威尔逊病(威尔森氏病，Wilson’s disease)、缺血、毒素、酒 精、急性肝功能衰竭、α1-抗胰蛋白酶缺乏、PFIC2、良性复发性肝内胆汁 郁积、肝细胞癌、门静脉高压、静脉闭塞性病(veno-occlusive disease)、 或肝静脉血栓形成。胆疾病可以起因于或潜在地起因于胆汁郁积。
在可替换的实施方式中，对象可以是人。
本发明内容部分(本发明的概要)并不一定描述本发明的所有特征。
附图说明
图1示出三敲除(mdr1l-/-/mdr1a-/-/1b-/-)小鼠的胆汁郁积表型：a)腹 的视图，其示出与b)野生型小鼠相比TKO小鼠的肝增大；c)在两月龄雄 性TKO小鼠的肝脏中门静脉周纤维化(Masson三色染色)，40x；d)在肝细 胞中的超微结构变化，其示出扩张的胆小管腔，微绒毛(箭头)的丧失、和 保留的胆汁物质(以薄片形式)。
图2示出在喂养0.5％胆酸(CA)以后“三敲除”(bsep-/-/mdr1a-/-/1b-/-) 小鼠的存活率(a)和体重变化(b)。
图3示出“三敲除”(bsep-/-/mdr1a-/-/mdr1b-/-)小鼠的产生：a)用于产 生TKO小鼠的杂交方案。mdr1a-/-/mdr1b-/-双敲除和bsep-/-小鼠用来产生三 重杂合bsep+/-/mdr1a+/-/mdr1b+/-鼠(100％的后代是三重杂合体)。三重杂合 体用来产生bsep+/-/mdr1a-/-/mdr1b-/-小鼠(大约1/8的后代，因为在小鼠中 mdr1a和mdr1b基因是连锁的)，其然后用来产生TKO纯合体 (bsep-/-/mdr1a-/-/mdr1b-/-)。b)TKO小鼠的PCR筛选结果。泳道1、5和6是 三敲除小鼠，其中仅扩增来自突变体等位基因的条带。
图4示出在TKO(bsep-/-/mdr1a-/-/1b-/-)小鼠的肝细胞中的超微结构变 化，以及mdr1a-/-/1b-/-对照，其示出没有超微结构肝异常。a)在左边，示出 可变大小的异常线粒体，其具有被推到一侧的嵴，其中小孢檐(ledge)没 有穿越中线。它们的线粒体基质是均匀的并且没有颗粒。到右侧，此图像 示出大量的过度生长的高尔基小泡，其填充有致密材料(箭头)。 b)mdr1a-/-/1b-/-小鼠的肝脏显示没有超微结构异常。箭头指向正常胆小管。
图5示出a)在野生型、bsep-/-和TKO小鼠中一些主要肝表达基因的相 对mRNA表达，如通过半定量实时PCR确定的。相对于核糖体蛋白S15 的水平来标准化mRNA(表达)水平。雌性野生型mRNA水平设置为1。 所有数目表示为雌性野生型mRNA的比率，平均值±标准差(n＝4)(16)。b) 在TKO小鼠中主要选择性剪接的Mdr1(Abcb1b)转录物。此转录物具有外 显子4缺失并导致38个原始氨基酸的翻译，接着是移码，6个新型氨基酸 和提前终止密码子。c)在TKO小鼠中的次要Mdr1(Abcb1b)转录物。此转录 物具有外显子4、5、和6的缺失，其导致38个原有序列氨基酸的转译， 紧接着一个移码、12个氨基酸的新序列和提前终止密码子。
图6示出免疫染色的MDR1或BSEP的共焦显微照片。MDR1在胆小 管膜上有很强的表达。左手图片是对照，来自患有有机酸血症的幼儿(其 并不具有黄疸或胆汁郁积)的肝活检。右图片是来自PFIC2患者的肝活检 样品。
图7A-B示出，在野生型小鼠中，3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24- 酸刺激胆汁流速(BFR)。(A)在输注3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸 (6α，7αTHBA)以后，作为小鼠体重的函数的BFR。(B)在输注胆酸 (CA)(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷-24-酸)以后作为小鼠体重的函数的BFR。
图8A-B示出在输注非结合3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸 (6α，7αTHBA，100μmol/kg，作为体重的函数)以前(A)和以后(B)在雄性野 生型小鼠的胆汁中胆汁盐的HPLC(高效液相色谱)分布。(C)示出在输注 (100μmol/kg)胆酸(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷-24-酸)以前(上迹线)和2-4分 钟以后(下迹线)收集自野生型小鼠的胆汁份的HPLC分布。通过胆管插管， 胆汁样品收集自野生型小鼠。装载(load)等容积的胆汁。
图9示出用于从胆酸产生3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸 (6α，7αTHBA)的合成步骤。
图10示出用于产生牛磺酸结合3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸的合 成步骤。
图11示出通过图10所示方法产生的牛磺酸结合3α，6α，7α，12α-四羟基 -5β-胆烷酸的1H-NMR谱(18)。
图12A-C示出在野生型小鼠中通过THBA诱导的胆汁流速(BFR，bile flow rate)。(A)在输注65(○，空心圆)、250(*，星号)、350(▲，实心三角形) 和400(■，实心正方形)μmol/kg BW的3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸(6β，7αTHBA)前后，作为体重(BW)的函 数的BFR。(B)在输注65(○，空心圆)和200(■，实心正方形)μmol/kg BW 的3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸(6α7αTHBA)前后作为体重的函数 的BFR。(C)在输注65μmol/kg体重的6β，7αTHBA(■，实心正方形)、 6α，7αTHBA(▲，实心三角形)和熊去氧胆酸(UDC)(○，空心圆)前后作为体 重的函数的BFR。结果表示为三只小鼠的平均值±标准差。在小鼠中，在 65μmol/kg体重下的UDC是最大耐受剂(MTD)。
具体实施方式
本发明一方面(部分地)提供了多羟基化胆汁酸作为胆汁盐疗法的制 剂，用来在胆疾病患者中促进或改善胆汁分泌。根据本发明的化合物可以 连同现有化合物如熊去氧胆酸盐或其变体或衍生物一起用来改善肝功能 和/或缓解胆汁疾病。当给予对象例如等待肝移植的儿童时，本发明的多羟 基化胆汁酸是利胆剂(具有胆汁流动-刺激性能)。在可替换的实施方式中， 本发明提供了在任何对象，例如，未诊断患有胆疾病的对象中用于刺激胆 汁流动的多羟基化胆汁酸。“刺激胆汁流动(流量)”是指相对于标准(例 如，在生物体中胆汁酸的标准水平)，或相对于在对象中在给予根据本发 明的多羟基化胆汁酸以前测得的胆汁水平，在对象中增加胆汁流动(流 量)，。增加可以是5％至95％的任何整数值的变化，或10％至90％，或30％ 至60％，或可以超过100％。如在本文中所使用的，对象可以是人、非人 类灵长类动物、大鼠、小鼠、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等。对 象可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。对象可以是被怀疑患 有或有危险患有胆疾病的对象、被诊断患有胆疾病的对象、或证实未患有 胆疾病的对象。胆疾病的诊断方法和胆汁流量的测量方法、以及胆疾病诊 断的临床界定是本领域技术人员已知的。
胆疾病
胆疾病包括可以通过给予多羟基化胆汁酸来加以缓解、治疗或预防的 任何障碍或病症。典型的胆疾病可以包括但不限于胆汁不足、胆汁毒性、 消化障碍、受损的肝功能、胆汁郁积、门静脉高压等。
胆汁郁积是指一种病症，其中来自肝脏的胆汁的流动被减少或阻止， 或其中存在胆汁流量的不足。胆汁流动不足可以产生在肝脏和胆系统中的 任何地方。通常，胆汁郁积可以是肝外胆汁郁积，其发生在肝细胞以外， 或可以是肝内胆汁郁积，其发生在肝细胞内。
肝外胆汁郁积可以产生自良性胆管狭窄、良性胰腺囊肿、憩室炎、肝 损伤、胆总管结石、胰腺炎、胰腺癌或假囊肿、壶腹周围癌、胆管癌、原 发性硬化性胆管炎、外源性导管压迫，例如，起因于物质或肿瘤对附近器 官的压迫。
肝内胆汁郁积可以起因于病毒性肝炎，其包括但不限于乙型和丙型肝 炎，脓毒症，细菌性脓肿，药物例如药物诱发性特异反应性肝细胞毒性， 淋巴瘤，结核病，转移性癌，结节病，淀粉样变，静脉喂养，原发性胆汁 性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，具有或没有肝硬化的酒精性肝炎，具有 或没有肝硬化的慢性肝炎，妊娠，舍格伦综合征等。药物诱发性胆汁郁积 是由药物治疗引起的来自肝脏的胆汁流动的阻塞，并且可以由金盐、呋喃 妥因、促蛋白合成类固醇、口服避孕药、氯丙嗪、丙氯拉嗪、舒林酸、西 咪替丁、红霉素、甲苯磺丁脲、丙咪嗪、氨苄西林和其它基于青霉素的抗 生素等引起。药物诱发性胆汁郁积和肝细胞毒性是在诊所中药物治疗的常 见障碍并且构成药物开发和批准药物的新应用的主要问题。药物诱发性胆 汁郁积还占住院治疗的黄疸患者的2-5％，急性肝炎的所有病例的约10％， 以及急性肝功能衰竭的50％以上。
胆汁郁积还可以源于遗传性胆汁郁积性肝病，源于药物诱发性胆汁郁 积，其产生自某些药物的BSEP抑制活性以及起因于药物的急性肝毒性反 应，和影响肝功能的炎症性病症。
门静脉高压是指一种障碍，表现为在门静脉中的增加的压力，上述门 静脉是将来自肠的血液引导到肝脏的静脉。在门静脉中的增加的压力可以 起因于多种原因，包括炎症、纤维化、脾动静脉瘘、脾或门静脉血栓形成、 巨脾、结节病、血吸虫病、结节性再生性增生、原发性胆汁性肝硬化、肝 炎、自身免疫病等。
本发明的胆疾病是起因于、或潜在地起因于胆汁郁积、门静脉高压的 任何障碍，或通过给予如本文描述的多羟基化胆汁酸而获益的任何障碍。 胆疾病包括但不限于良性胆管狭窄、良性胰腺囊肿、憩室炎、肝纤维化、 肝损伤、胆总管结石、胰腺炎、胰腺癌或假囊肿、壶腹周围癌、胆管癌、 原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎、外源性导管压迫(例如，起因 于物质或肿瘤对附近器官的压迫)、病毒性肝炎(例如，A型、B型、C型、 D型、E型肝炎、单纯疱疹、巨细胞病毒、爱-巴病毒(Epstein-Barr)、腺 病毒)、脓毒症、细菌性脓肿、药物使用例如药物诱发性特异反应性肝细 胞毒性、淋巴瘤、结核病、转移性癌、结节病、淀粉样变、静脉喂养、原 发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、具有或没有肝硬化的酒精性肝 炎、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病、具有或没有肝硬化的慢性 肝炎、妊娠的肝内胆汁郁积、胆结石病、胆道运动障碍、舍格伦综合征、 威尔逊病、缺血、毒素、酒精、急性肝功能衰竭、α1-抗胰蛋白酶缺乏、PFIC2、 良性复发性肝内胆汁郁积(BRIC)、肝细胞癌(HCC)、门静脉高压、静脉闭 塞性病、肝静脉血栓形成等。
多羟基化胆汁酸以及其衍生物
胆汁酸是源自胆固醇的两亲化合物并且是类固醇的子类。胆汁酸和胆 汁醇是类固醇，其结构与胆烷或胆甾烷有关；因此，胆汁酸和胆汁醇可以 称作类胆烷(cholanoids)(51)。术语“胆汁酸”是具有羧基的类胆烷分子 的通称并且不表示电离状态。
术语“胆汁盐”可以用于盐，其中阴离子是结合胆汁酸、非结合胆汁 酸、或胆汁醇的结合物，或可以用作通称来包括结合胆汁酸和胆汁醇结合 物，其出现在自然界中作为水溶性阴离子(51)。例如，胆汁盐可以是结合 于甘氨酸或牛磺酸的胆汁酸的钠盐。
如在本文中所使用的，胆汁酸骨架的碳原子的编号系统如下所示。
C24胆汁酸称作胆烷酸，而C27胆汁酸则称作胆甾酸。通常，侧链的 构型是17β，并具有5β氢(具有顺式构型的A/B环形结)。“同分异构的 (Allo)”胆汁酸是具有5α氢的胆汁酸(51)。
胆汁酸可以被多羟基化。根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括但 不限于四羟基化胆汁酸、五羟基化胆汁酸、六羟基化胆汁酸等，可达羟基 化的可能的最高水平。
在一些实施方式中，多羟基化胆汁酸可以是如由化学式I表示的化合 物：
或其衍生物，其中R1至R9的任何一个可以是-H或-OH，条件是R1至R9的至少四个是-OH；以及R10可以是-COOH或-CH2OH。
在一些实施方式中，R1至R9的任何一个可以是-H、-OH、-F、-Cl、 -Br、烷基(例如，-CH3、-CH2-CH3)、-SO4，、或葡萄糖，条件是R1至R9的至少四个是-OH；以及R10可以是-COOH或-CH2OH。
在一些实施方式中，根据本发明的胆汁酸被至少四羟基化，即具有四 个或四个以上羟基。在一些实施方式中，羟基存在于类固醇核上。在一些 实施方式中，羟基还可以存在于烷基侧链上。
根据本发明的四羟基化胆汁酸包括但不限于3，6，7，12-四羟基胆烷酸、 3，4，7，12-四羟基胆烷酸、1，2，7，12-四羟基胆烷酸、1，3，7，12-四羟基胆烷酸、 2，3，7，12-四羟基胆烷酸、3，7，16，24-四羟基胆烷酸、或3，7，15，24-四羟基胆烷 酸、或它们的衍生物。
根据本发明的3，6，7，12-四羟基胆烷酸包括但不限于3α，6α，7α，12α-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3α，6α，7β，12α-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、3α，6β，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、3α，6α，7α，12β-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、3α，6β，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸、或3α，6β，7β，12β- 四羟基-5β-胆烷-24-酸、或它们的衍生物。
根据本发明的3，4，7，12-四羟基胆烷酸包括但不限于3α，4β，7α，12α-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、3α，4α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸、或它们的衍生物。
根据本发明的1，3，7，12-四羟基胆烷酸包括但不限于1β，3α，7α，12α-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、或其衍生物。
根据本发明的2，3，7，12-四羟基胆烷酸包括但不限于2β，3α，7α，12α-四羟 基-5β-胆烷-24-酸、2α，3α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸、或它们的衍生物。
根据本发明的3，7，16，24-四羟基胆烷酸包括但不限于3α，7α，16α，24-四 羟基-5β-胆烷或其衍生物。
根据本发明的3，7，15，24-四羟基胆烷酸包括但不限于3α，7β，15α，24-四 羟基-5β-胆烷或其衍生物。
在可替换的实施方式中，根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括但 不限于3α，7α，12α，24-四羟基-5β-26-酸、3α，7α，12α，24-四羟基-5β-胆甾-25-烯、 3α，7α，24，26-四羟基-5β-胆甾烷、或3α，7α，12α，24，26-五羟基-5β-胆甾烷、或 它们的衍生物。
在可替换的实施方式中，根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物特别排 除β-鼠胆酸盐(酯)和三羟基胆汁酸。在可替换的实施方式中，根据本发明 的多羟基化胆汁酸化合物是比胆酸盐(酯)更加亲水的(23，24)，如例如通 过极性[OH]和非极性(H+)残基沿类固醇环的分布和构型、或通过在反相 HPLC中的保留时间所测得的(60)。在一些实施方式中，相对于牛磺胆酸 盐(酯)(其被指定1.0的值，参见例如Asamoto等(21))，根据本发明的多羟 基化胆汁酸化合物具有小于0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、 0.10、或0.05的疏水性。
在一些实施方式中，当和BSEP相比时，根据本发明的多羟基化胆汁 酸化合物具有对MDR1的优先亲和性。在一些实施方式中，根据本发明的 多羟基化胆汁酸化合物具有对MDR1的高亲和性，例如，Km小于10μM、 20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM 或更大。
术语“结合胆汁酸(缀合胆汁酸)”可以用来指结合于基团的胆汁酸， 上述基团将另外的亲水性或电荷给予分子。在可替换的实施方式中，根据 本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括牛磺酸和/或甘氨酸结合物(缀合物)。 在可替换的实施方式中，根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括与任何 其它适宜氨基酸的结合物。在可替换的实施方式中，根据本发明的多羟基 化胆汁酸化合物包括与硫酸盐、磷酸盐、辅酶A、葡糖醛酸、葡萄糖、木 糖、和其它糖、N-乙酰葡糖胺等的结合物。例如，根据本发明的结合多羟 基化化合物包括但不限于3α，6β，7α，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸的牛磺酰或 甘氨酰结合物、3α，6β，7β，12β-四羟基-5β-胆烷-24-酸的牛磺酰或甘氨酰结合 物、3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸的牛磺酰结合物、3α，6β，7β，12α-四 羟基-5β-胆烷-24-酸的牛磺酰结合物、乙磺酸2-[(3，6，7，12-四羟基-24-氧代 胆烷-24-基)氨基]，例如，乙磺酸2-[[(3α，5β，6α，7α，12α)-3，6，7，12-四羟基-24- 氧代胆烷-24-基]氨基]-、甘氨酸N-(3，6，7，12-四羟基-24-氧代胆烷-24-基)例 如，甘氨酸、N-[(3α，5β，6β，7β，12α)-3，6，7，12-四羟基-24-氧代胆烷-24-基]、甘 氨酸N-[(3α，5β，6β，7α，12α)-3，6，7，12-四羟基-24-氧代胆烷-24-基]、甘氨酸 N-[(3α，5β，6α，7β，12α)-3，6，7，12-四羟基-24-氧代胆烷-24-基]、甘氨酸 N-[(3α，5β，6α，7α，12α)-3，6，7，12-四羟基-24-氧代胆烷-24-基]等。
根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括异构体例如立体异构体。例 如，包括3β和5α羟基四羟基胆烷酸，以及它们的任何立体异构体构型和 组合。
根据本发明的多羟基化胆汁酸化合物包括生理上或药学上可接受的 衍生物，如本文描述的化合物的盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、溶剂合物、水 合物和前药。药用盐包括但不限于胺盐，如但不限于N，N′-二苄基乙二胺、 氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其它羟烷基胺、乙二胺、N-甲基葡糖 胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-吡咯烷-1’-基甲基苯并咪唑、 二乙胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲烷；碱金属盐，如但不限 于锂盐、钾盐和钠盐；碱土金属盐，如但不限于钡盐、钙盐和镁盐；过渡 金属盐，如但不限于锌盐、铝盐、和其它金属盐，如但不限于磷酸氢二钠 和磷酸二钠；以及还包括但不限于无机酸的盐，如但不限于盐酸盐和硫酸 盐；以及有机酸的盐，如但不限于乙酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、 柠檬酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和延胡索酸盐。
通常以基本上纯化形式来提供本发明的和用于本发明的化合物和其 盐。当与自然伴随它的成分(例如，源生物体或组织的细胞)分离时，化合 物或盐(如果自然发生)是“基本上纯的”或“分离的”。当基本上没有细胞 污染物时，即，在活体外存在并且浓度大于化合物在源生物体、组织、或 其它天然来源中的浓度时，化合物可以是基本上纯的或分离的。通常，按 样品中的总材料的重量计，当化合物是至少10％、20％、30％、40％、50％、 或60％，更通常70％、75％、80％、或85％，或超过90％、95％、或99％ 时，则化合物是基本上纯的或分离的。因此，例如，化学合成的化合物将 通常基本上没有它的自然伴随的成分。例如，通过提取自天然来源或通过 化学合成，可以获得基本上纯的化合物。基本上纯的化合物可以包括立体 异构体或不同羟基化的混合物。可以利用任何适当的方法如柱、气相、或 液相色谱法或质谱法来测量纯度。
在本发明的一种可替换的实施方式中，提供了包含四羟基化胆汁酸的 外消旋混合物的组合物。可以通过四羟基化胆汁酸的化学合成而产生外消 旋混合物；可替换地，可以合并两种或更多种立体化学纯对映体。在另一 种实施方式中，组合物可以包含两种或更多种四羟基化胆汁酸。
多羟基化胆汁酸的制备
根据本发明的或根据本发明使用的化合物，包括其药用盐或衍生物， 可以通过合成来获得，其中利用如本文说明的或本领域已知的常用程序。 根据本发明可使用的化合物可以从自然资源获得。例如，多羟基化胆汁酸 化合物可部分或全部地由自然资源制备，例如，通过分馏生物提取物(例 如，从bsep KO小鼠)。胆汁酸可从bsep KO小鼠获得，通过例如使用胆 管插管来从50-100bsep KO小鼠收集约10-20ml的胆汁。HPLC可用于分 离约10-20μmol(5-10mg)的四-羟基化胆汁酸。在一些实施方式中，根 据本发明的多羟基化胆汁酸化合物可通过全合成制备。可选地，这样的合 成化合物可以被标记或衍生用于分析或药品研发目的。
化合物可利用标准技术合成，例如在Tohma et al.，1985(52)；Iida et al， 1991a(53)；lida et al.，199 1b(54)；Aggarwal et al.，1992(55)；Iida et al.，1993 (56)；Kurosawa et al，1995(57)；Kurosawa et al.，1996(58)；lida et a)，2002 (59)；Tserng KY and Klein PD(1977)，Leppik RA(1983)，或lida T.et al， (1990)等中所描述的，所有这些通过引用具体并入。例如四羟基胆汁酸可 如在Tohma et al.，1985(52)；Iida et al.，1991b(54)；Aggarwal et al.，1992 (55)；Iida et al.，1993(56)；Kurosawa et al.，1996(58)；Iida et al，2002(59) 中所描述的制备；五羟基胆汁酸可如在Kurosawa et al.，1996(58)中所描述 的制备。
多羟基化胆汁酸的药物或营养补充组合物、剂量和给予
本发明的多羟基化胆汁酸化合物能够在脂质体、佐剂或任何药用或生 理学地可接受的载体存在的情况下，以适合给予人或动物的形式单独或与 其他化合物组合(例如，核酸分子、小分子、肽类或肽类似物)提供。如 果需要，用根据本发明的化合物治疗可与多种传统的和现有的疗法相结 合，用于胆汁病症或导致或可能导致肝毒性的病症，或与现有的营养补充 剂相结合用于刺激胆汁流动(流量)。在一些实施方式中，根据本发明的 多羟基化胆汁酸给予未诊断患有胆汁病症的对象(例如正常对象)刺激胆 汁流动。在一些实施方式中，根据本发明的多羟基化胆汁酸在其中BSEP 被抑制且其中认可的胆汁郁积的治疗剂(熊脱氧胆酸盐)无效的条件下给 予。在一些实施方式中，根据本发明的多羟基化胆汁酸与熊脱氧胆酸盐或 其变体或衍生物(例如硫酸化熊脱氧胆酸盐、硝基脱氧胆酸盐、牛磺脱氧 胆酸盐等)、利福平、或可用于治疗胆汁郁积或门静脉高压或用于刺激胆 汁流动的任何化合物一起给予。
可采用常规的可应用的药物或营养补充剂配方，以提供合适的配方或 组成以将化合物给予患有胆汁郁积或胆汁郁积症状发生前的患者，或给予 正常对象用于刺激胆汁流动。可采用任何适当的给药途径例如，肠胃外、 静脉、皮下、肌肉内、颅内、眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、脑内、 腹膜内、鼻内、气雾剂、或口服给予。治疗制剂可以以液体溶液或混悬剂 的形式；对于口服给予，制剂可以以药片或胶囊的形式；对于鼻内制剂， 以粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式。
本领域中熟知的用于制作制剂的方法例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th edition)，ed.A.Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa中可以找到。用于胃肠外给药的制剂可包 含例如，赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇类(如聚乙二醇)、植物 来源的油类、或氢化萘类。可使用生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合 物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚环氧乙烯-聚氧丙烯共聚物用于控制化合物 的释放。用于调节化合物的其他可能有用的胃肠外递送系统，包括乙烯- 醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入式注入系统、以及脂质体。用于 吸入的制剂可包含赋形剂例如，乳糖，或可能是包含例如，聚环氧乙烯-9- 月桂醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或用于以滴鼻剂形式给予的 油溶液，或作为凝胶。
对于治疗性或预防性组合物，以足以停止或减缓胆汁郁积或保持或增 加胆汁流量(或胆汁流动)或改善门静脉高压的量将化合物给予对象。对 于营养补充剂，以足以刺激胆汁流动的量将化合物给予对象。
如本文所讨论的，在PFIC患者的肝脏中发现MDR1表达的显著上调， 这表明，在用于胆汁郁积性疾病如PFIC2和本文指出的其它胆疾病的药物 疗法中可以靶向MDR1。在人类群体中BSEP和MDR1是显著多态性的位 点，并且一些BSEP变体伴随对肝病的易感性。例如，在BSEP中的V444A 多态性存在于约一半群体中并且伴随约60％增加的妊娠的肝内胆汁郁积。 还可以利用根据本发明的化合物来治疗表现为升高的MDR1表达的胆疾 病的其它形式。根据本发明的化合物，对于遭受遗传性胆汁郁积性肝病、 遭受药物诱发性胆汁郁积(起因于某些药物的BSEP-抑制活性)、或遭受 其它胆疾病的患者，还可以提供治疗益处，并且可以有助于减轻由药物引 起的急性肝毒性反应和影响胆汁功能的炎症性病症。
根据本发明的化合物的“有效量”包括治疗有效量或预防有效量或营 养有效量。“治疗有效量”是指在剂量和必要时间上有效达到所期望的治 疗结果的量，期望的结果例如为增加的胆汁流动、黄疸的缓解、或改善的 肝功能，如由血清肝脏生化指标的正常化所指示的，如胆红素、ALP(碱性 磷酸酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天冬氨酸氨基转移酶)、γ-GT(γ-谷氨 酰转肽酶)等的水平。化合物的治疗有效量可以依据各种因素而变化，这 些因素例如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，以及在个体中化合物 诱导所期望的反应的能力。剂量方案可以加以调节以提供最佳的治疗反 应。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益效果超过化合物的任何毒性 或有害的影响。“预防有效量”是指在剂量和必要时间上有效达到所期望 的预防结果的量，期望的结果例如增加的胆汁流动或改善的肝功能(如由 肝脏生化指标所指示的)、增加的胆汁流动、黄疸的缓解、或改善的肝功 能，如由血清肝脏生化指标的正常化所指示的，如胆红素、ALP(碱性磷酸 酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天冬氨酸氨基转移酶)、γ-GT(γ-谷氨酰转 肽酶)等的水平。通常，在疾病以前或在疾病的早期阶段，在对象中使用 预防剂量，所以预防有效量可以小于治疗有效量。化合物的治疗或预防有 效量的示例性范围可以是5-50mg/天/kg对象(例如，人)体重。″营养有 效量″是指在剂量和必要时间上有效达到所期望的结果的量，期望的结果 例如增加的胆汁流动或改善的肝功能，如由肝脏生化指标所指示的。
必须指出的是，剂量值可以随待减轻的病症的严重性而变化。对于任 何特定对象，具体剂量方案可以随时间并根据个体需要和给予或监督给予 组合物的人的专业判断加以调节。本文列出的剂量范围仅是示例性的而并 不限制可以由执业医生选择的剂量范围。在组合物中活性化合物的量可以 依据各种因素如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重而变化。剂量方案 可以加以调节以提供最佳的治疗反应。例如，可以给予单剂量，可以随时 间给予若干分开的剂量，或可以按比例减少或增加剂量，如由治疗情况的 紧急需要所指示的。以单位剂量形式来配制胃肠道外组合物，以利于制剂 使用的方便性和均匀性。
在疫苗制剂的情况下，可以单独或连同其它化合物、连同佐剂，例如， 弗氏不完全佐剂或氢氧化铝一起来提供免疫有效量的本发明的化合物。还 可以将化合物连接于载体分子，如牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白，以增强 免疫原性。
对于营养补充剂，可以包括至少一种添加剂(包括以下所列一种)以 连同本发明的营养补充剂一起消费，并且可以具有，例如，抗氧化剂、分 散剂、抗菌剂、或增溶性能。适宜的抗氧化剂是，例如，维生素C、维生 素E或迷迭香提取物。适宜的分散剂是，例如，卵磷脂、烷基多葡萄糖苷、 聚山梨酯80或月桂硫酸钠。适宜的抗菌剂是，例如，亚硫酸钠或苯甲酸 钠。适宜的增溶剂是，例如，植物油如向日葵油、椰子油等，或甘油单酯、 甘油二酯或甘油三酯。添加剂包括维生素如维生素A(视黄醇、棕榈酸视 黄酯或视黄醇乙酸盐)、维生素B1(硫胺素、盐酸硫胺素或一硝酸硫胺素)、 维生素B2(核黄素)、维生素B3(尼克酸、烟酸或烟酰胺)、维生素B5(泛酸、 泛酸钙、d-泛酰醇或d-泛酸钙)、维生素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或盐 酸吡哆醇)、维生素B12(钴胺素或氰钴胺素)、叶酸、叶酸盐、叶酸盐(酯)、 维生素H(生物素)、维生素C(抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙或抗坏 血酸棕榈酸盐)、维生素D(胆钙化醇、钙化甾醇或麦角钙化醇)、维生素 E(d-α-生育酚、d-β-生育酚、d-γ-生育酚、d-δ-生育酚或d-α-醋酸生育酚) 和维生素K(叶绿醌或植物甲萘醌)。其它添加剂包括矿物质如硼(十水四硼 酸钠)、钙(碳酸钙、酪酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸钙、 磷酸氢钙或正磷酸钙)、铬(来自酵母的GTF铬、乙酸铬、氯化铬、三氯化 铬和吡啶甲酸铬)、铜(葡糖酸铜或硫酸铜)、氟(氟化物和氟化钙)、碘(碘化 钾)、铁(富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁或硫酸亚铁)、镁(碳酸镁、葡萄糖酸 镁、氢氧化镁或氧化镁)、锰(葡糖酸锰和硫酸锰)、钼(钼酸钠)、磷(磷酸氢 钙、磷酸钠)、钾(天冬氨酸钾、柠檬酸钾、氯化钾或葡糖酸钾)、硒(亚硒 酸钠或来自酵母的硒)、硅(偏硅酸钠)、钠(氯化钠)、锶、钒(硫酸钒)和锌(乙 酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌或硫酸锌)。其他添加剂包括氨基酸、肽、 和相关分子如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、肉碱、瓜氨酸、半 胱氨酸、胱氨酸、二甲基甘氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱 甘肽、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。 其它添加剂包括动物提取物如鳕鱼肝油、海洋脂质、鲨鱼软骨、牡砺壳、 蜜蜂花粉和d-氨基葡萄糖硫酸盐。其它添加剂包括游离不饱和脂肪酸如亚 油酸、花生四烯酸和亚麻酸，其可以具有酯(例如乙酯或甘油三酯)形式。 其它添加剂包括草和植物提取物如海藻、果胶、螺旋藻属、纤维、卵磷脂、 麦胚芽油、红花籽油、亚麻籽、月见草、琉璃苣油、黑茶藨子、南瓜籽油、 葡萄提取物、葡萄籽提取物、树皮提取物、松树皮提取物、法国沿海松树 皮提取物、铁青树提取物、小茴香提取物、当归提取物、纯洁树莓果提取 物、苜蓿、锯棕榈浆果提取物、绿茶提取物、当归、樟脑草、辣椒、紫草、 大蒜、生姜、人参、白毛茛、刺柏果、欧亚甘草、橄榄油、欧芹、薄荷、 迷迭香提取物、缬草、白柳、皱叶酸模和巴拉圭茶。其它添加剂包括酶如 淀粉酶、蛋白酶、脂酶和木瓜蛋白酶以及各种各样的物质如甲基萘醌类、 胆碱(重酒石酸胆碱)、肌醇、类胡罗卜素(β-胡罗卜素、α-胡罗卜素、玉米 黄质、隐黄质或叶黄素)、对氨基苯甲酸、盐酸甜菜碱、游离Ω-3脂肪酸 和它们的酯、二硫辛酸(α-硫辛酸)、1，2-二硫戊环-3-戊酸、1，2-二硫戊环-3- 戊酸、烷基多葡萄糖苷、聚山梨酯80、月桂硫酸钠、黄烷类、黄烷酮、黄 酮、黄酮醇、异黄酮、原花色素、低聚原花色素、维生素A醛、维生素 A2的成分的混合物、可以处理为混合物的D维生素(D1、D2、D3和D4)、 抗坏血酸棕榈酸盐和维生素K2。本发明的营养补充剂通常是粘性油并在 食物的处理期间可以被加入食物组合物。这样的食物组合物的称作功能食 物，并且可以是任何食物，其将容许营养补充剂例如，人造奶油、食油、 酥油或蛋黄酱的理化性能。还可以将它包装在软胶囊、胶囊剂、片剂或液 体形式中供消费。可以将它提供在可食用多糖胶中，例如角叉菜胶、槐豆 胶、瓜尔胶、黄芪胶、纤维素和羧甲基纤维素。
通常，应在没有引起显著毒性的条件下来使用本发明的化合物。可以 利用标准技术来确定本发明的化合物的毒性，例如，通过测试细胞培养物 或实验动物并确定治疗指数，即在LD50(对于50％群体的致死剂量)和 LD100(对于100％群体的致死剂量)之间的比率。可以用来确定本发明的化 合物的毒性的其它方法包括但不限于通过H&E染色、三色染色等的组织 学异常；胆汁流量的变化、和/或其它胆汁物质的清除率(例如，如通过胆 管插管确定的)；HPLC分析、酶法测定等；肝指标的变化，例如胆红素水 平、ALP(碱性磷酸酶)水平、ALT(丙氨酸转氨酶)水平、AST(天冬氨酸氨 基转移酶)水平、γ-GT(γ-谷氨酰转肽酶)水平等。最大耐受剂量(MTD)是化 合物或组合物的最高定期给予剂量，在研究的对象中在一段时间内其并不 引起明显毒性(例如并不引起不可接受的副作用)。对象可以是人或动物， 例如，如小鼠或大鼠。定期给予剂量可以是日剂量，作为单剂量给予；可 替换地，可以将日剂量分成两个或更多部分剂量，以保证对象得到每日总 剂量不变。研究持续时间可以为数天至数月，例如10、20、30、60、90 或120天，或其间的任何时间。明显毒性的实例可以包括但不限于明显的 细胞死亡或器官功能障碍，中毒表现，其预示大大地减小对象的寿命，或 体重增加的10％或更大延迟。
然而，在一些情况下，如在严重疾病状况下，可能必要的是，给予显 著过量的组合物。在一些实施方式中，3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24- 酸或3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸可以具有比其它胆汁酸，例如熊去 氧胆酸盐更低的毒性。当用作营养补充剂时，适当剂量不应导致显著毒性。
制品
本文提供了制品，该制品包括包装材料、多羟基化胆汁酸化合物或组 合物、或其药学上或生理上可接受衍生物，其可有效刺激胆汁流动或用于 调节MDR1的活性，或用于治疗、预防或改善胆汁郁积或胆疾病(其中涉 及MDR1)的一种或多种症状，在包装材料内提供了标签，该标签指明化 合物或组合物、或其药用衍生物，用于刺激胆汁流动或用于调节MDR1的 活性，或用于治疗、预防或改善胆汁郁积或胆疾病(其中涉及MDR1)的 一种或多种症状。
试剂盒
本文提供了试剂盒，该试剂盒包括多羟基化胆汁酸化合物、或包含多 羟基化胆汁酸化合物的组合物、或其药学上或生理上可接受衍生物，其可 有效刺激胆汁流动或用于调节MDR1的活性，或用于治疗、预防或改善胆 汁郁积或胆疾病(其中涉及MDR1)的一种或更多症状，还包括了化合物 或组合物的使用说明。试剂盒可用于治疗对象的胆疾病，并且使用说明可 以包括，例如，剂量浓度、剂量间隔、优选的给予方法等。
在另一种实施方式中，试剂盒可用于药剂的制备，以及使用说明可以 包括用于制备药剂的说明。试剂盒可以进一步包括药剂在治疗中的使用说 明：用于治疗、预防或改善胆汁郁积或胆疾病(其中涉及MDR1)的一种 或多种症状，并且包括，例如，剂量浓度、剂量间隔、优选的给予方法等。
在另一种实施方式中，试剂盒可以用于药物或营养组合物的制备，并 且使用说明可以包括药物或营养组合物的制备的说明。试剂盒可以进一步 包括药物或营养组合物的使用说明：用于治疗、预防或改善胆汁郁积或胆 疾病(其中涉及MDR1)的一种或多种症状，并且包括，例如，剂量浓度、 剂量间隔、优选的给予方法等。
将在以下实施例中进一步说明本发明。
实施例1：胆汁郁积的动物模型
方法
动物
如前所述，将基于FVB/NJ遗传背景(16)的bsep KO小鼠保养在实验 室中以及mdr1a/1b KO小鼠(22)来自Taconic(Hudson，NY 12534)。将小鼠 保持在22℃、12小时光暗循环周期下，并且可以自由获得食物和水。除 非在结果中另有规定，对小鼠喂养正常饮食(饲料)。本实验的程序得到 英国哥伦比亚大学(University of British Columbia)动物伦理委员会的批 准，根据加拿大动物护理理事会的指南进行。
光和透射电镜术
为了进行光学显微术，在禁食2-4小时以后用CO2杀死小鼠。立即取 出肝脏并转入10％中性缓冲福尔马林溶液，接着石蜡切片和苏木素-伊红 染色或Masson三色染色(Wax-it Histology Services Inc公司，范库弗峰 (Vancouver))。为了进行透射电镜术，利用冰冷的2.5％戊二醛来原位灌注 固定肝脏并保持在2.5％戊二醛中。
如前所述(25)，进行脱水、塑料包埋和切片。1微米厚的塑料包埋切 片用飞利浦(Philips)EM400T透射电子显微镜(Eindhoven，荷兰)进行检 查。
人肝脏样品
从基因证实的I和II型PFIC患者(年龄5个月至1.5岁)获得细针 活组织检查或手术活组织检查肝脏样品。两位PFIC-2患者是在核苷酸位 置1273处具有杂合V284L突变和1bp缺失的同胞对。其它PFIC-2患者具 有G1004D错义突变。跟据具有高γ-GT PFIC，我们还包括了三位PFIC-3 患者，其中包括一位在MDR3基因处(73)具有证实的缺失突变的患者。另 外6位年龄匹配对照(0.5至1.5岁)是来自非黄疸、非胆汁郁积的代谢性肝 病或肝炎患者。根据知情同意书，收集样品。
定量反转录PCR
如先前所描述的(16)，来自小鼠和患者的肝脏样品用来制备RNA。简 单地，通过使用RNAeasy试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，总RNA 提取自冷冻肝脏。在42℃下用200pmol随机六聚体(Promega Corp.， Madison，WI)和反转录酶(Superscript II，Invitrogen Life Technologies，Breda， 荷兰)反转录1-10μg总RNA 50分钟并在72℃下灭活15分钟。借助于获 得的互补DNA(cDNA)，对小鼠样品，通过PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)中的SYBR Green PCRMaster Mix(Foster City，CA)，并利用″标准曲线方法″(ABI PRISM User Bulletin 2)进行PCR反应。使用的引物是如先前所报道(16)。对于每个样 品，5-10ng的总RNA用于每个RT-PCR反应，并且相对于核糖体蛋白 S15(Rpsl5)的表达水平对结果进行标准化。对于患者样品，利用Taqman系 统进行PCR反应。5ng的总RNA用于每个RT-PCR反应。利用dCT方 法(ABI PRISM User Bulletin 2)来计算相对于TATA框结合蛋白(TBP)的 MDR的表达水平。所使用的引物和探针是：MDR(Hs001 84500_ml，ABI) 和TBP(有义：5′-CACGAACCACGGCACTGTT-3′(SEQ ID NO：1)；反义： 5′-TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC-3′(SEQ ID NO：2)；探针5′-JOE TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA-3′(SEQ ID NO：3))。
免疫荧光染色
立即将新鲜肝组织的样品包埋在O.C.T.化合物(Tissue-Tek；SAKURA) 中。借助于冷冻切片机来切割冷冻组织切片(～5-7μm)并放置在涂布有多聚 左旋赖氨酸的载玻片上，然后固定在冷却丙酮中10分钟。如先前报道的 (26)，使用了抗人BSEP的兔多克隆抗体(1∶500)。使用了具有1∶500稀度 的抗人MDR的单克隆抗体(Sigma，Saint Louis Missouri)。在用PBS漂洗以 后，在室温下用荧光结合的对兔或小鼠IgG的二抗(Alexa Fluor 594和 Alexa Fluor 488，Life Technologies)孵育组织切片1小时，接着PBS洗涤。 借助于VectaShield(Life Technologies)来封固切片。利用Nikon Cl共焦显 微镜来获得图像并利用Photoimpact 8.0软件(Ulead)来处理图像。
结果
通过bsep-/-小鼠(18)与mdr1d-/-/mdr1b-/-双敲除小鼠(22)的多步杂交，产 生了携带mdr1a和mdr1b(人MDR1的共生直向同源物)和bsep基因的无效 突变的三敲除(TKO)小鼠(图3a)。通过基因组PCR(图3b)、实时RT-PCR(图 5)、和蛋白质印迹，证实了在TKO小鼠中三种突变体基因的无效表达。
TKO小鼠呈现比任何一种亲代品系更加严重的胆汁郁积，表现为例 如在体壁和爪子上(在整个生命中)严重黄疸、肝增大(图1a)、破坏的小 管(图1d)、受阻的胆管、生长延迟和非常高的死亡率。在严密护理下，一 些TKO小鼠(大多数为雌性)确实活到成年期，而约80％的TKO雄性则 在2-6个月内遭受突然死亡。雄性成体是能生育的并且可以用于产生TKO 后代。我们进一步表明，TKO小鼠对于胆汁郁积应力的耐受降低，其中 通过喂养雌性TKO小鼠0.5％胆酸(CA)饮食，一种可以由bsep-/-雌性和 mdr1a-/-/1b-/-双KO小鼠良好地耐受的条件。在0.5％CA饮食喂养下的雌性 TKO小鼠在3-7天以后最后会生病或死亡(图2)。这与bsep-/-小鼠形成鲜明 对比，在相同喂养条件下，bsep-/-雌性可以维持105天而没有显示任何致 死症状(16)。
TKO小鼠的组织学呈现还表明，和bsep-/-小鼠相比，在TKO小鼠中 存在严重得多的胆汁郁积。在显微镜下，TKO小鼠的肝细胞显示容易看 见的门静脉周纤维化(图1c)和胆管的缺乏(在TKO小鼠中17个胆管/91个 门静脉与在野生型小鼠中68个胆管/165个门静脉)。利用电子显微镜分析， 在质膜和细胞质中进一步观测到深度的肝损伤(图1d)。TKO小鼠呈现更为 严重的缺陷，如严重受损的胆小管膜(其已经失去几乎所有微绒毛)、和 填充有致密胆汁物质的扩张胆小管空间。TKO小鼠的肝细胞还呈现肝毒 性特有的细胞质异常，并具有扭曲的线粒体、过度生长的高尔基体、增加 的光面内质网、过多的脂滴、和数目增加的过氧化物酶体(图4)。
为了确定Mdr1是否还是生理有意义的胆小管胆汁盐转运体(其有助 于减轻否则更加严重的胆汁郁积表型)，在bsep-1-鼠中我们用P-糖蛋白 阻断剂环孢菌素A(CsA)选择性地阻断Mdr1(P-糖蛋白)，其中主要胆小管胆 汁盐转运体Bsep被灭活。腹膜腔注射25mg/kg/天CsA会诱导更加严重的 胆汁郁积表型，包括黄疸、体重迅速下降和类似于PFIC2的典型胆汁郁积 性肝的肝指标的生化分布(表1)。在bsep-1-敲除(KO)小鼠中CsA诱导胆汁 郁积的这种观测结果表明，Mdr1确实是生理相关胆汁盐转运体。然而，仍 有可能性是，CsA对bsep-1-小鼠的胆汁郁积效应是起因于化合物的非特异 性毒性而不是Mdr1介导的胆汁盐转运的特异性抑制。这种治疗并没有明 显影响经CSA治疗的野生型小鼠。
TKO小鼠的肝功能的血清生化分布类似于PFIC2，并且不同于bsep-/-小鼠，在bsep-/-小鼠中未看到上述异常(18)。TKO小鼠的血浆肝指标分布 的检查表明，低γ-GT、约2倍更高的碱性磷酸酶(表1)和严重的胆汁郁积， 其类似于人PFIC2的表现。TKO小鼠的平均血清胆红素水平是野生型对 照的血清胆红素水平的约13倍。ALT和AST的变化相对较小，其再次一 致于在PFIC2患者中发现的结果(27，28)，其中上述患者通常具有非常差的 胆汁盐的胆汁分泌，以及较高的碱性磷酸酶和胆红素、和低或正常γ-GT (在血清中)。因而TKO小鼠是完全消除胆汁盐分泌(如在人PFIC2中发 现的)的生理后果的良好模型。
表1.在bsep-/-和野生型雌性小鼠(经环孢菌素A治疗两周)、以及在 bsep-/-mdr1a/b-/-三敲除小鼠、bsep-/-、mdr1a/b-/-、和野生型雌性小鼠(喂养 正常饮食(饲料)或喂养补充有0.5％CA的饮食(饲料))(n＝4)中的肝脏 生化指标
ALP-碱性磷酸酶
γGT-γ-谷氨酰转肽酶
ALT-丙氨酸转氨酶
AST-天冬氨酸氨基转移酶
CA-胆酸
CsA-环孢菌素A
所有数值表示为平均值±标准差(P值)(n＝3-6)。星号表示通过在相同组中在敲除 和野生型小鼠之间的双尾学生t检验所确定的统计显著性。
为了估计在TKO小鼠的肝细胞中分子变化的程度，我们利用半定量 实时PCR测量了它们的基因表达分布。TKO小鼠呈现典型的胆汁郁积反 应，其类似于在bsep KO小鼠中所发现的(图5)。我们发现，Mrp3和Mrp4， 用于从肝细胞清除胆汁盐而进入窦状隙血液循环的主要基底外侧胆汁盐 转运体，常有高表达，最可能的主要胆汁盐羟化酶，Cyp3a1 1，表达也增 高。还注意到，Cyp3a41和Cyp3a44的下调。出乎意料地，实时PCR还 检测升高的mdr1转录。我们测定了残余mdr1转录物的序列，它们包括两 种选择性剪接的异构体，主要一种具有外显子4缺失(SEQ ID NO：4)，导 致38个氨基酸的N端片段的转译，接着移码，为7个新型氨基酸和提前 终止密码子(SEQ ID NO：5)编码序列；较少的转录物具有缺失外显子4、5、 和6(SEQ ID NO：6)，导致38个原有氨基酸的转译，接着移码，12个新型 氨基酸和提前终止密码子(SEQ ID NO：7)。
我们还检查了在所有亚型的PFIC患者中MDR 1的表达，以及一些 其它ABC转运体。我们推测，如果在人类中MDR1确实是生理相关胆汁 盐转运体，那么在PFIC患者中的肝内胆汁盐积累应导致MDR1上调。如 果是这样的话，则可以临床上刺激由MDR1介导的胆汁盐转运活性，以减 轻胆汁郁积。我们比较了来自PFIC患者与6位相应年龄具有非胆汁郁积 性肝病(包括糖原贮积症、尿素循环障碍、肝炎)的对照，和来自肝胚细 胞瘤患者的非肿瘤肝脏样品的肝活检。对照不具有胆汁分泌异常。借助于 活检样品的定量实时PCR进行的测定揭示了在PFIC患者中MDR1表达的 显着增加，大约四倍大于平均对照(表2)。通过免疫荧光染色，进一步证 实了MDR1的这种增加的表达，其中在PFIC患者的小管膜中检测到人 BSEP蛋白的显著增加(图6)。结果表明，在小鼠和人中，胆汁盐分泌有生 理上的备用系统。
表2.和年龄匹配对照相比，在PFIC患者中，小管转运体的相对表 达水平
*通过他们的病理和生化描述所诊断的PFIC-3患者。
在每个样品中，转运体的相对mRNA水平表示为相对于TBP mRNA水平的倍变 化(对于对照，平均值±SD)。
比较了突变小鼠和PFIC2患者的性能(表3)。
在PFIC患者的肝脏中，发现BSEP表达的显著上调(检测到高BSEP 表达)。
实施例2：牛磺酸结合3α，6β，7β，12α-羟基胆汁酸的合成
如在(29-31)中所描述的，合成牛磺酸结合3α，6β，7β，12α-羟基胆汁酸， 实质上β-鼠胆酸盐的12α-羟基化变体。异构体在合成中被同时生成，并且 可能具有类似活性。因而，还分离了上述化合物的至少5种另外的衍生物， 具体地为3α，6α，7α，12α-、3α，6β，7α，12α-、3α，6α，7β，12α-、3α，6β，7β，12α-、 3α，6α，7α，12β-羟基衍生物。利用3H-标记胆汁盐来标记分离的化合物，其中 通过在富含氚水的溶液中的氢交换，接着所标记的胆汁盐的再分离 (Perkin-Elmer可以提供此服务)(32)。如本文描述的，测试分离的化合物的 经由MDR1体外转运的相对亲和力。体外大量分离最有效化合物并用作本 文描述的或本领域已知的毒性和疗效的体内测试的先导化合物。
1.牛磺酸结合3α，6α，7α，12α-四羟基-5β胆烷酸的合成
参照图10，将3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸(7)保护为乙酸酯(16)。 在N2气氛下，在有机碱和乙酸酯(16)存在的条件下用N-羟基琥珀酰亚胺 来激活牛磺酸，用0.1N NaOH来激发(work up)，并通过SerdolitTM-1加 以洗涤，以提供酰胺(17)。在80℃下用1N NaOH处理酰胺(17)40分钟， 接着在50℃下20分钟，然后在25℃下1.5小时，从而在洗涤通过 SerdolitTM-1以后产生牛磺酸结合物(18)。牛磺酸结合3α，6α，7α，12α-四羟基 -5β胆烷酸(18)的1H-NMR谱示于图11。
实施例3：转运动力学和相互作用的评估
相比于广泛使用的治疗性胆汁酸熊去氧胆酸盐和牛磺胆酸盐、在人类 和小鼠中的初级胆汁酸、和β-鼠胆酸盐、在人类中通常不会发现的三羟基 胆汁酸，估计了如本文所描述的产生的化合物和它们的转运体MDR1的转 运动力学和相互作用。使用了源自CHO B30细胞膜的膜囊系统、中国仓 鼠卵巢细胞系(选择用于Mdr1基因座的相当大的扩增和相应的耐药性)、 以及来自人SKOV系列的细胞系的小泡(也选择用于MDR1过度表达)。 这种实验系统是久经检验建立的系统。利用此系统，测量了摄入小泡中的 3H-标记胆汁酸的ATP依赖性摄入量，其是单独或与相互作用的化合物如 牛磺胆酸盐或熊去氧胆酸盐组合。在由它们的各自的MDR1 P-糖蛋白介导 的耐药性分布方面，人类和啮齿目动物并不显著不同，因而利用源自人和 啮齿目动物细胞的小泡可以证实新的胆汁酸转运动力学的物种之间差异 不大，预期效用无显著改变。比牛磺胆酸盐具有较小疏水性(以及因而较 少毒性)、但比牛磺胆酸盐具有更高亲和力(较低Km)(用于通过MDR1加 以转运)的任何胆汁酸具有潜在的治疗益处，例如，四羟基化胆汁酸表明 是用于通过MDR1加以转运的低毒性和高容量的适宜混合物。
对于胆汁盐的转运体亲和力的调节也是一种机制，借此机制，鼠胆酸 盐和四羟基化胆汁酸可以克服胆汁郁积。根据本发明的胆汁酸可以变构地 减少MDR1对于胆酸酯的Km，因而进一步增加它作为利胆剂的价值。在 有各种胆汁酸和潜在刺激剂如罗丹明123、Hoechst 33342或哌唑嗪(已知 在不同的(结合)位点与Mdr1(33-35)相互作用)存在的条件下，利用分 离的膜囊，检查了对MDR1的上述影响。在有各种浓度的潜在调节剂存在 的条件下，比较了市售14C-牛磺胆酸盐进入B30膜囊的摄取动力学。积极 调节会增加摄取速率。筛查了已知是Mdr1底物的药物。鉴定了药物-胆汁 酸和胆汁酸-胆汁酸相互作用以确定牛磺胆酸盐转运的Km是否已经降低。
实施例4：体内最大耐受剂量的确定
确定了根据本发明的胆汁酸的最大耐受剂量。以两种方式来进行此测 试。首先，作为胆管插管的试验性实验，在麻醉下将单次静脉注射剂量的 (a bolus of)胆汁酸输注入小鼠以测量它对动物的急性毒性。记录小鼠的 反应如呼吸速率、胆汁流量、组织学变化(通过H&E染色)等。对于牛 磺胆酸盐，我们的测试表明，静脉内递送的167μmol/kg体重是最大耐受 剂量。利用此耐受水平作为参照点，确定了胆汁酸的急性毒性。发现静脉 内给予的熊去氧胆酸盐的最大耐受剂量(MTD)是65μmol/kg体重。这与它 是毒性较低的胆汁盐是一致的。在小鼠中静脉内给予的熊去氧胆酸盐的 LD50已报道为～600μmol/kg。
在人类中熊去氧胆酸盐的治疗剂量通常是口服并且通常不超过 40μmol/kg/体重/天。另外，口服的胆汁酸可以是较少毒性的，因为它进入 血流，因而和静脉内给予的情况相比，以更慢的速率进入肝脏。在啮齿目 动物中熊去氧胆酸盐的口服LD50是至少15倍大于静脉内给予时的LD50， 这提供了防止过量的相当大的安全边际。在Bsep功能障碍的条件下，对 于Mdr1显示比鼠胆酸盐或胆酸酯甚至更大亲和力的胆汁酸对增强胆汁流 动具有更大的特定剂量效应，同时在任何给定剂量下显示更低毒性。
通过用0.1％-0.5％β-鼠胆酸盐或根据本发明的胆汁酸补充小鼠(野生 型以及过敏bsep KO小鼠)的饮食(diet，饲料)来测试慢性毒性。对照喂 养实验使用胆酸盐/酯以及熊去氧胆酸盐。野生型小鼠可以无限期地忍受额 外的0.5％胆酸盐/酯的胆汁盐载荷，而相同饮食(diet，饲料)将引起雌性 bsep KO小鼠减重，并在10天内杀死雄性bsep KO小鼠(16，18)。在1周 内，0.5％胆酸盐/酯饮食甚至将杀死雌性TKO小鼠(36)。动物经对照饲料 和加有胆汁酸的饲料的喂养，并每天监测体重减轻和每周监测肝功能的血 清指标，以检测胆汁郁积的症状如血液中升高的肝酶、以及升高的胆汁盐 和/或胆红素(表1)。还进行了胆管插管，其中，单独或连同新的胆汁酸一 起，将单次静脉注射剂量的14C-牛磺胆酸盐注入小鼠的尾部静脉，并测量 在胆汁中14C-牛磺胆酸盐出现的动力学，然后评价每种新的胆汁酸对通过 Mdr1和/或Bsep的牛磺胆酸盐转运的体内影响。
实施例5：体内胆汁郁积的改善
用整体动物系统来评估根据本发明的胆汁酸的有效性，该整体动物系 统使得分子和生理事件的影响可以影响胆汁盐转运和胆汁流动(胆汁流 量，bile flow)。独特的敲除小鼠系的组合用来测试新的胆汁盐是否可以通 过促进Mdr1介导的胆汁流动来减轻胆汁郁积应力。使用了三个系的KO (敲除)小鼠。如在本文中所描述的，bsep KO小鼠携带失活的bsep基因 但具有升高的mdr1a/1b表达；mdr1a/mdr1b双KO小鼠具有正常bsep表达 但失活的mdr1a/1b基因；以及bsep/mdr1a/mdr1b三KO小鼠(TKO)具有均被 灭活的三种基因。上述三个系的动物用来证实新的胆汁酸在减轻胆汁郁积 压力方面的体内利胆功能。
将少量的具有各种异构体(如本文所述制备的)3H-标记THBA注入 突变小鼠品系(加上野生型对照)，并测量在血液、尿、胆汁和肝细胞中发 现的放射性，以比较新的THBA的体内动力学和针对相同化合物获得的那 些体外动力学(如本文描述的)。基于以上描述的动力学实验，我们选择 一个高剂量的根据本发明的胆汁酸来处理小鼠。在饮食/饲料中使用0.5％ -1.5％的浓度，这是考虑到野生型小鼠可以无限期地耐受相同量的牛磺胆 酸盐(Bsep优选的底物)。如以前报道的(16，18，37)，根据它们的体重、发 病率、死亡率、肝指标分布、和肝脏组织学，来监测小鼠(表1)。另外， 收集被喂养有根据本发明的胆汁酸的动物的胆汁，并通过HPLC加以分 析。胆汁流量的增加值是根据本发明的胆汁酸的利胆潜力的直接测量，在 三种KO小鼠品系中胆汁的胆汁酸组成的变化表明由Mdr1与Bsep体内转 运根据本发明的胆汁酸的程度。如果观察到，胆汁胆汁酸而不是根据本发 明的胆汁酸本身的比例的变化，则表明根据本发明的胆汁酸对常规胆汁酸 池的转运或合成的调节作用。
高剂量喂养下，本发明的胆汁酸具有比牛磺胆酸盐更小的对bsep KO 小鼠的负面效应，可以调节对mdr1a/1b小鼠的毒性和对TKO小鼠的高毒 性。以前，我们已发现，bsep KO和TKO小鼠对牛磺胆酸盐喂养敏感。 而用根据本发明的新的胆汁酸的喂养对bsep KO小鼠是比牛磺胆酸盐喂养 毒性较少，我们将用根据本发明的胆汁酸和胆酸盐(酯)或熊去氧胆酸盐的 混合物来处理我们的突变小鼠，以提供根据本发明的胆汁酸的治疗价值的 直接体内证据。
实施例6：3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸和3α，6β，7α，12α-四羟基-5β- 胆烷酸的合成
合成了三种形式的胆汁酸：3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸、 3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸和3α，6β，7β，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸。 以下合成是基于由Iida等和Aggarwal等(61、62、和其中提及的参考文献)、 和Gouin等、Fieser等、Putz等、Narasimhan等、以及Ornatein等(66-70 和其中提及的参考文献)所报道的那些合成。已在多克规模(scale，范围) 上进行上述化学合成并已对实验和纯化步骤进行小改进，以优化产率。通 过急骤层析法来纯化的最终化合物的纯度大于95％(通过NMR分析所证 明的)。通过HPLC方法已表明，它们是均匀的。
3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸的合成
胆酸(1)的保护提供甲酯(2)，其被N-溴琥珀酰亚胺(NBS)氧化成相应 酮(3)。然后将此化合物保护为二乙酸酯(4)并在和分子溴反应以后被转化 成关键中间体(5)。然后将此溴化物水解成羟基酮(6)。乙酸酯和甲酯部分 的随后的还原和全脱保护提供了目标化合物(7)。
3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸的合成。
用硼氢化锌还原中间体(5)(见上文)并进一步用金属锌还原获得的 溴醇以提供相应烯(8)。用间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)对后一种化合物的处 理提供了环氧化物(9)。此化合物的路易斯酸介导开环提供了二醇(10)。随 后全脱保护则提供目标化合物(11)。
3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸的可替换的合成方法
参照图9，用NBS对胆酸(1)的氧化提供了相应酮(12)，接着加以保护， 以提供相应甲酯(3)。然后将此化合物保护为乙酸酯(4’)，并且随后保护为 乙酸酯(4)，并通过和分子溴的反应，转化成中间体(5)。将溴化物水解成 羟基酮(13)。随后的还原和脱保护则提供目标化合物(7)。
实施例7.在野生型小鼠中3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸刺激 胆汁流速(BFR)
对于胆管插管，在禁食2-4小时以后，称量具有FVB/NJ的遗传背景 的野生型小鼠的重量并通过腹膜内注射氯胺酮(112.5mg/kg)和赛拉嗪(11.3 mg/kg)加以麻醉。打开腹，并在远端胆总管结扎以后利用PE-10导管将导 管插入胆囊[63，64]。在胆汁流量平衡20分钟以后，以5分钟间隔将胆汁 收集到预先称重的管中，收集10分钟。然后，经20秒间隔，将单次静脉 注射剂量的3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸(6a，7αTHBA，pH.7.4-7.6)、 3α，6β，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸(6β，7αTHBA，pH.7.4-7.6)、熊去氧胆酸 (UDC，pH.7.4-7.6)或胆酸(100μmol/kg体重)输注入尾部静脉。然后通过插 管以2分钟间隔进一步收集胆汁10或20分钟，接着以10分钟间隔，收 集30分钟。通过称量包含收集的胆汁的管的重量来计算胆汁流速。收集 的胆汁用于HPLC分析。
在实验以前的2小时内新鲜制作用于输注的UDC溶液，并且其制备 如下：对于每毫升的100mM UDC溶液，将39.62mg的UDC(Sigma U5127) 依次涡旋混合于86.6μl的100％乙醇、86.6μl的1N NaOH、和826μl的 0.9％NaCl溶液。不同的工作溶液稀释自100mM溶液。溶液的pH值为 7.4-7.6。
图7说明，在野生型小鼠中，3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸会刺 激胆汁流速(BFR)。(A)在小鼠中在输注3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24- 酸(THBA)以后作为体重的函数的BFR。(B)在小鼠中在输注胆酸 (CA)(3α，7α，12α-三羟基-5β-胆烷-24-酸)以后作为体重的函数的BFR。在10 分钟时，用20秒间隔将单次静脉注射剂量的THBA或CA(100μmol/kg体 重)输注入尾部静脉。结果表示为平均值(μl/100g体重)±标准差。
在以65、250、350和400μmol/kg体重(BW)的剂量输注3α，6β7α12α 四羟基胆烷酸(6β，7αTHBA)前后(图12A)、或输注65和200μmol/kg BW的 3α，6α7α12αTHBA(6α，7αTHBA)前后(图12B)，确定胆汁流速(BFR)。图 12C示出，在输注65μmol/kg体重的6β，7αTHBA、6a，7αTHBA和熊去氧 胆酸(UDC)前后作为体重的函数的BFR。结果表示为3只小鼠的平均值± 标准差。
在胆管插管实验期间，我们发现，以70μmol/kg体重或更高的浓度 通过尾部静脉输注的UDC会引起在麻醉(氯胺酮，112.5mg/kg和赛拉嗪， 11.3mg/kg)下的野生型小鼠的死亡。我们因此确定了，通过尾部静脉输注 给予的65μmol/kg体重的UDC是在小鼠中的最大耐受剂量(MTD)。然而， 野生型小鼠可以耐受以500μmol/kg体重(测试的最高剂量)输注的6β，7α THBA和以400μmol/kg体重(测试的最高剂量)输注的6α，7αTHBA，而没 有死亡。6β，7αTHBA(MTD＞500μmol/kg体重)和6α，7αTHBA(MTD＞400 μmol/kg体重)的最大耐受剂量若干倍高于UDC的最大耐受剂量。
在小鼠中，65μmol/kg体重的UDC是最大耐受剂量(MTD)，导致胆 汁流速类似于通过输注类似量的6β，7αTHBA或6α，7αTHBA所观测到的胆 汁流速。6β，7αTHBA或6α，7αTHBA的输注增加量导致和胆汁流速的增加 成正比(图12A、B)。
图8示出在输注(100μmol/kg)3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸以 前(A)和2-4分钟以后(B)，收集自野生型小鼠的胆汁部分(fractions)的 HPLC(高效液相色谱)分布。图8C示出在输注(100mmol/kg)胆酸以前(上迹 线)和2-4分钟以后(下迹线)，收集自野生型小鼠的胆汁部分的HPLC分布。
借助于Waters 600泵和控制器以及486UV检测器进行HPLC检测。 样品经过保护柱(Nova Pack，Waters)，用Spherisorb S5 ODS2 C-18(颗粒大 小5mm，250mm x 4mm，Waters)反相分析柱进行分离。利用Millennium 2010软件进行峰的积分。在0.6mL/分钟流速和3200psi下并在环境温度 下经48分钟分离胆汁盐对照。流动相包括溶剂A(MeOH)和溶剂B(60∶40 MeOH∶0.01M磷酸钾、0.02M磷酸钠(pH 5.35(改进自Rossi et al.1987 J Lipid Res 28(5)：589-95(71)；Hagey et al.1998.J Lipid Res 39(11)：2119-24， (72))。初始条件保持为100％B，时间为最初的25分钟。经紧接着的10 分钟，用线性梯度至30％B并且条件保持另外的5分钟。然后，经8分钟， 通过线性梯度，条件降低至100％A。用100％MeOH冲洗分析系统，然 后平衡返回到初始条件。在210nm下监测流出液。
为了可视化3α，6α，7α，12α-THBA，将4μl胆汁溶解于20ul甲醇，并注 入0.6mL/分钟的缓冲液流中，然后读取在210nm的波长下的吸光度。缓 冲液是60％甲醇，40％0.1M KH2PO4、0.02M NaH2PO4，pH5.35[65]。为 了可视化胆酸，初始程序与3α，6α，7α，12α-THBA相同，但在5分钟以后， 在4分钟内将缓冲液线性加大至20％甲醇∶80％缓冲液的混合物，再保持恒 定10分钟，然后在2分钟内线性加大至30％甲醇∶70％缓冲液，时间为运 行持续时间。
因而，四羟基-5β-胆烷-24-酸(3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸)可以 促进在野生型小鼠中的胆汁流动。如通过高效液相色谱(HPLC)所证明的， 在被输注入小鼠尾部静脉几分钟以后(图8A，B)，通过牛磺酸结合来体内 代谢3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸并分泌进入胆汁。这表明，这种胆 汁酸(3α，6α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷-24-酸)与动物原有的胆汁酸一样，通 过相同途径来代谢和脱毒，并经胆小管膜分泌。
实施例8：2α，3α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸和3α，4α，7α，12α-四羟基 -5β-胆烷酸的合成
从胆酸合成2α，3α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸，具体如下：
利用如在例如Tserng KY和Klein PD(1977)(74)、Leppik RA (1983)(75)、Iida T.et al.(1990)(76)或Iida T.et al.(1991)(77)中所描述的方 法，合成了另外的多羟基化胆汁酸。合成方案如下所示，其中化合物A是 2α，3α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸，化合物B是3α，4α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷 酸：
3α，4α，7α，12α-四羟基-5β-胆烷酸的一种可替换的合成方案如下：
参考文献
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其它实施方式
已参照一种或多种实施方式来描述了本发明。然而，本领域技术人员 将明了，可以进行若干变化和改进而不偏离如在权利要求中限定的本发明 的范围。因而，虽然本文披露了本发明的各种实施方式，但根据本领域技 术人员的常见的一般知识，在本发明的范围内，可以进行许多适应和改动。 上述改进包括替代本发明的任何方面的已知等效物，以用大致相同方式来 实现相同结果。数值范围包括限定范围的数值。在本说明书中，措辞“包 括(包含)”用作开放式术语，实质上相当于短语“包括但不限于”。本文 中参考文献的引用不应看作是承认这样的参考文献是本发明的现有技术。 所有出版物以引用方式结合于本文，就像每一单独的出版物被明确地单独 地指出来通过引用结合到本文中并且就像全部在本文中进行说明一样。本 发明包括基本上如上文所述的以及参照实施例和附图的所有实施方式和 变化。